賈永利 楊新明 張培楠 孟憲勇 胡長(zhǎng)波 陰彥林

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨外科，河北 張家口 075000

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是以滑膜炎為特征的慢性系統(tǒng)性疾病，隨著疾病的加重，可破壞關(guān)節(jié)軟骨、關(guān)節(jié)囊，導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和喪失功能[1]。目前治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎以減少患者活動(dòng)從而控制關(guān)節(jié)損傷、防止功能喪失，達(dá)到緩解疾病目的，但現(xiàn)實(shí)生活中很多患者無(wú)法做到減少活動(dòng)[2]，導(dǎo)致治療受到影響。豨薟草具有祛風(fēng)除濕、清熱解毒、抗炎鎮(zhèn)痛等功效，在臨床上應(yīng)用于關(guān)節(jié)疼痛、急性腸炎等治療，可緩解關(guān)節(jié)炎中炎癥因子水平，從而抑制疾病發(fā)展[3]，但具體機(jī)制尚不清楚。白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-23/輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17，Th17)介導(dǎo)的B細(xì)胞促炎性機(jī)制與關(guān)節(jié)炎關(guān)系密切，對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要[4]。但尚未發(fā)現(xiàn)豨薟草與IL-23/Th17的相關(guān)研究，推測(cè)豨薟草可能通過(guò)IL-23/Th17炎癥軸影響類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。因此，本研究擬通過(guò)建立膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠模型，采用豨薟草灌胃，探討豨薟草對(duì)CIA治療的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：40只雄性SD大鼠均購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)，6周齡，體重(205±10)g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)2019-0001，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(魯)2019-0005，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：NOD2019061327。所有大鼠均在河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，在溫度23 ℃～25 ℃、濕度50 %的環(huán)境中自由飲水、攝食暫養(yǎng)1周后，開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并通過(guò)，倫理審批號(hào)：2020-101479。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守3R原則。

1.1.2主要藥物、試劑與儀器：牛Ⅱ型膠原購(gòu)自美國(guó)Chondrex公司，批號(hào)：20021；冰醋酸、弗氏完全佐劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：L2880、F5881；豨薟草來(lái)自本院中藥房；IL-23重組質(zhì)粒由艾美捷科技有限公司合成；蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司，批號(hào)：G1120；大鼠IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購(gòu)自英國(guó)abcam公司，批號(hào)：ab119545、ab204522、ab222503、ab223857、ab100707；抗CD3-PE、抗CD8-FITC、PE-IL-17、PE-IgG1購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司，批號(hào)：22-0308-72、25-5273-42、210-17、25-4888-82；總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，批號(hào)：DP477；cDNA第一條鏈合成試劑盒購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司，批號(hào)：11102-C；熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司，批號(hào)：BTN12-284。DMM-400C型顯微鏡購(gòu)自上海蔡康光學(xué)儀器有限公司；Attune NxT型流式細(xì)胞儀、ProFlex?型實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time quantitative PCR，RT-qPCR)儀均購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1模型制備：將牛Ⅱ型膠原提前用冰醋酸溶解，4 ℃保存過(guò)夜備用。將豨薟草提前在40 ℃烘干后碾碎成粉，經(jīng)3號(hào)篩過(guò)濾后加入10倍水，在80 ℃水中浸泡30 min，提取2次，過(guò)濾后棄去濾渣，留濾液濃縮至100 mL，放置室溫后,2 000 r/min離心10 min，取上清液，質(zhì)量濃度調(diào)整為250 g/L備用。IL-23重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)純化并鑒定。將30只大鼠根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]建立CIA模型，弗氏完全佐劑：牛Ⅱ型膠原溶液=1∶1，在冰浴中充分乳化，配置成混合液，腹腔注射10 %水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉大鼠，在大鼠(右后趾、尾、背)部多點(diǎn)注射混合液，每只注射0.3 mL。另外10只大鼠作為陰性對(duì)照組，在相同部位注射等體積生理鹽水，14 d后進(jìn)行相同操作，再二次免疫3～7 d，模型大鼠足趾腫脹明顯，關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯增加，即為模型成功。模型成功后的大鼠按隨機(jī)數(shù)表法分為模型組、豨薟草組、豨薟草+IL-23組，每組10只。豨薟草組給予灌胃2 g/kg豨薟草提取物[6]，1次/d，連續(xù)灌胃7 d；豨薟草+IL-23組在給予灌胃2 g/kg豨薟草提取物的同時(shí)，經(jīng)尾靜脈注射IL-23重組質(zhì)粒，只在灌胃豨薟草提取物第1天時(shí)經(jīng)尾靜脈注射IL-23重組質(zhì)粒一次，豨薟草提取物灌胃1次/d，連續(xù)7 d；陰性對(duì)照組、模型組均灌胃等體積的生理鹽水和經(jīng)尾靜脈注射相同體積生理鹽水。

1.2.2樣本收集：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后觀察大鼠形態(tài)并稱量體質(zhì)量，檢測(cè)大鼠足趾腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血后，立即處死大鼠，取滑膜組織，部分置于40 g/L多聚甲醛中固定，部分置于- 80 ℃冰箱中保存。

1.2.3大鼠足趾腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)測(cè)定：運(yùn)用水容積法測(cè)定大鼠左后足的容積，即足趾腫脹度。大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)采用5級(jí)評(píng)分法[7]，根據(jù)關(guān)節(jié)紅腫、腫脹情況評(píng)定，0分：無(wú)紅腫、無(wú)異常；1分：趾關(guān)節(jié)紅腫；2分：趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹；3分：踝關(guān)節(jié)以下均腫脹但不變形；4分：踝關(guān)節(jié)及以下腫脹明顯，關(guān)節(jié)變形嚴(yán)重。大鼠所有關(guān)節(jié)炎指數(shù)之和即為每只大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)。

1.2.4HE染色檢測(cè)滑膜組織形態(tài)學(xué)情況：滑膜組織經(jīng)多聚甲醛固定過(guò)夜后，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，浸蠟，石蠟包埋，切片(厚度6 μm)。石蠟切片在90 ℃中烘箱中烘30 min，經(jīng)二甲苯脫蠟后放入乙醇中脫水，蒸餾水中洗滌，將蒸餾水洗滌過(guò)的切片移入蘇木精液中5～10 min，細(xì)胞核染色，自來(lái)水洗去切片上殘余染液，將切片放入1 %鹽酸乙醇液中褪色，切片變紅、顏色變淺即可，3～10 s，1 %氨水中反藍(lán)，蒸餾水浸片，經(jīng)0.5 %伊紅酒精溶液染色2～5 min、細(xì)胞質(zhì)染色，乙醇脫水、二甲苯透明，樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察并拍照保存。

1.2.5ELISA檢測(cè)大鼠IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量：將大鼠腹主動(dòng)脈血以3 000 r/min離心10 min，收集血清；滑膜組織加入9倍體積的等滲鹽水碾碎后以10 000 r/min離心20 min收集上清，96孔板包被緩沖液稀釋過(guò)的大鼠IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21抗體、4 ℃過(guò)夜，倒掉包被液，緩沖液清洗；通過(guò)樣品稀釋液稀釋IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，每孔加100 μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，室溫孵育2 h，洗板，每孔加入HRP標(biāo)記過(guò)的稀釋過(guò)的IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21單克隆抗體100 μL、室溫孵育1 h，洗板，每孔加樣品稀釋液稀釋過(guò)的酶、室溫孵育1.5 h，洗板，每孔加100 μL反應(yīng)底物、室溫避光反應(yīng)30 min，每孔加50 μL反應(yīng)終止液，450 nm處測(cè)定吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待檢樣品濃度。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞百分比：將2 mL腹主動(dòng)脈血經(jīng)肝素鈉抗凝后，通過(guò)密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞；將滑膜組織剪碎，用RPMI-1640培養(yǎng)液將滑膜組織制成懸液，均將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)/mL。加入刺激劑后，加入抗CD3-PE、抗CD8-FITC，溶血，破膜通透，加入PE-IL-17及同型對(duì)照PE-IgG1，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17細(xì)胞百分比。

1.2.7RT-qPCR檢測(cè)IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平：將腹主動(dòng)脈血、滑膜組織分別提取總RNA，cDNA第一條鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，β-actin作為內(nèi)參基因，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。RT-qPCR上樣體系20 μL，包括cDNA(50 ng/μL)1 μL、正向引物/反向引物(均為10 μmol/L)0.5 μL /0.5 μL、2×SYBR qPCR Mix 10 μL、ddH2O 8 μL；反應(yīng)條件包括94 ℃、60 s；95 ℃、30 s(IL-23 58 ℃ 30 s、IL-17 58 ℃ 30 s、IL-6 56 ℃ 40 s、IL-22 61 ℃ 35 s、IL-21 59 ℃ 40 s)，40個(gè)循環(huán)。通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21相對(duì)表達(dá)水平。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠體質(zhì)量比較

模型組大鼠出現(xiàn)食欲不振、困倦癥狀；豨薟草組大鼠上述癥狀有所緩解。與陰性對(duì)照組[(347.45±15.49)g]相比，模型組[(275.95±14.51)g]大鼠體質(zhì)量降低(P<0.05)；與模型組相比，豨薟草組[(315.44±22.19)g]大鼠體質(zhì)量升高(P<0.05)；與豨薟草組相比，豨薟草+IL-23組[(286.18±21.47)g]大鼠體質(zhì)量降低(P<0.05)。

2.2 四組大鼠足趾腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)的比較

造模成功率為100%。與陰性對(duì)照組相比，模型組大鼠足趾腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)升高(P<0.05)；與模型組相比，豨薟草組大鼠足趾腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)降低(P<0.05)；與豨薟草組相比，豨薟草+IL-23組大鼠足趾腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 四組大鼠足趾腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)的比較

2.3 四組大鼠滑膜組織形態(tài)學(xué)情況

陰性對(duì)照組滑膜細(xì)胞排列整齊、疏松，滑膜細(xì)胞間膠原間質(zhì)明顯，無(wú)炎癥浸潤(rùn)現(xiàn)象；模型組細(xì)胞排列紊亂、無(wú)規(guī)律可循，炎癥現(xiàn)象明顯，成纖維細(xì)胞增生明顯，可觀察到炎癥、纖維蛋白滲出物；豨薟草組滑膜細(xì)胞重新出現(xiàn)膠原間質(zhì)，炎癥現(xiàn)象明顯減少；豨薟草+IL-23組相較于豨薟草組有炎癥細(xì)胞增多趨勢(shì)。見(jiàn)圖1。

圖1 四組大鼠滑膜組織形態(tài)學(xué)情況(標(biāo)尺：200 μm)Fig.1 Histomorphology of synovial membrane of rats in 4 groups (scale: 200 μm)

2.4 四組大鼠腹主動(dòng)脈血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17細(xì)胞百分比比較

與陰性對(duì)照組相比，模型組大鼠腹主動(dòng)脈血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17細(xì)胞百分比升高(P<0.05)；與模型組相比，豨薟草組大鼠腹主動(dòng)脈血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17細(xì)胞百分比降低(P<0.05)；與豨薟草組相比，豨薟草+IL-23組大鼠腹主動(dòng)脈血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17細(xì)胞百分比升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 四組大鼠腹主動(dòng)脈血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17細(xì)胞百分比比較

2.5 四組大鼠滑膜組織中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17細(xì)胞百分比比較

與陰性對(duì)照組相比，模型組大鼠滑膜組織中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17細(xì)胞百分比升高(P<0.05)；與模型組相比，豨薟草組大鼠滑膜組織中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17細(xì)胞百分比降低(P<0.05)；與豨薟草組相比，豨薟草+IL-23組大鼠滑膜組織中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17細(xì)胞百分比升高(P<0.05)。見(jiàn)表4。

2.6 四組大鼠腹主動(dòng)脈血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平比較

與陰性對(duì)照組相比，模型組大鼠腹主動(dòng)脈血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平升高(P<0.05)；與模型組相比，豨薟草組大鼠腹主動(dòng)脈血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平降低(P<0.05)；與豨薟草組相比，豨薟草+IL-23組大鼠腹主動(dòng)脈血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平升高(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表4 四組大鼠滑膜組織中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17細(xì)胞百分比比較

表5 四組大鼠腹主動(dòng)脈血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平比較

2.7 四組大鼠滑膜組織中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平比較

與陰性對(duì)照組相比，模型組大鼠滑膜組織中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平升高(P<0.05)；與模型組相比，豨薟草組大鼠滑膜組織中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平降低(P<0.05)；與豨薟草組相比，豨薟草+IL-23組大鼠滑膜組織中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平升高(P<0.05)。見(jiàn)表6。

表6 四組大鼠滑膜組織中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平比較

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬自身免疫疾病，病理表現(xiàn)為滑膜炎，炎癥刺激可導(dǎo)致骨質(zhì)吸收和骨形成平衡被打破，從而導(dǎo)致骨和軟骨被破壞，大量炎癥細(xì)胞因子參與骨質(zhì)丟失過(guò)程[8]。在CIA模型中關(guān)節(jié)腫脹、滑膜組織增生、部分組織缺氧、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞異常增生導(dǎo)致軟骨侵蝕、骨骼破壞現(xiàn)象[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠出現(xiàn)食欲不振、困倦癥狀，且大鼠體質(zhì)量下降，提示CIA影響大鼠食欲、體重、精神狀態(tài)；足趾腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)升高，提示大鼠足趾、關(guān)節(jié)炎癥嚴(yán)重，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生；進(jìn)一步HE染色發(fā)現(xiàn)滑膜組織中細(xì)胞排列紊亂、炎癥現(xiàn)象明顯，成纖維細(xì)胞增生明顯，可觀察到炎癥、纖維蛋白滲出物，提示大量炎癥現(xiàn)象導(dǎo)致骨和軟骨破壞、骨質(zhì)丟失，成纖維細(xì)胞增生明顯導(dǎo)致滑膜增生與凋亡失衡，細(xì)胞因子失衡導(dǎo)致病變持續(xù)進(jìn)展。在治療上西醫(yī)采用抗炎鎮(zhèn)痛、關(guān)節(jié)內(nèi)注射玻璃透明質(zhì)酸或糖皮質(zhì)激素、全關(guān)節(jié)置換術(shù)等，但近期及遠(yuǎn)期療效欠佳，未能從根本上緩解疾病。而中醫(yī)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的治療表現(xiàn)出了優(yōu)勢(shì)[10]。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)痹癥范疇，《素問(wèn)·痹論》云：“黃帝問(wèn)曰：痹癥安生？岐伯對(duì)曰：風(fēng)寒濕三氣雜至，合而成痹也”，且古代醫(yī)者認(rèn)為外邪侵襲、三焦阻滯，肺腑虧虛、三焦氣化失常，濕氣均為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的主要機(jī)制，因此治療上以汗而發(fā)之，利其小便，溫陽(yáng)化氣、調(diào)補(bǔ)腎脾肺[11]。豨薟草性味歸經(jīng)，歸肝、腎經(jīng)，具有行痹止痛、郁而化熱之功效[12]，在臨床上能夠降低活性氧和抑制氧化應(yīng)激從而減輕炎癥通路表達(dá)，通過(guò)抗氧化、抗炎作用用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，豨薟草組食欲不振、困倦有所緩解、體質(zhì)量升高，足趾腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)下降，滑膜組織中炎癥浸潤(rùn)現(xiàn)象、成纖維細(xì)胞增生現(xiàn)象得以緩解，提示豨薟草可能通過(guò)減輕炎癥現(xiàn)象、緩解成纖維細(xì)胞增生現(xiàn)象從而行痹止痛、郁而化熱，達(dá)到緩解足趾腫脹、關(guān)節(jié)炎癥狀，從而達(dá)到治療疾病目的。

IL-6、IL-23可刺激T細(xì)胞上特定結(jié)合受體，誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分化為高致病性的Th17[14]。Th17作為輔助T細(xì)胞，可分泌IL-17、IL-22、IL-21等促炎因子，在自身免疫疾病發(fā)生中起重要作用[15]。其中IL-17作為T細(xì)胞誘導(dǎo)的最早啟動(dòng)因子，可促進(jìn)前炎性因子的釋放進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥因子水平增加，可介導(dǎo)中性粒細(xì)胞誘發(fā)滑膜炎癥反應(yīng)[16]；而刺激IL-17表達(dá)后又可影響多條信號(hào)通路促進(jìn)T細(xì)胞和上皮細(xì)胞激活，從而產(chǎn)生更多的IL-6、IL-23等炎癥因子[17]。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中IL-23、IL-17、IL-6、IL-1、IL-33水平升高，且與疾病嚴(yán)重程度、臨床癥狀評(píng)分關(guān)系密切，可將炎癥因子作為診斷、評(píng)估疾病和治療的標(biāo)志[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組相比，模型組腹主動(dòng)脈血、滑膜組織中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量和mRNA水平以及Th17百分比均升高，提示在CIA血液和滑膜組織中機(jī)體處于紊亂狀態(tài)，IL-6、IL-23處于激活狀態(tài)可刺激Th17分化，促進(jìn)IL-17分泌，而IL17作為前促炎因子促進(jìn)促炎因子IL-22、IL-21等釋放；同時(shí)IL-17亦可促進(jìn)IL-6、IL-23的分泌，從而促進(jìn)IL-23/Th17過(guò)程，級(jí)聯(lián)放大促進(jìn)滑膜組織炎癥，加速疾病進(jìn)程。與模型組相比，豨薟草可抑制IL-23/Th17過(guò)程，從而減輕炎癥反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的緩解。而在豨薟草基礎(chǔ)上添加IL-23重組質(zhì)?？赡孓D(zhuǎn)豨薟草對(duì)疾病的緩解作用，提示豨薟草在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中是通過(guò)抑制IL-23/Th17炎癥軸進(jìn)而緩解疾病。

綜上所述，豨薟草可通過(guò)抑制IL-23/Th17炎癥軸從而抑制炎癥反應(yīng)，起到對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療作用。但中藥豨薟草成分復(fù)雜，亦可能通過(guò)其他信號(hào)通路發(fā)揮作用，對(duì)于這方面有待開(kāi)展進(jìn)一步的研究、探索。