王小強(qiáng) 謝興文 徐世紅 李鼎鵬 姜朝陽(yáng) 柳博 張旭明

1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 7300002. 甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030 3. 西北民族大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030 4. 甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是由于骨關(guān)系失穩(wěn)所引起的系統(tǒng)性骨重塑疾病，骨質(zhì)疏松是骨折的常見(jiàn)危險(xiǎn)因素，給老年人帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)壓力和負(fù)擔(dān)。骨質(zhì)疏松癥具有骨密度低、骨骼脆性高的特點(diǎn)[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，在中國(guó)，截止到2016年，50歲以上人群的患病率已接近40%，在疾病譜中緊隨心血管發(fā)病率之后，位居第二[2]。雙能X線骨密度儀(DXA)與骨折風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估(FRAX)工具相結(jié)合，可有效地診斷骨質(zhì)疏松癥[3]。到目前為止，骨質(zhì)疏松癥的治療仍然有限。治療骨質(zhì)疏松癥的藥物包括選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERMs)、鈣劑、雙膦酸鹽、維生素D3、甲狀旁腺素(PTH)類似物等。然而，長(zhǎng)期使用這些藥物會(huì)帶來(lái)安全風(fēng)險(xiǎn)，包括多種疾病的發(fā)生，例如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、心血管疾病和靜脈血栓栓塞[4]等。

骨質(zhì)疏松癥最易引起松質(zhì)骨與密質(zhì)骨交界部位的骨折。到目前為止，通過(guò)對(duì)參與骨折愈合的幾個(gè)主要調(diào)控因子的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[5]，血管生成被認(rèn)為在骨代謝[6]中有重要作用。血管生成過(guò)程涉及內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移、毛細(xì)血管的形成和MSCs(間充質(zhì)干細(xì)胞)[7]的穩(wěn)定等4個(gè)過(guò)程。已有研究[8]表明，MSCs移植對(duì)多種疾病模型均有治療作用，包括促進(jìn)成骨和血管生成，通過(guò)促進(jìn)血管生成和成骨細(xì)胞可有效調(diào)整骨平衡，而在此調(diào)節(jié)過(guò)程中，外泌體發(fā)揮著重要作用[9]。

1 外泌體的現(xiàn)代研究

胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是由細(xì)胞釋放到細(xì)胞外環(huán)境的多種膜囊泡組成，參與細(xì)胞間通信[10]。EVs主要有三種亞型:外泌體(exosomes)、微泡(microves)、泡囊(MVs)和凋亡小體(apoptosis bodies)，它們根據(jù)大小、功能、含量、生物發(fā)生和釋放途徑表現(xiàn)出不同的特征[11-12]。外泌體是EVs的一種亞型，幾乎所有的細(xì)胞都能分泌外泌體，外泌體通過(guò)內(nèi)泌體途徑形成。外泌體又是多泡體，它的直徑通常為30～150 nm，常被包裹在單一的外膜內(nèi)，通過(guò)與質(zhì)膜融合釋放到細(xì)胞外空間，同時(shí)保護(hù)其內(nèi)容物不被降解。外泌體因其參與細(xì)胞因子、mRNA、miRNAs和蛋白質(zhì)等生化物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而通過(guò)遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移在細(xì)胞間通信中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。值得注意的是，外泌體的特定表面配體確保它與靶細(xì)胞結(jié)合并傳遞其內(nèi)容物，最終調(diào)節(jié)特定的生物學(xué)功能。

外泌體起源于內(nèi)泌體，儲(chǔ)存在多泡體(MVBs)中，通過(guò)與細(xì)胞膜融合釋放到環(huán)境中[14]。外泌體可以從培養(yǎng)細(xì)胞中分離出來(lái)，并在體內(nèi)輸送到靶向疾病。因此，一旦其特性和生物學(xué)得到更好的描述，外泌體就具有治療應(yīng)用的潛力。外泌體中含有大量的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，以及以DNA、mRNA、miRNAs和非編碼RNA形式存在的核酸物質(zhì)，因此，外泌體可被細(xì)胞作為排泄無(wú)用或有害RNA和蛋白質(zhì)的主要途徑。更重要的是，作為向其他細(xì)胞傳遞重要信號(hào)的信使和載體，修改其在正常生理和疾病狀態(tài)下的功能[15]。

外泌體作用廣泛，已被用于多種臨床研究。研究表明[16]，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(HucMSCs)衍生外泌體可以減輕大鼠肝臟缺血再灌注損傷。來(lái)自干細(xì)胞的外泌體可以通過(guò)抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和促進(jìn)自噬來(lái)促進(jìn)脊髓損傷后的功能恢復(fù)[17]。Bian S[18]等發(fā)現(xiàn)MSCs-Exo(間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體)可以促進(jìn)心肌梗死模型中的血管生成。同樣，Ono M[19]等發(fā)現(xiàn)，MSCs-Exo處理細(xì)胞后，miR-23b上調(diào)，從而通過(guò)抑制靶基因標(biāo)記誘導(dǎo)休眠。抑制標(biāo)記最終促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的休眠。Huang L[20]研究表明，MSCs-Exo具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的分泌，從而誘導(dǎo)心臟再生、促進(jìn)血管生成以發(fā)揮改善心臟功能的作用；除此之外，MSCs-Exo還具有抗細(xì)胞凋亡、減少心肌梗死面積、改善左心室射血分?jǐn)?shù)和逆轉(zhuǎn)慢性心肌梗死后的重塑、抗炎、抗血管重塑的作用。

2 外泌體中的miRNAs

最近的研究集中于外泌體內(nèi)容物之一miRNAs，已有研究[21]證明外泌體miRNAs可以對(duì)靶細(xì)胞發(fā)揮調(diào)控作用，這是一種新的細(xì)胞內(nèi)信息交流方式。miRNAs是一種包含有22～25個(gè)核苷酸的小非編碼RNA。越來(lái)越多研究表明[22]，miRNAs可介導(dǎo)多種病理生理過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡。

miRNAs通過(guò)介導(dǎo)信號(hào)通路可治療多種疾病，Liu W[23]等證明了活化的HucMSCs釋放的mir-126富集外泌體，通過(guò)抑制芽狀突起相關(guān)的結(jié)構(gòu)域包含蛋白1的活性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管生成和遷移，從而激活信號(hào)通路，可促進(jìn)骨折愈合。在Sun XH[24]等的研究中，發(fā)現(xiàn)MSCs-Exo對(duì)心肌細(xì)胞凋亡有顯著保護(hù)作用。MSCs-Exo的miR-486-5p抑制心肌細(xì)胞中PTEN(抑癌基因)的表達(dá)，激活PI3K/Akt(一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶)信號(hào)通路，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡和心肌缺血損傷。Pakravan K[25]等發(fā)現(xiàn)，MSCs中轉(zhuǎn)染miR-100能夠通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)軸下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)的表達(dá)，研究結(jié)果支持了外泌體miRNAs可能以旁分泌方式改變?nèi)橄侔┘?xì)胞功能的觀點(diǎn)。Zhang L[26]等指出，含有miR-22-3p的pMφ(腹腔巨噬細(xì)胞)外泌體降低了SIRT1(哺乳動(dòng)物細(xì)胞SIRT1)的表達(dá)，上調(diào)了NF-κB(一種蛋白質(zhì)復(fù)合物，其控制轉(zhuǎn)錄的DNA)的表達(dá)，提示miR-22-3p可能通過(guò)SIRT1/NF-κB通路參與EMS(子宮內(nèi)膜異位癥)，miR-22-3p和SIRT1/NF-κB通路可能作為治療EMS的新靶點(diǎn)。

既往研究表明[27]，miRNAs是重要的骨密度調(diào)節(jié)因子，在骨代謝過(guò)程中調(diào)控骨形成、重構(gòu)、吸收和細(xì)胞分化。例如，miR-140-3p和miR-23b-3p被用作絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)疏松性骨折的潛在生物標(biāo)志物。在另一項(xiàng)研究中[28]，miR-221通過(guò)影響成骨細(xì)胞分化參與骨質(zhì)疏松癥的調(diào)控。miRNAs已被鑒定為在分化和發(fā)育等生物過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。大量研究與骨質(zhì)疏松癥中骨組織和循環(huán)生物液中miRNAs表達(dá)失調(diào)有關(guān)[29]。這些研究表明[30]，miRNAs參與了骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制，其治療潛力應(yīng)被考慮，因?yàn)樗鼈冊(cè)诠欠€(wěn)態(tài)中能夠調(diào)節(jié)多種細(xì)胞。因此，確定調(diào)控骨質(zhì)疏松癥的重要miRNAs，介導(dǎo)相對(duì)應(yīng)的信號(hào)通路，有助于尋找治療骨質(zhì)疏松癥的新靶點(diǎn)。

3 Wnt信號(hào)通路正向調(diào)節(jié)miRNAs

骨質(zhì)疏松癥的治療目標(biāo)是增加皮質(zhì)骨和小梁骨的質(zhì)量，并充分改善其微觀結(jié)構(gòu)，以預(yù)防椎體和非椎體脆性骨折，這可以通過(guò)抑制骨吸收和刺激骨形成來(lái)實(shí)現(xiàn)。大多數(shù)抗骨再吸收藥物(如雙膦酸鹽)降低了骨重塑活性，進(jìn)而降低了骨形成，是治療時(shí)出現(xiàn)的一個(gè)不太理想的副作用[31]。因此尋找能夠直接或間接促進(jìn)骨形成的藥物，即骨合成代謝療法應(yīng)運(yùn)而生。原則上，合成代謝療法可以在重塑過(guò)程中促進(jìn)骨形成、通過(guò)內(nèi)襯細(xì)胞直接刺激骨形成。骨合成代謝的定義是它們?cè)黾恿斯切纬傻哪芰?，通過(guò)生物化學(xué)標(biāo)志物如1型氨基末端前肽前膠原(P1NP)或骨骼特異性堿性磷酸酶(BSAP)和組織形態(tài)學(xué)參數(shù)(礦物附著率，MAR和骨形成率，BFR)在骨活檢上進(jìn)行測(cè)量。目前，已經(jīng)確定了兩種主要的骨合成通路:甲狀旁腺素(PTH)信號(hào)通路和典型Wnt(cWnt)信號(hào)通路。Wnt信號(hào)通路是骨密度的主要調(diào)節(jié)因子，而甲狀旁腺素對(duì)其骨關(guān)系的調(diào)節(jié)是通過(guò)RANKL(核因子κB受體活化因子受體)產(chǎn)生破骨細(xì)胞所形成的，這可能是調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)、治療骨科相關(guān)疾病的另一潛在靶點(diǎn)[32]。

Int-1是1984年發(fā)現(xiàn)的一種致癌基因，與小鼠的乳腺癌發(fā)病有關(guān)[33]。1976年[34]研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)無(wú)翅果蠅同源基因片段極性基因。這個(gè)同源物被發(fā)現(xiàn)與int-1相同，因此Wnt(wingless-related MMTV integration site)被命名為wingless和int-1[35]。隨后，Wnt受體，一種低密度脂蛋白相關(guān)受體5(low-density lipoprotein-related receptor 5,LRP5)，在2001年被證明參與了骨量調(diào)控，Wnt信號(hào)通路受到了廣泛關(guān)注，其功能開(kāi)始被大力研究[36]。成骨細(xì)胞產(chǎn)生骨基質(zhì)蛋白，其總壽命為2～3個(gè)月。它們最終會(huì)凋亡，停留在骨表面作為骨內(nèi)襯細(xì)胞，嵌入自分泌的骨基質(zhì)蛋白中，或分化為骨細(xì)胞[37]。成骨細(xì)胞來(lái)源于未分化的間充質(zhì)細(xì)胞，間充質(zhì)細(xì)胞也分化為軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。祖細(xì)胞向組織特異性細(xì)胞的分化受到組織特異性轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。在確定細(xì)胞分化之前，Wnt蛋白抑制成骨前體細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化；此外，通過(guò)基因敲除和轉(zhuǎn)基因小鼠的進(jìn)一步闡明了促成骨的轉(zhuǎn)化，研究發(fā)現(xiàn)Wnt抑制了間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞自身的分化，從而促進(jìn)了骨生成和增加骨量，Wnt通路的激活促進(jìn)成骨的轉(zhuǎn)化[38]。這些結(jié)果表明，典型的Wnt通路在間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中至關(guān)重要。

Wnt通路促進(jìn)了間充質(zhì)干細(xì)胞分化，骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞是可靠的外泌體生產(chǎn)者，Wnt通路的這一促進(jìn)作用保證了外泌體的廣泛來(lái)源，而MSCs-Exo可作為基于小分子RNA的體外和體內(nèi)治療的合適納米載體。橫向看這一過(guò)程，筆者認(rèn)為，Wnt通路通過(guò)促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞分化，正向調(diào)節(jié)了外泌體內(nèi)容物之一miRNAs的產(chǎn)生。

4 Wnt通路與miRNAs治療骨質(zhì)疏松癥

研究表明[39]，表達(dá)miR-409-5p可抑制成骨細(xì)胞分化，而通過(guò)抗miR-409阻斷miR-409-5p的表達(dá)可促進(jìn)成骨細(xì)胞功能和基質(zhì)礦化。通過(guò)表達(dá)miR-409-5p，可以觀察到典型的Wnt/βcatenin信號(hào)通路受到抑制。在切除卵巢的雌激素缺陷小鼠中，miR-409-5p的沉默可以恢復(fù)骨小梁微結(jié)構(gòu)的喪失并抑制骨吸收。因此，靶向miR-409-5p可能有助于增加絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥等情況下的骨密度。某些miRNAs已被鑒定與Wnt信號(hào)分子相互作用來(lái)調(diào)節(jié)成骨。Liu TJ[40]等發(fā)現(xiàn)miR-141過(guò)表達(dá)顯著上調(diào)了去卵巢誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠下頜骨中Wnt2和β-catenin的表達(dá)。為了進(jìn)一步探討miR-141對(duì)Wnt/βcatenin通路的影響，通過(guò)使用Wnt激動(dòng)劑重組DKK2蛋白和Wnt抑制劑重組人內(nèi)皮抑制素。結(jié)果表明，在去卵巢誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠下頜骨中，miR-141過(guò)表達(dá)可激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路[39]。

Li L[41]等的研究證實(shí)，隨著成骨細(xì)胞分化的進(jìn)展，MC3T3-E1(小鼠胚胎成骨細(xì)胞)細(xì)胞SP1(轉(zhuǎn)錄因子)表達(dá)下調(diào)。典型的Wnt信號(hào)通路即Wnt/b-catenin通路已被證實(shí)在調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。值得注意的是，激活該通路有助于成骨分化，而抑制該通路則會(huì)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化。本文也證實(shí)了分化成骨細(xì)胞中Wnt/b-catenin信號(hào)通路被明顯激活，miR-545-3p通過(guò)抑制該通路限制成骨細(xì)胞分化。更重要的是，解釋了miR-545-3p對(duì)Wnt/bcatenin通路的抑制作用是由LRP5介導(dǎo)的。miRNAs通過(guò)參與激活Wnt信號(hào)通路促進(jìn)MSCs的成骨分化，抑制MSCs向成軟骨、成脂肪譜系分化，阻止成熟成骨細(xì)胞凋亡，抑制破骨細(xì)胞分化，可預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[42]。

5 總結(jié)與展望

本文發(fā)現(xiàn)miRNAs參與了多種信號(hào)通路，包括Wnt、MAPK、Hippo通路等。激活Wnt信號(hào)通路可促進(jìn)MSCs的成骨分化，激活MAPK信號(hào)通路可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，維持成熟成骨細(xì)胞的存活，抑制破骨細(xì)胞的分化[43]。Hippo信號(hào)通路可維持骨質(zhì)疏松癥[44]患者M(jìn)SCs存活。這些研究表明，miRNAs通過(guò)調(diào)控Wnt、MAPK、Hippo等信號(hào)通路在骨質(zhì)疏松癥中發(fā)揮重要作用。LRP5作為Wnt蛋白的輔助受體，是公認(rèn)的Wnt/b-catenin信號(hào)的激活因子。LRP5在骨形成中的正向調(diào)節(jié)作用也已被證實(shí)[45]。筆者認(rèn)為，在LRP5激活Wnt/b-catenin信號(hào)的同時(shí)，以某種方式將其與miRNAs、血管生成這三者相結(jié)合起來(lái)應(yīng)用于臨床，可能會(huì)成為治療骨質(zhì)疏松癥的一種新思路。