郭 潔，樊竹青，趙利坤，李沂韋

普洱學(xué)院 云南省高校亞熱帶藥用食用生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 普洱 665000

桉樹是桃金娘科（Myrtaceae）桉屬（Eucalyptus）植物的統(tǒng)稱，常綠高大喬木，具有藥用、經(jīng)濟(jì)等多種價(jià)值。桉樹的種植對我國很多地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展做出了貢獻(xiàn)，同時對周邊生態(tài)環(huán)境也帶來很大負(fù)面影響。桉樹被稱為土壤的“抽水機(jī)”和“抽肥機(jī)”，長期種植會造成土壤貧瘠、生態(tài)物種單一、威脅其他的生物生長，降低了生物多樣性。桉樹人工林取代次生林降低了植物物種豐富度和表面覆蓋率，顯著降低了土壤微生物群落功能[1]。

土壤根際微生物物種多樣性是評價(jià)土壤生態(tài)系統(tǒng)健康程度的重要指標(biāo)，土壤微生物物種越豐富，生態(tài)系統(tǒng)對外界破壞的抵抗能力和自我修復(fù)能力就越強(qiáng)，生態(tài)系統(tǒng)就越穩(wěn)定。據(jù)相關(guān)調(diào)查顯示，覃玉球[2]在《桉樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及對生態(tài)環(huán)境的影響分析》一文中提到大規(guī)模種植桉樹之后，桉樹林生態(tài)系統(tǒng)中很多生物的種類均有下降。我國學(xué)者對廣西地區(qū)桉樹林中的植物分布進(jìn)行了調(diào)查，其結(jié)果表明桉樹林中草本植物和蕨類植物的種類和數(shù)量都隨著桉樹林樹齡的增加呈緩慢下降的趨勢。

目前，國內(nèi)外對于桉樹的研究比較系統(tǒng)全面，主要研究方向集中在桉樹的栽培繁殖技術(shù)、病蟲害管理防治、土壤的理化性質(zhì)、生態(tài)及生物多樣性等，對于桉樹根際土壤真菌多樣性的研究不多見[3]。本研究以云南景谷地區(qū)不同海拔人工桉樹林地根際土壤作為研究對象，采用高通量測序方法，對土壤樣品進(jìn)行DNA提取、擴(kuò)增、測序及數(shù)據(jù)處理，分析不同海拔桉樹林根際土壤真菌群落多樣性、群落組成和豐富度情況，以期為景谷當(dāng)?shù)亻L期種植桉樹造成的生態(tài)效應(yīng)修復(fù)提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 研究地概況

本次研究樣地位于云南普洱景谷縣（東經(jīng)100°02′～101°07′、北緯22°49′`23°52′）。景谷縣位于回歸線附近，屬于南亞熱帶地區(qū)，地勢以山地高原為主，海拔在600m～2 920m之間，年降水量為1 354mm、平均雨日數(shù)164.1d、平均氣溫22.1℃，年平均日照時數(shù)2 065.3h。景谷縣林業(yè)用地有874.9萬畝，占總面積的77.5%，桉樹就是景谷地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)林。

1.2 樣品采集及處理

樣品采于2022年1月，在研究樣地內(nèi)，土壤樣品采自景谷縣內(nèi)的人工桉樹林根際土壤，在向陽坡面設(shè)置兩個不同海拔梯度，A1（1 056m），A2（1 156m），在每個海拔隨機(jī)選取5個25m×25m樣方，每個樣方內(nèi)選用“五點(diǎn)”采樣法采樣，去除表層土壤，取5-10cm深的桉樹根際土樣，將五個小點(diǎn)的土樣混合為一個土樣，最后將5個樣方的土樣混合，按四分法土樣作為實(shí)驗(yàn)樣品，總共取得2個實(shí)驗(yàn)樣品，分別封入無菌塑封袋并置于4℃冰盒中，立即將樣品送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步處理[4]。

1.3 土壤真菌DNA提取和測序

1.3.1 土壤真菌DNA提取PCR擴(kuò)增16srRNA基因

根據(jù)E.Z.N.a.土壤DNA試劑盒（Omega，美國）進(jìn)行土壤微生物總基因組DNA提取，為了確保提取過程中得到足夠數(shù)量和高質(zhì)量的基因組DNA，使用Quabit 2.0（美國life）測量DNA濃度。對微生物ITS1-ITS2高變區(qū)進(jìn)行itsS rRNA基因的提取，PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增子PCR正向引物為：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；反向引物為：GCTGCGTTCTTCATCGATGC。提取的DNA2ul（10ng/μl），擴(kuò)增子正反向引物各1ul（10uM），進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)征程序如下：95℃三分鐘變性1個周期，95℃30秒變性5個周期，45℃下退火30S，72℃下延伸30S，95℃下變性20個周期30S，55℃下退火30S，72℃下延伸30S，72℃下最終延伸5分鐘。在TBE緩沖液中，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物，用溴化乙錠（EB）染色，在紫外光下觀察[5-6]。

1.3.2 ITS基因文庫的構(gòu)建、量化和測序

該階段由生工生物公司（上海）完成。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將測序得到的PE reads先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，區(qū)分樣本后對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，然后進(jìn)行OTU聚類（ASV去噪）分析和物種分類學(xué)分析。基于OTU聚類（ASV去噪）分析結(jié)果，對OTU（ASV)進(jìn)行多樣性指數(shù)分析，在各個分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桉樹根際土壤真菌測序結(jié)果

對采集的兩個不同海拔人工桉樹林根際土壤樣品進(jìn)行測序，按照97%相似性對非重復(fù)序列（不含單序列）進(jìn)行OTU聚類，將所有優(yōu)化序列比對至OTU代表序列，選出與代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格，結(jié)果見表1。

表1 不同海拔人工桉樹林根際土壤真菌OTU測序結(jié)果

2.2 桉樹根際土壤真菌OTU結(jié)果分析

以O(shè)TU水平為例對兩個樣品進(jìn)行處理后，繪制Venn圖（圖1），共統(tǒng)計(jì)出人工桉樹林下兩個土壤樣品共有761個OTUs，由圖1可知兩個樣品包含的OTU數(shù)目分別為A1樣品465個，A2樣品553個，A2樣品OTUs數(shù)目相對多。257個OTUs為兩個樣品共有，每個樣品都有接近50%的OTUs相同，樣品1和2的真菌群落組成和重疊量有一半相同。

圖1 不同海拔人工桉樹林根際土壤真菌OTU韋恩圖

2.3 桉樹根際土壤真菌相對豐富度分析

為了研究桉樹林下土壤中真菌的物種組成和多樣性，進(jìn)行OTU聚類分析，根據(jù)OTU聚類分析，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析方法，以縱坐標(biāo)為桉樹根際真菌相對豐度值，測A1、A2樣本在不同分類水平上的群落結(jié)構(gòu)和所占比例得出相應(yīng)數(shù)據(jù)和圖表（圖2、表2）。由圖2可知，兩個樣品經(jīng)測序后共統(tǒng)計(jì)得到3個門類的真菌群落，不包含其他未統(tǒng)計(jì)的門類（樣本中豐度占比均小于一定比例1%的物種歸為其他）。林忠鑫[5]等人從不同連載代次桉樹人工林土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究中共統(tǒng)計(jì)得到真菌門類為11門，物種差距可能是由于樣品采集季節(jié)和數(shù)量不一樣導(dǎo)致。A2樣品物種和數(shù)量較A1相對均衡。根據(jù)表2可知，A1樣品的優(yōu)勢門類真菌為子囊菌門，占整個A1樣品中總真菌群落豐富度的86.2%，A2樣品的子囊菌門占33.7%，A1樣品顯著高于A2樣品。A2樣品的優(yōu)勢門類真菌為擔(dān)子菌門，占A2樣品總真菌群落豐富度的37.96%，而A1樣品擔(dān)子菌門占比為12.25%，A2樣品的擔(dān)子菌門顯著高于A1樣品。通過以上數(shù)據(jù)得知，子囊菌門和擔(dān)子菌門為人工桉樹林根際土壤真菌群落的優(yōu)勢物種。不同的海拔梯度，其優(yōu)勢物種的數(shù)量和豐富度不一樣。

圖2 不同海拔梯度桉樹林下土壤真菌相對豐度柱狀圖

表2 不同海拔梯度桉樹林下土壤真菌主要菌門相對豐度統(tǒng)計(jì)表

2.4 不同海拔梯度桉樹林下根際土壤真菌系統(tǒng)組成樹狀圖

根據(jù)兩個樣本的分類學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行比對，對優(yōu)勢門類進(jìn)行分類，對優(yōu)勢真菌群落進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系和豐富度差異分析，構(gòu)建真菌系統(tǒng)組成樹狀圖，具體結(jié)果見圖3、圖4。由圖可知，A2樣品的親緣分類較A1樣品更豐富，A2樣品第一親緣關(guān)系有三個分支，三個分支的均勻度相對平均，A1樣品為兩個分支，兩個分支均勻度不一，由此可知，A2樣品的真菌群落較A1樣品的真菌群落豐富度和物種較平均。

圖3 海拔1056m樣品A1真菌群落組成樹狀圖

圖4 海拔1156m樣品A2真菌群落組成樹狀圖

2.5 不同海拔梯度桉樹林下根際土壤Alpha多樣性

不同的海拔梯度模式會顯著影響桉樹人工林根際土壤真菌群落的多樣性和豐富度（P＜0.01，表3）。Chao指數(shù)和Ace指數(shù)均為A2樣品高于A1樣品，說明海拔越高土壤中真菌豐富度越高（表3）。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映土壤微生物的群落物種分布多樣性，A2樣品的Shannon指數(shù)為3.83，高于A1樣品的1.60，A2樣品的Simpson指數(shù)為0.07低于A1樣品0.54，兩個指數(shù)表現(xiàn)有差異。

表3 不同海拔梯度桉樹林下根際土壤真菌各樣本多樣性指數(shù)結(jié)果

3 討論

通過對云南景谷地區(qū)不同海拔梯度人工桉樹林下根際土壤進(jìn)行高通量測序和相關(guān)性分析，對兩份土樣的微生物真菌群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量特征進(jìn)行分析，土壤微生物數(shù)量和種類作為土壤生態(tài)環(huán)境健康程度的重要指標(biāo)，對土壤生態(tài)環(huán)境有很重要的影響。

本研究結(jié)果顯示，海拔高度1 156m（A2樣品）的物種較海拔高度1 056m（A1樣品）豐富且生物量相對均衡；海拔高度1 056m（A1樣品）的物種較海拔高度1 156m（A2樣品）生物量較高，主要集中在子囊菌門，造成此結(jié)果的原因可能是因?yàn)楹０胃撸瑴囟容^低，桉樹林下有機(jī)物質(zhì)分解速率慢，養(yǎng)分代謝活動相對慢，保存的土壤養(yǎng)分較低海拔的豐富，能滿足更多的微生物生長需要。而海拔相對較低的樣地，溫度相對較高，土壤生物活動活躍，土壤有機(jī)質(zhì)代謝頻繁，長期可能造成土壤里的營養(yǎng)物質(zhì)降低，導(dǎo)致土壤貧瘠。桉樹人工林長期種植后，會改變土壤理化性質(zhì)，影響土壤水分和養(yǎng)分，使土壤微生物種類和數(shù)量特征發(fā)生變化[7-8]，海拔相對不是很高，溫差不大時，海拔高的桉樹林根際土壤養(yǎng)分更高[9]。另外，低海拔地區(qū)的人工桉樹林人為活動頻繁，日常的生產(chǎn)生活干擾較多，而高海拔地區(qū)的人工桉樹林人為干擾較少，導(dǎo)致了高海拔地區(qū)的微生物和生物量比低海拔地區(qū)的豐富。

研究結(jié)果顯示，人工桉樹林土壤根際真菌物種多樣性不豐富，與其他非桉樹林土壤微生物多樣性差別較大[10]。土壤微生物的多樣性指數(shù)與土壤的理化性質(zhì)息息相關(guān)，微生物是土壤養(yǎng)分的核心成員，長期的桉樹種植對土壤破壞很大，桉樹快速生長的同時大量吸取了周圍土壤的水分和養(yǎng)料，對生態(tài)環(huán)境造成了一定的影響，會抑制桉樹林下層的植物，造成植物種類的減少，從而影響生物的種類。

4 結(jié)論

景谷地區(qū)因長期種植經(jīng)濟(jì)樹種桉樹，由于桉樹的化感作用和快速生長的同時對生態(tài)環(huán)境造成了很大的影響，本研究通過對人工桉樹林下根際土壤真菌進(jìn)行多樣性分析，得出以下結(jié)論：景谷地區(qū)桉樹林下土壤真菌門類單一，生物量不豐富。