陳雨然，伍慶華，羅 琪，羅黎明，彭雨蒙，曾艷清，徐 磊，李龍雪，洪 滔，劉志勇

(江西中醫(yī)藥大學(xué)，330004，南昌)

0 引言

乳腺癌2020年乳腺癌病例數(shù)達(dá)226萬(wàn)人，首次超過(guò)肺癌，約占新發(fā)癌癥病例的11.7%，已成為威脅女性健康的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題[1-2]，在乳腺癌的發(fā)病原因中，外源雌激素的作用不可小覷，Epstein[3]等證實(shí)了雌激素可以直接或間接地刺激人乳腺癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物乳腺癌的發(fā)生。雙酚A(bisphenol A，BPA)是一種具有外源性擬雌激素樣作用的雙酚類(lèi)化合物(bisphenols)[4]，與乳腺癌的發(fā)生有一定關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)雙酚A通過(guò)雌激素相關(guān)受體γ促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[5]，其中的三陰性乳腺癌由于早期和術(shù)后的主要治療方法單一[6]，患者的臨床結(jié)局較差[7-8]更值得研究，嘗試篩選來(lái)自芳香藥食兩用中藥材中的右旋檸檬烯來(lái)拮抗外源雌激素導(dǎo)致的腫瘤增長(zhǎng)，選擇三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，觀察環(huán)境雌激素雙酚A影響下，右旋檸檬烯作用于MDA-MB-231細(xì)胞的增殖及荷MDA-MB-231乳腺癌裸鼠的腸道微生物生物多樣性變化，為開(kāi)發(fā)新型抗三陰性乳腺癌藥物奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱(MCO-18AC，Panasonic)，超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FD，蘇凈安泰)，XDS-18生物倒置顯微鏡(重慶水電儀器總公司)，DM0412離心機(jī)(DLAB)，滬02270113血球計(jì)數(shù)板(上海求精生化)，注射器(南昌進(jìn)賢3L醫(yī)療)。

1.2 試劑

HL15(Hyclone, SH300048.01)，胎牛血清(Fetal Bovine Serum)(S601S-500，Sera&Pro)，胰酶Trypsin(0457，Amresco)，PBS(SH30256.01，Hyclone)，Matrigel(356234，BD)，β-Estradiol(E8875，Sigma)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5周齡雌性Balb/c-nu/nu小鼠30只，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(湘)：2019-0004。隨機(jī)分成右旋檸檬烯低劑量+雙酚A，右旋檸檬烯中劑量+雙酚A，右旋檸檬烯高劑量+雙酚A，雙酚A 組和腫瘤組。

1.4 受試藥品及配制方法

右旋檸檬烯,由本實(shí)驗(yàn)室從興國(guó)九山生姜提取純化。準(zhǔn)確吸取藥物100 μL(低劑量)、200 μL(中劑量)、400 μL(高劑量)，滴加PEG-400定容至2 mL。雙酚A配制，準(zhǔn)確稱(chēng)取2.7 mg，40 μL DMSO溶解后，滴加環(huán)糊精溶液(2-羥丙基-β-環(huán)糊精，0.3 g/mL)，稀釋定容至13.5 mL，0.2 mg/mL。

1.5 方法

1.5.1 人源乳腺癌 MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng) 人源三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞于含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，收集指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，無(wú)血清HL15重懸至適合密度(5×107/mL，1:1添加Matrigel)用于接種小鼠皮下腫瘤接種。

1.5.2 腫瘤細(xì)胞的接種 裸鼠每只按200 μL的量于右前肢側(cè)腋下接種1×107MDA-MB-231細(xì)胞，接種后定期觀察裸鼠生長(zhǎng)情況和腫瘤生成情況，待皮下接種處腫瘤生長(zhǎng)至平均體積100 mm3時(shí)，根據(jù)所荷腫瘤大小和小鼠體重按1.5.3方法隨機(jī)進(jìn)行分組，并給予相應(yīng)藥物。

1.5.3 隨機(jī)分組 由于腫瘤體積大小會(huì)影響藥物治療的有效性作出判定，所以采取Excel幫助的隨機(jī)分組設(shè)計(jì)的方法，即將鼠所荷腫瘤體積的值輸入Excel表中進(jìn)行分組，以保證不同組別間的腫瘤體積的差異盡可能小。在給藥治療前，稱(chēng)體重，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量荷瘤鼠的腫瘤體積。

1.5.4 雌激素干預(yù) 細(xì)胞接種前1天開(kāi)始(接種當(dāng)天不干預(yù))，每天定時(shí)于小鼠瘤旁(右前肢腋下)皮下注射β-雌二醇溶液100 μL(β-雌二醇0.6 mg/mL)。

1.5.5 給藥 分組當(dāng)天按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案開(kāi)始給藥。

1.5.6 實(shí)驗(yàn)觀察和數(shù)據(jù)收集 MDA-MB-231細(xì)胞接種腋下后，觀察裸鼠生長(zhǎng)及藥物治療對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠日常行為的影響，包括荷瘤裸鼠的活動(dòng)狀況、攝食和飲水情況、體重變化、眼睛、口鼻、裸鼠整體外觀及其它是否有異常情況，及時(shí)記錄觀察到的臨床表現(xiàn)?？诜倚龣幟氏┖螅恐?次用游標(biāo)卡尺對(duì)乳腺癌腫瘤的的長(zhǎng)徑(L)和短徑(D)進(jìn)行測(cè)量，腫瘤體積(mm3)= 1/2 ×(腫瘤長(zhǎng)徑 × 腫瘤短徑2)。

1.5.7 實(shí)驗(yàn)終止和腫瘤標(biāo)本收集 末次給藥后24 h終止喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，麻醉小鼠后對(duì)荷瘤狀況及離體瘤塊進(jìn)行拍照，對(duì)腫瘤進(jìn)行稱(chēng)重，并計(jì)算腫瘤抑制率 =(模型組瘤重均值-實(shí)驗(yàn)組瘤重均值)/模型組瘤重均值 ×100%)，腫瘤組織隨后保存于-80 ℃冰箱；糞便采集，小鼠處死后取結(jié)腸內(nèi)糞便裝凍存管立即液氮保存，后轉(zhuǎn)移-80 ℃冰箱。

1.6 糞便基因組DNA的獲取和擴(kuò)增

對(duì)糞便基因組DNA采用 SDS 方法進(jìn)行提取，提純的DNA的純度和濃度用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，符合要求的樣本DNA以無(wú)菌水稀釋至1 ng/μL，并以此為模板，基于測(cè)序區(qū)域的選擇，用帶 Barcode 的引物，新英格蘭生物技術(shù)公司的PCR混合體系和高效高保真酶進(jìn)行PCR，引物為16S V4區(qū)(515F和806R)。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠(2%)進(jìn)行電泳檢測(cè)，依據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，再次檢測(cè)PCR產(chǎn)物，目的條帶回收產(chǎn)物后使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫(kù)試劑盒構(gòu)建文庫(kù)，獲得文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit和Q-PCR定量合格后，NovaSeq6000進(jìn)行測(cè)序。

1.7 測(cè)序后下機(jī)數(shù)據(jù)的處理

測(cè)序后下機(jī)數(shù)據(jù)根據(jù)Barcode和PCR擴(kuò)增引物序列拆分各樣本結(jié)果數(shù)據(jù)，截去引物序列后對(duì)每個(gè)樣本的reads進(jìn)行FLASH(V1.2.7，http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)拼接，得到Tags數(shù)據(jù)(Raw Tags)，并經(jīng)嚴(yán)格的過(guò)濾處理得到高質(zhì)量的Clean Tags。參照Qiime(V1.9.1，http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)的Tags質(zhì)量控制流程，進(jìn)一步篩掉小于Tags長(zhǎng)度75%的Tags，通過(guò)與物種注釋數(shù)據(jù)庫(kù)(https://github.com/torognes/vsearch/)進(jìn)行比對(duì)，最終去除嵌合體序列獲得有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)。

1.8 樣本復(fù)雜度分析(Alpha Diversity)

物種多樣性通過(guò)使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計(jì)算，Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析應(yīng)用R軟件進(jìn)行分析，差異分析采用wilcox進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.9 菌群物種的相對(duì)豐度展示

對(duì)OTU進(jìn)行菌群物種分類(lèi)，并分別在門(mén)、綱、目、科、屬、種幾個(gè)分類(lèi)等級(jí)對(duì)各個(gè)樣品做物種豐度柱狀圖，就可以直觀看出不同物種在每個(gè)樣品中所占的比例，選取每個(gè)分組在門(mén)水平和屬水平上豐度排名前十的物種，生成菌群物種相對(duì)豐度柱形累加圖，比較各樣本在相應(yīng)分類(lèi)水平上，物種豐度較高的菌群和它們的比例。

1.10 物種豐度聚類(lèi)熱圖

以顏色的深淺梯度來(lái)代表數(shù)據(jù)矩陣中數(shù)值的大小和物種、樣品中豐度相似性進(jìn)行聚類(lèi)的Heatmap，加上樣品的處理信息，可以直觀觀察到相同處理的聚類(lèi)情況，并能直接反映樣品的群落組成的相似性和差異性。本分析根據(jù)豐度排名前35的屬，結(jié)合每個(gè)樣本中的豐度和注釋信息構(gòu)建Heatmap，從物種和樣本2個(gè)層面進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 腫瘤的抑制情況

荷瘤鼠腫瘤體積逐漸增加，其中雙酚A 組的腫瘤體積增加始終高于對(duì)照組和右旋檸檬烯各組，右旋檸檬烯給藥后隨劑量的增加，腫瘤體積減小，高劑量組與對(duì)照組、雙酚A 組比較，具有顯著性差異(P<0.01)。

圖1 右旋檸檬烯對(duì)雙酚A環(huán)境下荷MDA-MB-231乳腺癌腫瘤裸小鼠腫瘤體積的影響

圖2 右旋檸檬烯對(duì)雙酚A環(huán)境下荷MDA-MB-231乳腺癌腫瘤裸小鼠瘤重的影響

2.2 樣本復(fù)雜度分析(Alpha Diversity)

Chao指數(shù)和Ace指數(shù)是生態(tài)統(tǒng)計(jì)學(xué)中用來(lái)估計(jì)群落中含OTU數(shù)目的2種指數(shù)。Chao指數(shù)和Ace指數(shù)越高，表明樣本中的菌類(lèi)總數(shù)越多。由圖3可知，接種腫瘤后細(xì)菌種類(lèi)下降，右旋檸檬烯治療后腸道菌群種類(lèi)增加。

D組為右旋檸檬烯低劑量組，E組為右旋檸檬烯中劑量組，F(xiàn)組為右旋檸檬烯高劑量組，G組為雙酚A組，H組為對(duì)照組，下同。

Shannon、Simpson可以用來(lái)表示群落豐度的情況，Shannon指數(shù)越大，代表生物樣本的菌落多樣性越高；反之Simpson指數(shù)越大，代表群落多樣性越低(圖4)。結(jié)合2種指數(shù)可以看出，荷瘤裸鼠腸道群落豐度下降，雙酚A及同時(shí)給與右旋檸檬烯后群落豐度有所增加。

圖4 荷瘤小鼠及右旋檸檬烯治療后Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)

2.3 基于OTU的Venn圖

根據(jù)不同樣本(組)之間共有、特有的OTUs聚類(lèi)，得到OTUs韋恩結(jié)果圖，可見(jiàn)其中5個(gè)組共同擁有的OTU為269個(gè)(圖5)，5個(gè)相關(guān)處理組各自特有的OUT情況為D組(右旋檸檬烯低劑量組)為38個(gè)，E組(右旋檸檬烯中劑量組)占37個(gè)，F(xiàn)組(右旋檸檬烯高劑量組)占342個(gè)，G組(雙酚A組)占205個(gè)，H組(對(duì)照組)為37個(gè)。

每個(gè)橢圓形代表一個(gè)樣本處理組，橢圓形和橢圓形重合部位的數(shù)字代表各實(shí)驗(yàn)組之間共有的OTUs個(gè)數(shù)，無(wú)重合部位的值代表各組的特有的OTUs個(gè)數(shù)。

2.4 物種相對(duì)豐度展示

以門(mén)水平物種相對(duì)豐度柱形圖為例展示如圖6，對(duì)食用右旋檸檬烯后的小鼠腸道細(xì)菌進(jìn)小鼠腸道糞便中共檢測(cè)到10個(gè)菌門(mén)，包括擬桿菌門(mén)Bacteroidet、疣微菌門(mén)Verrucomicrobiota、芽孢桿菌Bacilli、厚壁菌門(mén)Firmicutes、γ變形菌門(mén)Gammaproteobacteria、彎曲桿菌門(mén)Campylobacteria、放線(xiàn)菌門(mén)Actinobacteriota、α變形菌門(mén)Alphaproteobacteria、放線(xiàn)菌門(mén)Coriobacteria。5組糞便樣品中所含的細(xì)菌門(mén)中擬桿菌門(mén)Bacteroidet、疣微菌門(mén)Verrucomicrobiota、芽孢桿菌Bacilli、厚壁菌門(mén)Firmicutes占到了總細(xì)菌的75%以上，右旋檸檬烯中高劑量組疣微菌門(mén)菌verrucomicrobiota豐度較雙酚A 組和對(duì)照組的明顯增多，而擬桿菌門(mén)Bacteroidet豐度較雙酚A 組和對(duì)照組的明顯減少。

圖6 荷瘤小鼠及右旋檸檬烯治療后門(mén)水平腸道菌群物種相對(duì)豐度柱形圖

以屬分類(lèi)水平進(jìn)一步分析裸鼠糞便樣品中腸道細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)采集的樣品(直腸糞便)中共涉及來(lái)源于10個(gè)屬的細(xì)菌群落，見(jiàn)圖7。其中擬桿菌屬Bacteroides、異戊酸桿菌Alloprevotella、阿克曼氏菌Akkermansia、乳桿菌Lactobacillus、螺桿菌屬Helicobacter、毛螺旋菌屬Parasutterella、Erysipelatoclos屬、脲原體菌Ureaplasma、毛螺菌科NK4A136組Lachnospiraceae_NK4A136和未注釋菌屬Others。與對(duì)照組相比，雙酚A及右旋檸檬烯處理組擬桿菌屬Bacteroides、異戊酸桿菌Alloprevotella、阿克曼氏菌Akkermansia、乳桿菌Lactobacillus、螺桿菌屬Helicobacter、毛螺旋菌屬Parasutterella差異較大，但未達(dá)到顯著性意義。

圖7 荷瘤小鼠及右旋檸檬烯治療后屬水平腸道菌群物種相對(duì)豐度柱形圖

2.5 菌類(lèi)物種的豐度聚類(lèi)Heatmap圖

根據(jù)各組的屬分類(lèi)水平的物種豐度和相關(guān)注釋信息，選取菌類(lèi)豐度排名前30的屬，繪制成Heatmap熱圖8。

圖8 荷瘤小鼠及右旋檸檬烯治療后腸道菌群物種豐度聚類(lèi)熱圖

3 討論

一些藥食兩用類(lèi)藥材可能具有新穎的抗腫瘤作用機(jī)制且副作用小。例如生姜在之前的研究中發(fā)現(xiàn)具有很好的消炎抗腫瘤作用，為三陰性乳腺癌治療藥食兩用類(lèi)藥物的開(kāi)發(fā)提供了可能性[9-11]。

腸道菌群通過(guò)與宿主形成微生態(tài)系統(tǒng)密切影響著宿主的生理病理過(guò)程，近年來(lái)腸道菌群與腫瘤關(guān)系的研究得到了關(guān)注，Goedert[12]等提取48例絕經(jīng)后乳腺癌患者與健康絕經(jīng)后婦女糞便中腸道菌群DNA，經(jīng)illumina 測(cè)序和16S rRNA基因分類(lèi)發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后乳腺癌患者糞便中腸道菌群的多樣性和組成差異少，腸道菌群中Clostridiaceae(梭菌)，F(xiàn)aecalibacterium(糞桿菌屬)，Ruminococcaceae(瘤胃菌科)的豐度明顯增高，Dorea(多爾氏菌科)和Lachnospiraceae(毛螺菌科)的豐度則降低。其中α-多樣性和β-多樣性發(fā)生了大幅度下降。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)右旋檸檬烯治療的毛螺菌科NK4A136組Lachnospiraceae_NK4A136與對(duì)照和雙酚A 組比較有所增加，由于腸道菌群的不同組成導(dǎo)致個(gè)體間的抗腫瘤免疫的差異可能是主要環(huán)境因素，這種腸道菌群的不同可能影響全身免疫，進(jìn)而通過(guò)調(diào)控宿主免疫影響腫瘤免疫治療的效果及毒副反應(yīng)，干預(yù)腸道菌群(如益生菌、糞菌移植等方法)，有望成為輔助腫瘤免疫治療的重要手段。