陳勝婷， 陳高永， 安 娜， 湯 莉， 李應(yīng)分， 汪德生，2*

(1. 貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 2. 貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

禽巴氏桿菌病又稱禽霍亂，是由多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)引起雞、鴨、鵝等禽類的1種接觸性傳染病[1]。該病在世界大多數(shù)國家均有發(fā)生，呈散發(fā)性流行，是家禽的常見疫病之一[2]。2021年7月，貴州省遵義市某養(yǎng)殖場的110日齡烏骨雞發(fā)生疫情，臨床癥狀主要為消瘦、鼻腔有黏液，2天死亡60余只。為查明雞發(fā)病死亡的原因，特進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，并采取相應(yīng)防治措施。

1 材料與方法

1.1 主要試劑鮮血瓊脂培養(yǎng)基(自制)；麥康凱培養(yǎng)基、美藍(lán)染色劑、革蘭氏染料、藥敏紙片、生化鑒定管(杭州微生物試劑有限公司)；DNA/RNA提取試劑盒、新城疫病毒qRT-PCR檢測試劑盒(深圳芬德生物技術(shù)有限公司)；2 000 bp DNA Marker(博邁德生物技術(shù)有限公司)等。

1.2 主要儀器高速冷凍離心機(jī)(長沙高新開發(fā)區(qū)湘儀貝克儀器儀表有限公司)、PCR擴(kuò)增儀(杭州柏恒科技有限公司)、凝膠成像儀(BIO-RAD)、實(shí)時熒光定量PCR儀(BIO-RAD CFX connect)等。

1.3 流行病學(xué)調(diào)查、癥狀及病變該養(yǎng)殖場存欄烏骨雞6萬余只，雞苗為外地引進(jìn)，已進(jìn)行了基本的疫苗程序免疫(腎型傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病、禽流感、新城疫、雞痘等)。2021年7月14日死亡3只，至第2天相繼死亡60余只。臨床檢查：雞消瘦、鼻腔有黏液。剖檢病死雞可見：肝臟表面有灰白色壞死點(diǎn)，心冠脂肪出血，心包內(nèi)有淡黃色積液，肌胃出血，腺胃乳頭出血，盲腸扁桃體出血，十二指腸彌漫性出血，腎臟腫大，胸肌和腿肌出血，肺臟有實(shí)變區(qū)。結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀、病理變化，病例疑似禽霍亂、新城疫或安卡拉病。

1.4 細(xì)菌檢測

1.4.1 病料鏡檢采集病死雞肝臟組織制成2～3個觸片，火焰固定，美藍(lán)染色5～10 min，水洗干燥后加1滴香柏油，加蓋玻片，光學(xué)顯微鏡(100×10倍)觀察。

1.4.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)無菌條件下用接種環(huán)將病死雞肝臟組織接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長狀況。生長菌落經(jīng)3次純化培養(yǎng)后進(jìn)行革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡(100×10倍)觀察細(xì)菌形態(tài)。挑取純化的單一菌落接種于麥康凱培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長情況。

1.4.3 生化試驗(yàn)通過糖發(fā)酵試驗(yàn)(葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇)、M.R試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)檢測分離菌的生化特性。

1.4.4 藥敏試驗(yàn)將純化的細(xì)菌接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，然后將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑。根據(jù)杭州微生物試劑有限公司藥敏判定標(biāo)準(zhǔn)判定菌株對藥物的敏感性。

1.5 相關(guān)病毒核酸檢測分別取9只病死雞的心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦組織病料各1 g于滅菌研缽中，加入生理鹽水1.5 mL快速研磨，勻漿后轉(zhuǎn)入1.5 mL 無菌離心管中，8 000 r/min離心2 min，分別移取上清液100 μL于另1支1.5 mL無菌離心管中，按照DNA/RNA提取試劑盒說明書方法提取樣品的總DNA/RNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.1 新城疫病毒核酸檢測以提取的總RNA為模板，構(gòu)建qRT-PCR反應(yīng)體系25 μL：qRT-PCR反應(yīng)液17.5 μL，混合酶2.5 μL，RNA模板 5 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 10 min，95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，55 ℃ 40 s，在循環(huán)第2步(55 ℃ 40 s)收集熒光信號，共40個循環(huán)。

1.5.2 安卡拉病毒核酸檢測引物序列：FAdV-4-F：5’-CCCAAGCTTATGTCGGCCCTAATCGCCT-3’；FAdV-4-R：5’-TGCTCTAGAGGCCAAAGTATCGT CATCGATGAGCAG-3’。退火溫度59 ℃，預(yù)擴(kuò)增片段366 bp。以提取的總DNA為模板，構(gòu)建PCR反應(yīng)體系25 μL：2×TaqPlus MasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，滅菌ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min，4 ℃保存，取PCR產(chǎn)物10 μL于含Goldview核酸染料的1.2%瓊脂糖凝膠中電泳(110 V，40 min)，凝膠成像儀上觀察結(jié)果(預(yù)擴(kuò)增片段366 bp)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌檢測結(jié)果

2.1.1 肝臟組織鏡檢發(fā)現(xiàn)兩極濃染的短小桿菌，呈藍(lán)色(見圖1)。

圖1 肝臟組織觸片鏡檢

2.1.2 細(xì)菌形態(tài)特征由圖2可見：鮮血瓊脂培養(yǎng)基中生長出光滑濕潤、灰白色、半透明、隆起、邊緣整齊的露滴狀菌落。挑取菌落革蘭氏染色鏡檢，可見革蘭氏陰性(紅色)短小桿菌，呈單個存在或成雙排列(見圖3)。

圖2 菌落形態(tài)

圖3 分離菌革蘭氏染色鏡檢

2.1.3 生化特性由表1可見：分離菌可發(fā)酵葡萄糖、甘露醇、蔗糖，吲哚試驗(yàn)呈陽性，與多殺性巴氏桿菌的生化特性相符。根據(jù)細(xì)菌形態(tài)特征和生化特性，綜合鑒定為多殺性巴氏桿菌。

表1 分離菌生化試驗(yàn)結(jié)果

2.1.4 藥物敏感性由表2可見：分離菌對多西環(huán)素、四環(huán)素、新霉素、頭孢拉定、諾氟沙星、慶大霉素、青霉素、丁胺卡那敏感，對環(huán)丙沙星、卡那霉素 、紅霉素中度敏感。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.2 相關(guān)病毒檢測結(jié)果

2.2.1 新城疫病毒核酸檢測結(jié)果由圖4可見：新城疫病毒qRT-PCR檢測顯示，9個檢測樣品均無明顯擴(kuò)增曲線且Cq值>40(陽性對照Cq值為19.5)，說明各組織樣品中不存在新城疫病毒感染。

+：陽性對照；-： 陰性對照；1～9：檢測樣品圖4 新城疫病毒qRT-PCR檢測結(jié)果

2.2.2 安卡拉病毒核酸檢測結(jié)果由圖5可見：9個檢測樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增，均未出現(xiàn)366 bp目的基因片段，與陽性對照不相符，說明組織樣品中不存在安卡拉病毒感染。

M：2 000 bp分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；+：陽性對照；-：陰性對照；1～9：檢測樣品圖5 安卡拉病毒PCR檢測結(jié)果

3 結(jié)論

通過流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀、病理變化和實(shí)驗(yàn)室病原檢測，確診該養(yǎng)殖場發(fā)病原因?yàn)槎鄽⑿园褪蠗U菌感染。

4 防治措施

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選用多西環(huán)素、四環(huán)素、新霉素等敏感藥物按說明書用量及方法進(jìn)行治療，并定期更換、交叉使用，避免長期使用同一種藥物而使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。大群治療通過將藥物投放在飲水或飼料中給藥，注意經(jīng)水給藥時藥物要充分溶解，經(jīng)料給藥時要攪拌均勻。用藥治療后病情緩解，死亡數(shù)下降，數(shù)天后控制了病情，再無死亡發(fā)生。為防止再次發(fā)病，建議場主在飼養(yǎng)過程中要避免雞群擁擠，保持適宜的雞舍溫度，并定期清理消毒，保證飼料、飲水和用具清潔衛(wèi)生。

5 討論

巴氏桿菌通常為條件性致病菌，大多數(shù)是內(nèi)源性感染，當(dāng)動物機(jī)體抵抗力下降時常引起發(fā)病。因此，對該病的防控主要以提高動物機(jī)體抵抗力和做好飼養(yǎng)管理工作為主。貴州氣候類型為亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，光照條件較差，降雨日數(shù)多，相對濕度較大。通風(fēng)不良會使得禽舍內(nèi)陰暗潮濕，易滋生細(xì)菌，使禽患病的風(fēng)險加大。巴氏桿菌病的流行和發(fā)生無明顯的季節(jié)性，一年四季均可發(fā)生，但在高溫、潮濕、雨水較多的夏、秋季以及溫度多變的春季發(fā)病率較高[3]。夏季氣溫高，雞舍通風(fēng)不良常導(dǎo)致舍內(nèi)環(huán)境溫度升高，導(dǎo)致雞的熱應(yīng)激反應(yīng)，感染巴氏桿菌的雞會在短時間內(nèi)出現(xiàn)死亡[4]。雞舍在高溫季節(jié)要保證良好的通風(fēng)，以緩解高溫對雞的不良影響[5]。冬季采用最小通風(fēng)量，減少熱量的損失并保證能夠排出廢氣，引進(jìn)新鮮空氣[6]。對于保溫性能不好的禽舍，冬天可在四周、房頂處加保溫層，如玉米秸稈、稻草、棉被等，防止冷風(fēng)滲透[7]。此外，大部分家畜也攜帶有巴氏桿菌，帶菌的豬、狗、貓均可能使雞受到感染，因此家畜和家禽必須分開飼養(yǎng)[8]。