高瑞超, 李 敏, 金朋然, 劉 旋, 馮 雪, 檀增桓

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院, 河北 邯鄲 056000)

恩格列凈(Empagliflozin,EMPA)是鈉-葡萄糖共轉運蛋白2(Sodium glucose cotransporter,SGLT2)的選擇性抑制劑,通過增加腎臟頂膜的葡萄糖排泄降低糖尿病患者的血糖[1]。恩格列凈可改善糖尿病患者的糖化血紅蛋白水平,并可在不增加心率的情況下減輕體重和降低血壓,其在歐盟、美國和日本以及世界其他地區(qū)被批準用于治療Ⅱ型糖尿病(T2D),為一種良好的抗高血糖藥物[2,3]。但是其產生抗高血糖作用的機制尚未十分清楚。糖尿病腎病在多種糖尿病并發(fā)癥中最常見,給患者帶來的健康危害最嚴重。EMPA對糖尿病患者的治療作用雖得到很多患者的認可,但是其發(fā)揮作用的機制仍存在疑惑。微小RNA(miRNA)是一種長度在18-25個核苷酸之間的內源性非編碼保守的單鏈RNA,通過抑制靶基因的轉錄、翻譯過程參與各種疾病的發(fā)生發(fā)展[4]。miR-497-3p是新發(fā)現(xiàn)的一種參與糖尿病病變的miRNA之一[5],其是否受恩格列凈的調控尚未可知。糖基磷脂酰肌醇特異性磷脂酶D1(glycosylphosphatidylinositol -specifific phospholipase D1,GPLD1)在動物機體的血清中含量較高,其可作為類脂肪細胞合成分泌胰島素的第二信使調控糖代謝過程。本研究旨在探究恩格列凈在高糖環(huán)境下對腎小管微血管內皮細胞存活的調控機制與miR-497-3p、GPLD1之間的關系。

1 材料與方法

1.1材料:人腎小球微血管內皮細胞HRGEC購自中國(上海)科學研究院細胞庫；恩格列凈片(原國藥準字J20171073；編號：S14202853284)購自德國勃林格殷格翰藥業(yè)公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁研究所；Annexin V-FITC/PI雙染凋亡檢測試劑盒購自大連TAKERA；RT-qPCR試劑盒購自上海碧云天研究所；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京康為世紀；RNA 結合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation assay,RIP)實驗試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific；兔抗GPLD1多抗、鼠抗PCNA單抗、兔抗P21多抗、兔抗Caspase-3多抗、兔抗Caspase-9多抗、辣根過氧化物酶標記的二抗均購自上海艾博抗。

1.2方 法

1.2.1細胞培養(yǎng):用DMEM培養(yǎng)液(10%胎牛血清)培養(yǎng)HRGEC細胞,置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),隔天更換培養(yǎng)液。

1.2.2分組與處理:將正常培養(yǎng)的HRGEC細胞用5、30mmoL/L的葡萄糖處理48h,標記為HG組、HG組。30mmoL/L的葡萄糖與恩格列凈(250、500、1000nmoL/L)共同處理的HRGEC細胞標記為250、500、1000nmoL/L組,篩選最適濃度500nmoL/L。LipofectamineTM3000脂質體將miR-NC組(轉染miR-NC)、miR-497-3p組(轉染miR-497-3p)、si-NC組(轉染si-NC)、si-GPLD1組(轉染si-GPLD1)、EMPA+miR-497-3p+pcDNA組(共轉染miR-497-3p和pcDNA)、EMPA+miR-497-3p+pcDNA-GPLD1組(共轉染miR-497-3p和pcDNA-GPLD1)轉染HRGEC細胞12h,更換培養(yǎng)液(混有500nmoL/L恩格列凈或30mmoL/L的葡萄糖)培養(yǎng)48h,RT-qPCR法確認轉染成功,用于后續(xù)研究。

1.2.3CCK-8實驗:收集細胞,調為105個/mL,取100μL接種96孔板。加入20μL的CCK-8試劑液,震蕩混勻,避光孵育15min。在490nm波長下檢測細胞吸光度(A490值)。細胞增殖率(%)=A490實驗組/A490對照組×100%。

1.2.4Annexin V-FITC/PI雙染實驗:收集細胞,用500μL的Binding Bμffer懸浮細胞。加入5μL的Annexin V- / FITC避光孵育20min,再加入5μL的PI避光孵育15min。盡快上流式細胞儀結束檢測分析?？偟蛲雎?%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.2.5RT-qPCR實驗:收集細胞,Trizol液提取其中總RNA,再用反轉錄試劑盒合成cDNA,作為模板。RT-qPCR試劑盒檢測模板中miR-497-3p、GPLD1的表達。2-△△Ct法計算表達水平。95℃,3min；94℃,30s；60℃,30s；72℃,40s；進行45個循環(huán)；最后72℃保存10min。引物為：miR-497-3p,正向5′-AAGTGCAGGTCGGT-3′,反向5′-TAGCCTGCAGCACTGTGTG-3′；GPLD1正向5′-TGTTTCCAAGTTACAATGGTTC-3′,反向5′-AGCATGGTTTCTAATGAATGG-3′；內參U6、GAPDH所用為通用引物。

1.2.6WB實驗:收集細胞,RIPA裂解液冰上裂解30min,提取細胞總蛋白。Bradford法蛋白定量,沸水浴變性,取上清上樣。使用SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒配置低濃度濃縮膠、高濃度分離膠,將蛋白聚集在凝膠。再用轉膜儀將膠上的蛋白在0℃條件下轉移至PVDF膜。取出膜,2.5%的脫脂奶粉37℃封閉2h。將膜浸入一抗溶液(兔抗GPLD1多抗,1∶1000；鼠抗PCNA單抗,1∶500；兔抗P21多抗,1∶2000；兔抗Caspase-3多抗,1∶2000；兔抗Caspase-9多抗,1∶2000),4℃孵育過夜。再轉入二抗溶液(辣根過氧化物酶標記的二抗,1∶500),37℃孵育1.5h,最后進行ECL顯色。β-actin為內參,蛋白灰度值與內參灰度值之比為蛋白表達情況。

1.2.7雙熒光素酶報告基因檢測實驗:生物信息學靶向預測庫Targetscan(http://www.targetscan.org)預測到miR-497-3p與GPLD1之間具有靶向關系。將化學合成的GPLD1 -WT(含GPLD1 3UTR片段)和GPLD1-MUT(含GPLD1 3UTR片段突變體)克隆到熒光載體,構建熒光素酶報告基因載體質粒。將其分別與miR-NC、miR-497-3p、anti-miR-NC、anti-miR-497-3p共轉染細胞。最后按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒技術手冊操作,檢測分析細胞的熒光活性。

1.2.8RIP實驗:收集需要檢測的細胞,按照RIP實驗試劑盒說明書要求操作,懸浮細胞,加入吸附Ago2抗體或IgG抗體的磁珠共孵育。充分洗滌磁珠,提取其中總RNA,進行RT-qPCR實驗,分析其中GPLD1的相對表達量。

2 結 果

表1 恩格列凈處理的高糖誘導HRGEC細胞的增殖率

2.1恩格列凈調控高糖誘導HRGEC細胞增殖:與NG組相比,HG組、250、500nmoL/L組細胞增殖率顯著降低；與HG組相比,500、1000nmoL/L組細胞增殖率顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.2恩格列凈調控高糖誘導HRGEC細胞凋亡:與NG組相比,HG組、250、500、1000nmoL/L組細胞凋亡率顯著升高；與HG組相比,500、1000nmoL/L組細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。故選用500nmoL/L恩格列凈處理的高糖誘導HRGEC細胞用于后續(xù)研究。見圖1、表2。

圖1 恩格列凈處理的高糖誘導HRGEC細胞凋亡

表2 恩格列凈處理的高糖誘導HRGEC細胞凋亡率

圖2 過表達miR-497-3p的高糖誘導HRGEC細胞PCNA、P21、Caspase-3、Caspase-9蛋白

表3 恩格列凈處理的高糖誘導HRGEC中miR-497-3p表達

2.3恩格列凈調控高糖誘導HRGEC細胞中miR-497-3p表達：與NG組相比,HG組、250、500nmoL/L組細胞miR-497-3p表達顯著降低；與HG組相比,500、1000nmoL/L組細胞miR-497-3p表示顯著升高(P<0.05)。見表3。

2.4過表達miR-497-3p調節(jié)高糖誘導HRGEC細胞增殖、凋亡：與miR-NC組相比,miR-497-3p組細胞miR-497-3p表達量顯著升高,增殖率顯著升高,凋亡率顯著降低,PCNA蛋白表達顯著升高,P21、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖2、表4。

2.5miR-497-3p靶向GPLD1∶通過Targetscan(http://www.targetscan.org)預測到miR-497-3p與GPLD1之間存在連續(xù)的互補結合位點,如圖3A。雙熒光素酶報告基因檢測實驗結果如圖3B,與miR-NC組相比,miR-497-3p組GPLD1-WT細胞的熒光活性顯著降低(P<0.05)；RIP實驗結果如圖3C,與miR-NC組相比,miR-497-3p組Ago2-GPLD1的相對表達量顯著升高(P<0.05)；與miR-NC組相比,miR-497-3p組細胞GPLD1蛋白表達量顯著降低,與anti-miR-NC組相比,anti-miR-497-3p組細胞GPLD1蛋白表達量顯著升高(P<0.05),見圖3D、E。

表4 過表達miR-497-3p的高糖誘導HRGEC細胞增殖凋亡情況及相關蛋白表達量

圖3 miR-497-3p靶向調控GPLD1

2.6恩格列凈調控高糖誘導HRGEC細胞中GPLD1的表達:與NG組相比,HG組、EMPA組細胞中GPLD1的mRNA和蛋白表達均顯著升高,與HG組相比,EMPA組細胞中GPLD1的mRNA和蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。見圖4和表5。

圖4 GPLD1蛋白表達

表5 恩格列凈處理的高糖誘導HRGEC細胞中GPLD1的表達

2.7敲減GPLD1調節(jié)高糖誘導HRGEC細胞增殖、凋亡:與si-NC組相比,si-GPLD1組細胞中GPLD1表達顯著降低,增殖率顯著升高,凋亡率顯著降低,PCNA蛋白表達顯著升高,P21、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖5、表6。

2.8過表達GPLD1逆轉過表達miR-497-3p和恩格列凈對高糖誘導HRGEC細胞增殖、凋亡的調控作用:與EMPA+miR-NC組相比,EMPA+miR-497-3p組細胞miR-497-3p表達顯著升高,增殖率顯著升高,凋亡率顯著降低,PCNA蛋白表達顯著升高,P21、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達顯著降低；與EMPA+miR-497-3p+pcDNA組相比,EMPA+miR-497-3p+pcDNA-GPLD1組細胞上述指標均顯著反向調控(P<0.05)。見圖6、表7。

表6 敲減GPLD1調節(jié)高糖誘導HRGEC細胞增殖凋亡情況及相關蛋白表達量

圖5 敲減GPLD1調節(jié)高糖誘導HRGEC細胞PCNA、P21、Caspase-3、Caspase-9蛋白

圖6 PCNA、P21、Caspase-3、Caspase-9蛋白

表7 過表達GPLD1對miR-497-3p恩格列凈調控高糖誘導HRGEC細胞增殖凋亡的影響

3 討 論

最近很多研究發(fā)現(xiàn),恩格列凈可明顯減少T2D患者的腎臟并發(fā)癥和心血管疾病[6]。恩格列凈有益于患者血流動力學改變、體重減輕、腎素分泌抑制、循環(huán)利鈉肽濃度降低和腎單位重塑[7,8],但是這些有益作用在糖尿病并發(fā)癥中的作用機制仍不清楚。Lee等[9]發(fā)現(xiàn),恩格列凈處理后,人腎小管近端上皮細胞線粒體活性氧生成減少,凋亡和纖維化蛋白表達減少,恢復高糖環(huán)境下細胞的AMP活化蛋白激酶-α磷酸化和AMP與ATP比率的標準化水平,并且還保護糖尿病小鼠腎臟的損傷。Nitin等[10]報道,恩格列凈能夠逆轉SGLT2對高糖誘導的HK-2細胞的RECK抑制,其機制與調控氧化應激/TRAF3IP2/NF-κB和p38 MAPK/miR-21信號通路有關,減輕高糖環(huán)境下腎臟的炎癥、纖維化等腎病。本研究發(fā)現(xiàn),恩格列凈呈濃度依賴性促進高糖誘導HRGEC細胞增殖,抑制凋亡,說明恩格列凈能夠促進腎小球微血管上皮細胞的存活,減高糖環(huán)境下腎臟的損傷。重要的是,恩格列凈還上調高糖環(huán)境下HRGEC細胞中miR-497-3p的表達,也許miR-497-3p與恩格列凈的抗糖尿病腎損傷有關。

miRNA在人類各種疾病中的功能已得到普遍認可,其中包括糖尿病[11]。miR-497-3p是新發(fā)現(xiàn)的一種調控糖尿病發(fā)展的miRNA。Ban等[12]研究發(fā)現(xiàn),miR-497在糖尿病小鼠皮膚傷口中的表達下調,在傷口注射miR-497模擬物具有明顯的促進傷口愈合作用,并且miR-497還可體外抑制促炎細胞因子的分泌,該研究揭示了miR-497在糖尿病中的抗炎和促傷口愈合作用,暗示其在治療糖尿病中的巨大潛力。Wang等[13]報道,miR-497在糖尿病腎病組織、高糖處理的HK-2細胞中的表達均下調,過表達miR-497可抑制高糖誘導的乳酸脫氫酶(LDH)漏出、caspase-1激活以及IL-1β和IL-18的分泌,miR-497作為INK4基因座中反義非編碼RNA(ANRIL)的吸附劑,靶向魚硫氧還蛋白相互作用蛋白(TXNIP),參與糖尿病腎病的上瞼下垂和腎損傷。本研究發(fā)現(xiàn),miR-497-3p在高糖誘導hRMECs細胞中的表達顯著降低,而恩格列凈處理后,呈濃度依賴性上調miR-497-3p的表達水平,說明miR-497-3p受恩格列凈的正向調控。過表達miR-497-3p明顯促進高糖誘導hRMECs細胞增殖,抑制凋亡,并上調增值促進蛋白PCNA,抑制抗增殖蛋白P21、凋亡促進蛋白Caspase-3、Caspase-9,再次證實了miR-497-3p在糖尿病中的治療價值。重要的是,該研究還通過雙熒光素酶報告基因檢測實驗、RIP實驗和WB實驗驗證了,miR-497-3p能夠靶向負調控GPLD1,這也許可能與miR-497-3p的糖尿病治療有關系。

據(jù)報道,糖尿病大鼠血清中GPLD1含量顯著升高,運動訓練后大鼠血糖明顯降低,胰島素水平明顯升高,重要的是,GPLD1含量也顯著降低,說明GPLD1參與糖尿病患者血糖的升高過程[14]。最新研究發(fā)現(xiàn),GPC4在二型糖尿病患者、高胰島素肥胖者、糖耐量低下肥胖者血清中的含量均顯著升高,而GPLD1是GPC4的關鍵因子,與GPC4含量呈正相關,證明GPC4是受GPLD1調節(jié)的脂肪組織抵抗胰島素的重要因子[15]。本研究發(fā)現(xiàn),GPLD1在高糖誘導的hRMECs細胞中表達發(fā)生上調,且這種異常升高現(xiàn)象可被恩格列凈十分顯著的抑制。此研究還檢測了敲減GPLD1的hRMECs細胞的增殖、凋亡情況發(fā)現(xiàn),敲減GPLD1后,高糖誘導的hRMECs細胞的增殖率顯著升高,凋亡率顯著降低,PCNA發(fā)生升高,P21、Caspase-3、Caspase-9均明顯降低,說明降低GPLD1有利于高糖環(huán)境下細胞的生存,暗示恩格列凈、GPLD1抑制劑在糖尿病基因治療中的潛力。深入研究,過表達GPLD1后發(fā)現(xiàn),恩格列凈聯(lián)合過表達miR-497-3p對高糖誘導hRMECs細胞的增殖促進和凋亡抑制作用均可收到十分明顯的削弱,說明GPLD1作為miR-497-3p的靶基因,還可逆轉恩格列凈、miR-497-3p對高糖環(huán)境下細胞存活的促進作用。

綜上所述,恩格列凈促進高糖誘導hRMECs細胞增殖,抑制凋亡,其作用機制為上調miR-497-3p進而抑制其下游靶基因GPLD1表達,為恩格列凈用于臨床治療糖尿病奠定理論基礎。