劉景新, 陳余興, 王 貴
(海南省儋州市海南西部中心醫(yī)院骨科, 海南 儋州 571700)
骨關(guān)節(jié)炎(OA,osteoarthritis)是最常見的關(guān)節(jié)炎類型,在65歲以上人群中患病率達(dá)1/3[1]。OA伴隨著慢性疼痛、關(guān)節(jié)腫大、僵硬等癥狀,使患者長(zhǎng)期忍受運(yùn)動(dòng)受限和疼痛,因此嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。目前,OA的治療主要涉及緩解疼痛和減輕炎癥,目的是恢復(fù)活動(dòng)性并緩解癥狀,但是OA的治療仍是一個(gè)醫(yī)學(xué)難題[2],因此需要尋找更優(yōu)的抗炎策略來治療OA。白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β是OA的關(guān)鍵誘導(dǎo)劑,IL-1β導(dǎo)致軟骨細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)增加導(dǎo)致代謝失衡。OA患者的軟骨細(xì)胞會(huì)持續(xù)產(chǎn)生前列腺素(prostaglandin PG)E2,腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF)-α,IL-1β等細(xì)胞因子。已知ATP門控的離子通道P2X7受體(ATP-gated ion channel P2X7 receptor,P2X7R)通過多種途徑參與調(diào)節(jié)炎癥和疼痛[3]。盡管P2X7R可能與OA炎癥密切相關(guān),但其在OA中的上下游調(diào)控機(jī)制仍有待研究。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)通常是長(zhǎng)度> 200個(gè)核苷酸的RNA轉(zhuǎn)錄物,其缺乏編碼蛋白質(zhì)的能力[4]。LncRNA可能通過誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的變化和轉(zhuǎn)錄后修飾來在RNA表觀遺傳水平上調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖凋亡并參與OA進(jìn)展[5]。目前發(fā)現(xiàn)LncRNAuc.48+在糖尿病大鼠頸神經(jīng)節(jié)中被觀察到與P2X7受體共表達(dá)[6]。另外,發(fā)現(xiàn)uc.48+的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)通過體外P2X7R抑制糖尿病單吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的炎性反應(yīng)[7]。但是鮮見關(guān)于uc.48+在OA中的報(bào)道。本研究假設(shè)OA中LncRNAuc.48+可通過調(diào)控P2X7R及其下游通路介導(dǎo)OA的炎癥反應(yīng)。因此本文利用碘乙酸單鈉(Monosodium iodoacetate,MIA)建立了OA大鼠模型,并探討了LncRNAuc.48+在OA中的表達(dá)模式和對(duì)OA炎癥的調(diào)節(jié)機(jī)制。
1.1試劑與耗材:LncRNA uc.48+過表達(dá)重組質(zhì)粒(pcDNA3.1-LncRNA uc.48+,pc-LncRNA uc.48+)以及空載體(pcDNA3.1-null,pc-null)構(gòu)建于上海吉瑪公司。60只雄性SD成年大鼠(14周,293-411 g)購(gòu)于海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。MIA,P2X7R選擇性拮抗劑(AZD9056)和NF-κB信號(hào)通路抑制劑(Helenalin)購(gòu)自美國(guó)Sigma。兔抗P2X7R、MMP-13、SP、NF-κB P65(P65)、p-NF-κBP65(p-P65)、磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的多克隆抗體和HRP偶連的山羊抗小鼠和抗兔抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam。PGE2,IL-1β、TNF-α的ELISA試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物公司。大鼠軟骨細(xì)胞購(gòu)于武漢普諾賽生物科技有限公司。其余未特殊說明的試劑均購(gòu)買于美國(guó)Gibco公司。
1.2動(dòng)物與分組:大鼠在12/12h的明暗循環(huán)下將每只大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)在鼠籠中。室溫23±1.5℃和濕度為(50±10%)。食物和水可隨意獲得。每天對(duì)所有大鼠進(jìn)行10min的測(cè)試環(huán)境適應(yīng),持續(xù)2w。所有動(dòng)物研究均經(jīng)我院倫理學(xué)審查通過,動(dòng)物使用方法符合國(guó)際疼痛研究協(xié)會(huì)(International Assocaition For The Study Of Pain,IASP)發(fā)布的《動(dòng)物疼痛行為守則》。將60只大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為sham組(n=10)和MIA組(n=50)。MIA組用異氟烷(2%的O2)麻醉大鼠,MIA溶于無菌的0.9%鹽水并進(jìn)行MIA單次關(guān)節(jié)內(nèi)注射(2 mg / 50μL)。從50只MIA中隨機(jī)選40只,并隨機(jī)分為4組:pc-LncRNA uc.48+組、pc-null組、pc-LncRNA uc.48++AZD9056組、pc-LncRNA uc.48++Helenalin組。具體而言,從MIA注射后第14天開始,每周2次關(guān)節(jié)內(nèi)注射構(gòu)建的pc-LncRNA uc.48+(2μg/ 50μL,pc-LncRNA uc.48+組),以及pc-null(2μg/ 50μL,pc-null組)。另外,MIA注射后第14天聯(lián)合注射pc-LncRNA uc.48+(2μg/ 50μL)和AZD9056(5mg / 50μL)(pc-LncRNA uc.48++AZD9056組),每天兩次;以及MIA注射后第14天聯(lián)合注射pc-LncRNA uc.48+(2μg/ 50μL)和Helenalin(40μg/ 50μL)(pc-LncRNA uc.48++Helenalin組)。MIA注射21d為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。所有結(jié)果測(cè)量均由對(duì)隨機(jī)治療不知情的實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行。
1.3實(shí)時(shí)定量PCR:根據(jù)制造商的說明,使用Unizol試劑提取大鼠同側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨的總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,將每個(gè)樣品中約5μgRNA用作cDNA合成的模板。PCR中使用等體積的cRNA產(chǎn)物。PCR條件包括94個(gè)變性循環(huán)40s,55℃退火30 s和72℃聚合30s的40個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳,并且通過溴乙錠染色將PCR片段可視化。每個(gè)基因的實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。uc.48+引物序列正向:5'-GGCACUACUACUUGCAGAATT-3';反向:5'-UUCUGCAAGUAGUAGUGCCTT-3'。GAPDH用作內(nèi)參基因。
1.4動(dòng)物疼痛行為學(xué):機(jī)械痛閾值(mechanical withdrawal threshold,MWT)和熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency,PWTL)都參考文獻(xiàn)報(bào)道中的方法進(jìn)行檢測(cè)。記錄MIA注射的前1d(0d),注射后1d、3d、7d、21d的MWT和PWTL值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.5評(píng)估膝蓋關(guān)節(jié)的腫大程度:記錄MIA注射的前1d(0d),注射后1d、3d、7d、21d的評(píng)估膝蓋腫大程度。如前所述,使用校準(zhǔn)的數(shù)字卡尺測(cè)量膝蓋的直徑,并通過同側(cè)(MIA注射側(cè))的值減去對(duì)側(cè)的值來確定關(guān)節(jié)之間的直徑差異。
1.6ELISA細(xì)胞因子的測(cè)定:大鼠用1%甲戊酸鈉麻醉。從收集軟骨組織并進(jìn)行勻漿[8],收集總蛋白溶液,并在3500g下離心15min。然后收集上清液,并保存于-80℃。根據(jù)制造商的說明,通過ELISA試劑盒分析了促炎細(xì)胞因子(IL-1β,PGE2和TNF-α)的水平。
1.7膝關(guān)節(jié)組織的SO染色:MIA后21d,安樂死大鼠,隨后將膝關(guān)節(jié)制成標(biāo)本,切成5μm切片。根據(jù)SO染色試劑盒的制造商的說明,對(duì)這些切片進(jìn)行SO染色。
1.8大鼠軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染:大鼠軟骨細(xì)胞系在補(bǔ)充有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)并傳代(3d傳代一次)。對(duì)所得構(gòu)建體進(jìn)行測(cè)序分析。將大鼠軟骨細(xì)胞(1×108細(xì)胞/L)接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。根據(jù)制造商的說明書,將Lipofectamine 2000加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)基,并且每孔加入1μg pc-LncRNA uc.48+或pcDNA-null轉(zhuǎn)染細(xì)胞。24h后將培養(yǎng)基更新為含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基以終止轉(zhuǎn)染。收集細(xì)胞,用來進(jìn)行蛋白免疫印跡或qPCR實(shí)驗(yàn)。
1.9蛋白免疫印跡:MIA后21d,安樂死大鼠,將注射側(cè)的膝關(guān)節(jié)軟骨組織勻漿后,提取軟骨組織的總蛋白,或者收集大鼠軟骨細(xì)胞,超聲裂解后提取總蛋白[9]。凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠,并通過轉(zhuǎn)印將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。膜在37℃下用3%脫脂牛奶封閉1.5 h,然后與抗P2X7R(1∶800),MMP-13(1∶1000),SP(1∶1200),P65(1∶600),p-P65(1∶500)和GAPDH( 1∶2000)在4℃下孵育過夜。在室溫下與HRP偶聯(lián)的二抗孵育1.5 h后,使用western blot化學(xué)發(fā)光分析儀觀察蛋白條帶。以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。
2.1關(guān)節(jié)內(nèi)注射MIA手術(shù)誘導(dǎo)OA:與MIA注射前比,在關(guān)節(jié)內(nèi)注射MIA后3d,觀察到MIA組膝關(guān)節(jié)的直徑明顯增加;膝關(guān)節(jié)注射側(cè)的MWT和PWTL都降低,差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表1)。而且在21d 同樣觀察到關(guān)節(jié)炎大鼠的疼痛行為,并一直持續(xù)到研究終止(表1)。另外HE染色結(jié)果顯示,與Sham組比,MIA組中炎性浸潤(rùn)明顯增加,關(guān)節(jié)軟骨層明顯減少缺損(圖1A)。另外,MIA組軟骨中PGE2、TNF-α、IL-1β的水平也都高于sham組(P<0.05,圖1B-1D)。以上結(jié)果說明成功構(gòu)建了OA炎性模型。
表1 OA大鼠痛覺和關(guān)節(jié)腫脹
圖1 OA大鼠的組織炎癥檢測(cè)
2.2OA大鼠中LncRNA uc.48+和P2X7R表達(dá)升高:通過qPCR分析OA大鼠軟骨組織中LncRNA uc.48+的表達(dá)。,在MIA注射后1d、3d、7d,21d軟骨組織LncRNA uc.48+的表達(dá)持續(xù)升高。另外,軟骨組織P2X7R的表達(dá)同樣在1d、3d、7d、21d上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2A和2B)。
2.3軟骨細(xì)胞中過表達(dá)LncRNA uc.48+促進(jìn)P2X7R表達(dá)上調(diào)以及的NF-κB的激活:培養(yǎng)軟骨細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染pc-LncRNA uc.48+組中,觀察到LncRNA uc.48+表達(dá)高于pc-null組(t=22.796;P=0.013)。另外,軟骨細(xì)胞pc-LncRNA uc.48+組中P2X7R、P65、p-P65的蛋白水平都明顯高于pc-null組(t=18.366、26.112、19.984;P=0.009、0.019、0.002)。見圖3、表2。
表2 LncRNA uc.48+過表達(dá)對(duì)P2X7R和NF-κB激活的影響
2.4過表達(dá)LncRNA uc.48+通過上調(diào)P2X7R/NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)軟骨炎癥因子表達(dá):膝關(guān)節(jié)注射過表達(dá)質(zhì)粒pc-LncRNA uc.48+,觀察到pc-LncRNA uc.48+組軟骨組織中P2X7R、P65、p-P65水平都高于pc-null組(t=19.260、17.524、20.069;P=0.008、0.013、0.002)。當(dāng)pc-LncRNA uc.48+聯(lián)合注射P2X7R的拮抗劑AZD9056(pc-LncRNA uc.48+AZD9056)或者聯(lián)合NF-κB抑制劑Helenalin時(shí)(pc-LncRNA uc.48+Helenalin),pc-LncRNA uc.48+AZD9056組軟骨組織中P65和p-P65水平較pc-LncRNA uc.48+組降低(t=12.559,22.581;P=0.016、0.003);而且,pc-LncRNA uc.48+Helenalin組的P2X7R表達(dá)與pc-LncRNA uc.48+組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意(t=1.152、0.172)。這說明OA中抑制P2X7R可調(diào)節(jié)NF-κB的激活。膝關(guān)節(jié)注射過表達(dá)質(zhì)粒pc-LncRNA uc.48+,我們觀察到pc-LncRNA uc.48+組的TNF-α、PGE2、IL-1β水平都高于pc-null組(t=15.669、22.631、16.918;P=0.002、0.001、0.005)。然而,pc-LncRNA uc.48+AZD9056組軟骨中IL-1β,PGE2和TNF-α的濃度較pc-LncRNA uc.48+組降低(t=14.925、18.008、16.251;P=0.006、0.004、0.008);而且pc-LncRNA uc.48+Helenalin組軟骨中IL-1β,PGE2和TNF-α的濃度較pc-LncRNA uc.48+組也同樣降低(t=15.339、21.063、15.921;P=0.005、0.009、0.007)。見表3、圖4。
表3 LncRNA uc.48+過表達(dá)對(duì)OA軟骨組織P2X7R和NF-κB激活的影響
2.5過表達(dá)LncRNA uc.48+通過上調(diào)P2X7R/NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)SP和MMP-13表達(dá):膝關(guān)節(jié)注射過表達(dá)質(zhì)粒pc-LncRNA uc.48+,結(jié)果觀察到pc-LncRNA uc.48+組的關(guān)節(jié)軟骨組織SP和MMP-13水平都高于pc-null組(t=18.298、17.602;P=0.001、0.004)。pc-LncRNA uc.48+AZD9056組軟骨組織中SP和MMP-13水平都較pc-LncRNA uc.48+組降低(t=17.086,20.063;P=0.005、0.014);而且,pc-LncRNA uc.48+Helenalin組的SP和MMP-13表達(dá)水平較pc-LncRNA uc.48+組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(t=18.642、19.466;0.029、0.015)。
圖2 OA大鼠中LncRNA uc.48+和P2X7R表達(dá)升高
圖3 大鼠軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染pc-LncRNA uc.48+后對(duì)P2X7R和NF-κB激活的影響
圖4 過表達(dá)LncRNA uc.48+通過上調(diào)P2X7R/NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)OA的炎癥
本研究在MIA誘導(dǎo)的大鼠OA模型中觀察到LncRNA uc.48+和P2X7R mRNA的表達(dá)增加。而且LncRNA uc.48+上調(diào)了軟骨細(xì)胞中的P2X7R。使用P2X7R選擇性拮抗劑AZD9056下調(diào)了由MIA或MIA聯(lián)合LncRNA uc.48+引起軟骨組織炎癥因子IL-β,PGE2和TNF-α、MMP-13、SP的表達(dá)。另外,我們觀察到LncRNA uc.48+激活了NF-κB信號(hào)。而且,NF-κB信號(hào)抑制劑Helenali也下調(diào)了由MIA或MIA聯(lián)合LncRNA uc.48+引起軟骨組織炎癥因子IL-β,PGE2和TNF-α、MMP-13、SP的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)了LncRNA uc.48+MIA誘導(dǎo)的OA大鼠中具有加重OA炎癥的作用。我們的研究結(jié)果表明LncRNA uc.48+可以調(diào)節(jié)OA炎癥,通過上調(diào)P2X7R激活NF-κB信號(hào)通路可能是其關(guān)鍵機(jī)制之一。
LncRNA的差異表達(dá)具有重要的細(xì)胞調(diào)節(jié)功能[10]。本研究的qRT-PCR結(jié)果表明MIA組大鼠軟骨組織中LncRNA uc.48+的表達(dá)水平明顯高于sham組。而且本研究使用pcDNA3.1質(zhì)粒過表達(dá)了LncRNA uc.48+,觀察到MIA組大鼠的軟骨組織炎癥因子水平IL-β和TNF-α都明顯上調(diào)。之前的研究結(jié)果也證實(shí)了LncRNA uc.48+的促炎作用,該研究證實(shí)注射siRNA沉默uc.48+后可以下調(diào)糖尿病小鼠IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平[6]。表明LncRNA uc.48+可能是一種促炎基因,可作為緩解疾病炎癥狀態(tài)的重要候選靶點(diǎn)。
以往研究表明,使用LncRNA uc.48+siRNA沉默uc.48+可以調(diào)節(jié)RAW264.7巨噬細(xì)胞的免疫和炎癥反應(yīng),從而影響這些作用的過程和結(jié)果,而且這些作用和結(jié)果由P2X7R介導(dǎo)[7]。在本研究中,通過體外軟骨細(xì)胞過表達(dá)LncRNA uc.48+,我們也觀察到了其對(duì)軟骨細(xì)胞P2X7R表達(dá)水平的促進(jìn)作用。AZD9056是一種選擇性P2X7R拮抗劑。最近的證據(jù)表明,AZD9056具有抗炎特性并可以抑制臨床疼痛。我們的數(shù)據(jù)證實(shí),持續(xù)使用AZD9056可以起到消除MIA引起的炎癥反應(yīng)作用,此外,研究表明AZD9056藥物作用可以抑制炎癥因子,保護(hù)滑膜組織并防止RA哺乳動(dòng)物的軟骨基質(zhì)降解[11]。Zheng L等[12]從OA患者獲得的軟骨細(xì)胞中觀察到IL-1β,TNF-α,PGE2會(huì)主動(dòng)產(chǎn)生,滑膜炎性介質(zhì)也會(huì)擴(kuò)散到軟骨中。本研究結(jié)果顯示MIA模型中LncRNA uc.48+過表達(dá)后IL-1β、TNF-α、PGE2的表達(dá)繼續(xù)增加,而AZD9056可以阻止IL-1β、TNF-α、PGE2的上升。這些結(jié)果暗示LncRNA uc.48+通過調(diào)控P2X7R在炎癥誘導(dǎo)的OA的調(diào)節(jié)中起重要作用。
MMP-13在人OA患者的軟骨中特異性表達(dá),但在正常的成人軟骨中不存在,是OA軟骨中的主要膠原酶。在OA過程中,MMP-13被認(rèn)為是OA誘導(dǎo)的軟骨變性的標(biāo)志物[13]。本研究我們也證實(shí)了LncRNA uc.48+可以上調(diào)OA中的MMP-13。而且,通過在大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)關(guān)節(jié)內(nèi)注射AZD9056,抑制OA大鼠MMP-13的上調(diào)。另外,SP是OA中一個(gè)關(guān)鍵的促炎指標(biāo),將SP注射進(jìn)入大鼠關(guān)節(jié)中可增加OA的炎癥程度,本研究我們也證實(shí)了LncRNA uc.48+可以進(jìn)一步上調(diào)OA軟骨中的SP,而AZD9056同樣抑制了OA大鼠軟骨中SP的表達(dá)。
NF-κB途徑是干預(yù)炎性疾病最有吸引力的靶標(biāo)之一。當(dāng)軟骨細(xì)胞被IL-1β刺激時(shí),NF-κB途徑發(fā)生激活,而本研究觀察到過表達(dá)LncRNA uc.48+與IL-1β具有類似的效果,可以使NF-κB途徑發(fā)生激活。研究發(fā)現(xiàn),P2X7R可以觸發(fā)NF-κB信號(hào)通路,其激活與炎癥性疾病密切相關(guān)[14]。使用NF-κB信號(hào)抑制劑Helenalin抑制過表達(dá)LncRNA uc.48+對(duì)MMP-13,SP,IL-1β,PGE2和TNF-α的促進(jìn)作用,但是Helenalin并未抑制P2X7R,說明P2X7R處于NF-κB的上游。這符合以前研究中獲得的結(jié)論[15]。我們的數(shù)據(jù)表明,LncRNA uc.48+上調(diào)P2X7R可能通過靶向NF-κB途徑來調(diào)節(jié)OA的炎癥反應(yīng)。
綜上所述,MIA誘導(dǎo)OA過程中LncRNA uc.48+的表達(dá)增加,并且LncRNA uc.48+可以通過P2X7R/NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)OA炎癥,說明LncRNA uc.48+是一種關(guān)鍵的OA炎癥誘導(dǎo)基因。因此,本研究提供為OA的診斷和治療提供了新的分子靶點(diǎn)。