黃鈺媛, 韋雪梅, 鄭育秀, 劉麗麗

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院麻醉科, 海南 ?？?570311)

神經(jīng)性疼痛(Neuropathic pain)是軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)損害或功能障礙引起的疼痛,屬于常見的慢性頑固性疼痛。由于神經(jīng)性疼痛病因復(fù)雜,當(dāng)前針對(duì)神經(jīng)性疼痛的治療藥物有限,使得該疾病仍無法得到有效控制,對(duì)患者身體健康及生活質(zhì)量產(chǎn)生持續(xù)性危害[1]。因此,探尋治療神經(jīng)性疼痛的有效藥物和靶點(diǎn),仍然是臨床亟需解決的難題。相關(guān)研究表明[2],周圍神經(jīng)受損后,膠質(zhì)細(xì)胞被激活,隨后分泌的大量促炎介質(zhì)引起的神經(jīng)炎癥反應(yīng)是神經(jīng)性疼痛發(fā)生、發(fā)展的重要因素。因此,抑制炎癥反應(yīng)可能成為神經(jīng)性疼痛治療的潛在途徑。烏司他丁(Ulinastatin,UTI)是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑,在臨床上被廣泛用作消炎藥。研究發(fā)現(xiàn)[3],UTI可抑制炎癥介質(zhì)的釋放、降低過氧化物酶和氧自由基水平,從而發(fā)揮心、肝、腎等多臟器保護(hù)作用。同時(shí),UTI還能夠減輕腦損傷及神經(jīng)功能損傷,具有神經(jīng)保護(hù)作用[4]。但目前關(guān)于UTI作用于神經(jīng)性疼痛的研究報(bào)道較少,因此,本研究建立慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎(chronic constriction injury,CCI)大鼠模型,旨在探究UTI對(duì)神經(jīng)性疼痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性SD大鼠40只,體重220～250g。飼養(yǎng)環(huán)境室溫為22～24℃,相對(duì)濕度45～55%,每日明暗交替各12h,標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),自由飲水、進(jìn)食。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均按照國(guó)際疼痛研究協(xié)會(huì)和國(guó)家動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)要求進(jìn)行,嚴(yán)格遵循“3R”原則,實(shí)驗(yàn)中盡量減少動(dòng)物痛苦與用量。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑和儀器:UTI注射液(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H19990133)；他克莫司(FK506)(安斯泰來制藥(中國(guó))有限公司,注冊(cè)證號(hào)H20020377)；水合氯醛、多聚甲醛(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(默沙克生物科技有限公司)；蘇木精-伊紅染色法(HE)試劑盒、原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)試劑盒、RIPA裂解液、二辛可寧酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；兔抗鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin,CN)抗體、兔抗白介素-10(interleukin-10,IL-10)抗體、兔抗β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(美國(guó)Abcam公司)；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence,ECL)(上海時(shí)代生物科技有限公司)。JZ-BME-410C熱痛刺激儀(北京九州晟欣科技有限公司)；Von-Frey纖維絲測(cè)痛儀(美國(guó)North Coast公司)；CM3050S切片機(jī)(德國(guó)徠卡)；LD-96A酶標(biāo)儀(山東萊恩德智能科技有限公司)；CKX53光學(xué)顯微鏡、IXTI-12FL/PH熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；1658001型垂直電泳儀、1703930轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；FCM凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)protein simple公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組和CCI大鼠模型制備:將40只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后,隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(CCI組)、UTI組、UTI+FK506組,每組10只。CCI組、UTI組、UTI+FK506組大鼠根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]進(jìn)行造模,將大鼠俯臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái),10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉,選取大鼠左后肢備皮、消毒,沿大鼠左外側(cè)大腿皮膚切口,鈍性分離大腿肌肉組織,使坐骨神經(jīng)干完全暴露,在坐骨神經(jīng)干上用4-0鉻制羊腸線做4圈環(huán)形結(jié)扎,每圈間距約1mm,結(jié)扎強(qiáng)度以引起大腿肌肉或足趾輕度顫動(dòng)反應(yīng)為宜,復(fù)位坐骨神經(jīng),縫合皮膚,注射青霉素鈉預(yù)防感染。術(shù)后24h內(nèi)大鼠表現(xiàn)出明顯的疼痛行為學(xué)變化,包括機(jī)械痛敏、熱痛敏等,出現(xiàn)術(shù)側(cè)爪內(nèi)收同時(shí)后足輕度外翻和跛行等自發(fā)性疼痛表現(xiàn)和坐骨神經(jīng)病理性損傷,即表示模型建立成功。Sham組大鼠同上述操作,只暴露坐骨神經(jīng)干但不結(jié)扎。

1.3.2動(dòng)物給藥:造模后進(jìn)行給藥處理,UTI組大鼠腹腔注射UTI 10萬U/kg,UTI+FK506組大鼠腹腔注射UTI 10萬U/kg和2 mg/kg FK506, Sham組和CCI組大鼠分別腹腔注射等量生理鹽水。各組動(dòng)物均每天給藥1次,連續(xù)給藥7d。

1.3.3機(jī)械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold,MWT)的測(cè)定:采用Up-Down法測(cè)定大鼠機(jī)械痛閾的行為學(xué)。將各組大鼠單獨(dú)置于透明隔板隔開的金屬網(wǎng)格籠中,大鼠適應(yīng)環(huán)境30min,待大鼠活動(dòng)基本消失后,利用不同級(jí)別壓力系數(shù)的Von-Frey纖維絲測(cè)痛儀刺激大鼠足底中外側(cè),逐漸加壓使刺激針彎曲呈90度,維持5s的刺激時(shí)間。若大鼠出現(xiàn)抬足或舔舐足底的行為,則記為陽性反應(yīng)。連續(xù)刺激時(shí),測(cè)量間隔時(shí)間為5min。分別檢測(cè)各組大鼠術(shù)前1d、術(shù)后3、7、10、14d的MWT。

1.3.4熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency,TWL)的測(cè)定:將各組大鼠單獨(dú)置于有機(jī)玻璃間隔的玻璃板(厚度2 mm)上,大鼠適應(yīng)環(huán)境30 min,將熱痛刺激儀置于玻璃板下方,并對(duì)準(zhǔn)大鼠后爪掌面正中,啟動(dòng)刺激儀,當(dāng)大鼠抬足或舔舐足底時(shí),停止計(jì)時(shí),儀器顯示的時(shí)間即為為TWL。每只大鼠測(cè)定5次,每次間隔10min,取5次平均值。分別檢測(cè)各組大鼠術(shù)前1d、術(shù)后3、7、10、14d的TWL。

1.3.5組織取材及處理:術(shù)后第14天疼痛指標(biāo)測(cè)量結(jié)束后,腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠,斷頸處死,快速取出各組大鼠術(shù)側(cè)坐骨神經(jīng),一部分坐骨神經(jīng)標(biāo)本固定于4%多聚甲醛中,一部分坐骨神經(jīng)標(biāo)本置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6HE染色法檢測(cè)大鼠坐骨神經(jīng)組織形態(tài)學(xué)變化:將保存于4%多聚甲醛中固定的大鼠坐骨神經(jīng)組織標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋、切片,切片厚度為5μm,將各組大鼠坐骨神經(jīng)切片用蘇木精染液染色5min,蒸餾水洗去染色液,1%鹽酸乙醇3s,蒸餾水洗滌后,用伊紅染液染色2min,依次侵入70%、80%、90%、100%乙醇中脫水10s,然后用二甲苯透明5min,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察拍照。

1.3.7ELISA法檢測(cè)大鼠坐骨神經(jīng)組織中炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平:取-80℃冰箱保存?zhèn)溆玫母鹘M大鼠坐骨神經(jīng)標(biāo)本,加入生理鹽水,在4℃條件下勻漿制成10%勻漿液,10000r/min離心10min,收集上清液,嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)酶標(biāo)儀上讀取的樣品值計(jì)算IL-6、IL-1β、TNF-α的含量。

1.3.8TUNEL法檢測(cè)大鼠坐骨神經(jīng)組織細(xì)胞凋亡情況:取各組大鼠坐骨神經(jīng)組織石蠟切片,二甲苯脫蠟,梯度乙醇脫水,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5min,用吸水紙吸干多余液體,37℃下加入蛋白酶K工作液處理組織30min,PBS漂洗3次×5min,每個(gè)標(biāo)本上滴加50μL TUNEL反應(yīng)混合液,置入濕盒中,37℃避光反應(yīng)60min,PBS漂洗3次×5min,滴加50μL Converter-POD轉(zhuǎn)化劑,置入濕盒中,37℃避光反應(yīng)30min,PBS洗滌3次×5min,DAPI染色液染色細(xì)胞核,室溫避光反應(yīng)10min；用DAB顯色,蘇木素復(fù)染,自來水沖洗反藍(lán),常規(guī)脫水透明,加適量抗熒光淬滅劑封片,倒置熒光顯微鏡下觀察拍照,DAPI標(biāo)記的正常細(xì)胞核呈藍(lán)色,細(xì)胞核中紅色顆粒為凋亡細(xì)胞,記錄細(xì)胞凋亡情況,計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.9Western blot法檢測(cè)大鼠坐骨神經(jīng)組織CN和IL-10蛋白表達(dá)水平:取-80℃冰箱保存?zhèn)溆玫母鹘M大鼠坐骨神經(jīng)組織標(biāo)本,用RIPA裂解液提取組織總蛋白,采用BCA法進(jìn)行蛋白定量,蛋白樣品水浴煮沸變性5min,采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)電泳分離,濕法轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF),將膜置于含5 %脫脂牛奶的封閉液中室溫封閉2h,分別加入CN一抗(1∶500)、IL-10一抗(1∶500)、β-actin一抗(1∶1000),4℃孵育過夜,Tris鹽酸緩沖液(tris buffered saline tween,TBST)洗膜3次×10min,加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1∶2000),37℃孵育1h,TBST洗滌3次×10min,加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影,以β-actin為內(nèi)參,采用凝膠成像系統(tǒng)儀分析目的蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1UTI對(duì)神經(jīng)性疼痛大鼠MWT和TWL的影響:與Sham組相比,CCI組大鼠術(shù)后3、7、10、14d術(shù)側(cè)MWT和TWL值明顯降低(P<0.05)；與CCI組相比,UTI組大鼠術(shù)后3、7、10、14d術(shù)側(cè)MWT和TWL值明顯升高(P<0.05)；與UTI組比較,UTI+FK506組術(shù)后3、7、10、14d術(shù)側(cè)MWT和TWL值明顯降低(P<0.05)(見圖1A和B)。

2.2UTI對(duì)神經(jīng)性疼痛大鼠坐骨神經(jīng)組織形態(tài)學(xué)的影響:HE染色結(jié)果顯示,Sham組大鼠坐骨神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)完整、排列整齊、形態(tài)正常,無明顯炎癥反應(yīng)；CCI組大鼠坐骨神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)紊亂、分布不均勻、神經(jīng)纖維密度降低,呈收縮狀或空泡狀,炎性浸潤(rùn)及水腫明顯；UTI組和UTI+FK506組大鼠坐骨神經(jīng)組織形態(tài)學(xué)有一定改善,其中UTI組大鼠坐骨神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)較整齊、分布較均勻、神經(jīng)纖維空泡樣變性減少,密度增加,水腫面積明顯減少,改善效果較UTI+FK506組更為顯著(見圖2)。

圖1 UTI對(duì)神經(jīng)性疼痛大鼠MWT和TWL的影響

圖2 UTI對(duì)神經(jīng)性疼痛大鼠坐骨神經(jīng)組織形態(tài)學(xué)的影響(HE染色,×200)

2.3UTI對(duì)神經(jīng)性疼痛大鼠炎性因子水平的影響:與Sham組相比,CCI組大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平明顯升高(P<0.05)；與CCI組相比,UTI組大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平明顯降低(P<0.05)；與UTI組比較,UTI+FK506組大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平明顯升高(P<0.05),見表1。

表1 UTI對(duì)神經(jīng)性疼痛大鼠炎性因子水平的影響

2.4UTI對(duì)神經(jīng)性疼痛大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響:與Sham組相比,CCI組大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與CCI組相比,UTI組大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；而UTI+FK506組大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡率較UTI組明顯升高(P<0.05)(見圖3)。

圖3 UTI對(duì)神經(jīng)性疼痛大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響(TUNEL染色,×200)

2.5UTI對(duì)神經(jīng)性疼痛大鼠CN和IL-10蛋白表達(dá)的影響:與Sham組相比,CCI組大鼠CN和IL-10蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.05)；與CCI組相比,UTI組大鼠CN和IL-10蛋白表達(dá)量明顯升高(P>0.05)；而UTI+FK506組大鼠CN和IL-10蛋白表達(dá)量較UTI組明顯降低(P<0.05)(見圖4)。

圖4 UTI對(duì)神經(jīng)性疼痛大鼠CN和IL-10蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

神經(jīng)性疼痛發(fā)病率在普通人群中約占7%～10%左右,該疾病通常以刺痛、灼熱痛等自發(fā)性疼痛及痛覺異常、痛覺超敏等刺激誘發(fā)樣疼痛為主要表現(xiàn),且具有易反復(fù)、持續(xù)性發(fā)作的特點(diǎn),嚴(yán)重影響患者日常生活和工作,已成為世界性的公共衛(wèi)生難題。而當(dāng)前臨床上尚無徹底治愈神經(jīng)性疼痛的方法。UTI作為一種蛋白酶抑制劑,研究證實(shí)其通過抗炎、清除氧自由基等發(fā)揮對(duì)神經(jīng)損傷、脊髓損傷及重要臟器等的保護(hù)功能,是一種強(qiáng)效的抗炎、抗氧化劑[6]。Nie等[7]報(bào)道,右美托咪定和UTI對(duì)長(zhǎng)春新堿所致大鼠神經(jīng)性疼痛具有協(xié)同鎮(zhèn)痛效果,作用機(jī)制可能與調(diào)控α2-腎上腺素能受體(α2-AR)和IL-10表達(dá)相關(guān)。但UTI作用于神經(jīng)性疼痛的分子機(jī)制尚未完全明確。本研究建立CCI大鼠模型,觀察UTI對(duì)坐骨神經(jīng)損傷所致神經(jīng)性疼痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。結(jié)果顯示,CCI模型大鼠術(shù)后3、7、10、14d術(shù)側(cè)MWT和TWL顯著性降低,同時(shí)HE結(jié)果顯示,CCI組大鼠坐骨神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)紊亂、分布不均勻、神經(jīng)纖維密度降低,呈收縮狀或空泡狀,存在明顯的炎性浸潤(rùn)及水腫現(xiàn)象,表明CCI大鼠模型建立成功。UTI則對(duì)CCI誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛大鼠機(jī)械痛敏、熱痛敏和坐骨神經(jīng)組織病理性損傷具有一定改善作用。

神經(jīng)性疼痛動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)表明[8],促炎細(xì)胞因子在神經(jīng)性疼痛的發(fā)病過程中起著非常重要的作用,其中TNF-α、IL-6、IL-1β作為主要的促炎因子介導(dǎo)了神經(jīng)性疼痛的發(fā)生和維持。而過度的炎癥反應(yīng)刺激會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)中氧化應(yīng)激水平增高,進(jìn)而引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡,加劇神經(jīng)性疼痛。已有研究表明[9],抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡能夠緩解神經(jīng)性疼痛癥狀。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),UTI可顯著降低神經(jīng)性疼痛大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平,減輕神經(jīng)性疼痛大鼠的炎癥反應(yīng),進(jìn)而改善神經(jīng)性疼痛大鼠坐骨神經(jīng)中細(xì)胞凋亡情況,最終緩解CCI誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛。

鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin,CN)廣泛分布于哺乳動(dòng)物的腦、心臟、肝臟、骨骼肌等各種組織中,其在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)水平比其他部位高10～20倍。CN參與神經(jīng)系統(tǒng)痛覺調(diào)節(jié),脊髓背角內(nèi)CN的缺失可導(dǎo)致CCI引起的神經(jīng)性疼痛,而鞘內(nèi)注射外源性CN則能逆轉(zhuǎn)神經(jīng)性疼痛引起的機(jī)械性疼痛和熱痛覺過敏[10]。Boubali等[11]報(bào)道,CN通過激活肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2(MEF2)和活化T細(xì)胞核因子(NFAT)調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子基因的表達(dá),而MEF2是T淋巴細(xì)胞中IL-10基因轉(zhuǎn)錄的重要靶點(diǎn)。提示CN可調(diào)控IL-10的產(chǎn)生。IL-10作為一種抗炎細(xì)胞因子,在炎癥過程中起負(fù)向調(diào)控作用,能夠有效抑制所有促炎因子的合成及其生理作用。相關(guān)研究表明[12],IL-10在神經(jīng)性疼痛中表達(dá)降低,而外源性注射IL-10能夠緩解神經(jīng)性疼痛。本研究為探究神經(jīng)性疼痛中UTI與CN、IL-10的關(guān)系,采用Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示,UTI可顯著上調(diào)CCI誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛大鼠坐骨神經(jīng)組織中CN和IL-10蛋白表達(dá)量。而CN抑制劑FK506可顯著減弱UTI對(duì)神經(jīng)性疼痛大鼠的作用效果以及對(duì)CN、IL-10蛋白表達(dá)量的調(diào)控作用。提示UTI可能通過調(diào)控CN/IL-10信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)神經(jīng)性疼痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。

綜上所述,UTI可通過減輕炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡緩解神經(jīng)性疼痛,其作用機(jī)制可能與調(diào)控CN/IL-10信號(hào)通路有關(guān)。本研究為神經(jīng)性疼痛的治療提供了新的候選藥物和潛在靶點(diǎn)。關(guān)于UTI對(duì)神經(jīng)性疼痛的鎮(zhèn)痛作用是否存在其他機(jī)制,以及UTI作用于神經(jīng)性疼痛的適宜劑量,還需進(jìn)一步探索研究。