楊曉蕾，李建宏，姚 拓，梅麗娜，李 琦，白 潔，朱青青，趙曉倩，趙樹棟

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/ 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730070；2.涼州區(qū)畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣,甘肅 武威 733000）

植物根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)是指能夠在植物根際大量定殖，有效促進(jìn)植物生長發(fā)育，并抑制病原菌生長的微生物[1]。長期探索已發(fā)現(xiàn)諸多優(yōu)質(zhì)菌種資源[2-4]，利用優(yōu)質(zhì)PGPR 菌株研制微生物菌劑，與化肥配施，能有效降低化肥使用，提高作物產(chǎn)量[3-5]。

植物根際促生菌作為戰(zhàn)略性微生物資源，利用其進(jìn)行微生物菌劑開發(fā)目前已得到廣泛應(yīng)用。菌劑促生效果明顯，能夠通過改善植株生長的環(huán)境條件，對植物生長和產(chǎn)量的提高有非常明顯的作用[6]。為了響應(yīng)國家雙減政策[7]，應(yīng)全面考慮發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)和保護(hù)生態(tài)環(huán)境，以微生物菌劑代替部分化肥，既改善了生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)了植物的生長，提高植物抗逆性，同時又改良土壤，提高土壤微生物多樣性、透氣性和對水的吸收能力，有效保護(hù)土壤肥力等，成為提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量以及保護(hù)生態(tài)環(huán)境的關(guān)鍵[8]。

微生物菌劑中活菌數(shù)是決定菌劑質(zhì)量的關(guān)鍵，但工業(yè)化發(fā)酵工藝與技術(shù)發(fā)展存在一定弊端。生物發(fā)酵是指應(yīng)用某種技術(shù)、培養(yǎng)裝置、現(xiàn)代化技術(shù)和設(shè)施，大大提高微生物細(xì)胞的密度，使其有共同的良好生長狀況，從而縮短微生物生長時間，減少培養(yǎng)所需區(qū)域的面積和體積，提高產(chǎn)品的產(chǎn)量和有效利用率，利用現(xiàn)代技術(shù)提高產(chǎn)品的未來增長量和增長率。利用發(fā)酵技術(shù)，可達(dá)到降低成本、提升質(zhì)量的目的[9]。例如，對枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HS5B5進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，針對該菌株進(jìn)行培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化后，該菌株的細(xì)菌總數(shù)為9.2×108CFU·g-1，有效提高了菌液中有效活菌數(shù)[10]；但目前對于植物根際促生菌菌株工業(yè)發(fā)酵運(yùn)用研究報(bào)道較少，系統(tǒng)性對菌株生長特性研究不全面。因此，利用工業(yè)發(fā)酵技術(shù)，提高菌劑中活菌數(shù)量勢在必行。

本研究以從武威天祝藏族自治縣采集的珠芽蓼(Polygonum viviparum)、洽草(Koeleria glauca)、草地早熟禾(Poa pratensis)及蘭州市七里河區(qū)采集的紅三葉(Trifolium pratense)根際分離的菌株為對象，對其促生特性進(jìn)行測定，同時進(jìn)行生長特性指標(biāo)測定，探究菌株對溫度、pH 的耐受性以及生長過程中產(chǎn)氣產(chǎn)酸特性，利用16S rDNA 確定菌株分類學(xué)地位，為后期利用高密度發(fā)酵技術(shù)，工業(yè)化生產(chǎn)菌劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

將研究前期從植物根際分離獲得的保藏于安瓿瓶中的細(xì)菌活化，接種于LB 培養(yǎng)基，將菌株于4 ℃下保存?zhèn)溆?。菌株信息如? 所列。

表1 供試菌株Table 1 Tested strains

1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基[11]：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉(NaCl) 2 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0 (固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉 18.0 g)。

無機(jī)磷NBRIP (national botanical research institute’s phosphate)培養(yǎng)基[12]：葡萄糖10 g，磷酸鈣[Ca3(PO4)2]5 g，六水合氯化鎂(MgCl2·6H2O) 5 g，七水合硫酸鎂(Mg SO4·7H2O) 0.25 g，氯化鉀(KCl) 0.2 g；硫酸銨[(NH4)2SO4] 0.1 g，蒸餾水1 000 mL；pH 7.0。

有機(jī)磷蒙金娜培養(yǎng)基[13]：四水合硫酸錳(MnSO4·4H2O) 0.03 g，七水合硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O) 0.03 g，碳酸鈣(CaCO3) 5.0 g，葡萄糖(C6H12O6) 10.0 g，硫酸銨[(NH4)2SO4] 0.5 g，大豆卵磷脂 0.2 g，氯化鈉(NaCl)0.3 g，氯化鉀(KCl) 0.3 g，酵母粉 0.4 g，瓊脂粉 18.0 g，蒸餾水 1 000 mL；pH 7.0。

固氮NFM (nitrogen free medium)培養(yǎng)基[14]：二水合氯化鈣(CaCl2·2H2O) 0.02 g，七水合硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 0.2 g，磷酸氫二鉀(K2HPO4) 0.5 g，二水合鉬酸鈉(NaMoO4·2H2O) 0.002 g，氯化鈉(NaCl) 0.1 g，蘋果酸 5.0 g，氫氧化鉀(KOH) 4.5 g，0.5% 溴百里香酚藍(lán)5 mL，瓊脂粉 2 g，蒸餾水1 000 mL；pH 7.0。

King 培養(yǎng)基[15]：蛋白胨20 g，磷酸氫二鉀(K2HPO4)1.15 g，七 水合硫酸鎂(MgSO4·7H2O)1.5 g，丙 三醇(C3H8O3) 15 mL。

1.3 菌株的促生特性測定

在無菌條件下，分別將菌株單菌落接種至盛有25.0 mL NBRIP 和蒙金娜液體培養(yǎng)基的50 mL 三角瓶中，在 28 ℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)12 d，采用鉬藍(lán)比色法(molybdenum blues colorimetry，MBC)，通過制作的磷標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每株菌的溶磷量[12]。

采用乙炔還原法對菌株固氮酶活性進(jìn)行定量測定[16]。用100 μL 平口微量進(jìn)樣器，從血清瓶中分別抽取混合氣體100 μL 快速注入到氣相色譜儀氣體進(jìn)樣柱內(nèi)，記錄并觀察C2H4出峰時間及峰面積百分比，計(jì)算出菌株固氮酶活性。

挑取菌株單菌落接種于盛有已滅菌的 25 mL King液體培養(yǎng)基的 50 mL 三角瓶中，在 28 ℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)12 d。采用Salkowski 比色法，在黑暗下靜置 30 min 后迅速用分光光度計(jì)在波長 530 nm下測定各待測液的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測液的 IAA 濃度(μg·mL-1)[17-18]。

1.4 菌株生長特性指標(biāo)測定

1.4.1 菌株生長曲線測定

將選取的菌株活化培養(yǎng)24 h 后，以2%的接種量LB 培養(yǎng)液中，每4 h 測定菌液D600nm，連續(xù)測至72 h，繪制生長曲線。

1.4.2 菌株對溫度的耐受性

在LB 培養(yǎng)基(pH 7)中接入2%的菌液，分別將其置于16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46 ℃的溫度，180 r·min-1條件下培養(yǎng)，在培養(yǎng)48 h 時取樣，測定菌群生長量(D600nm)。

1.4.3 菌株對pH 的耐受性

配制pH 分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0 的 LB 培養(yǎng)液，將待測菌株培養(yǎng)液2%接種于不同pH 的培養(yǎng)液中，置于28 ℃，180 r·min-1條件下培養(yǎng)48 h，測定菌群生長量(D600nm)。

1.4.4 菌株產(chǎn)氣特性

將菌液以2%的接種量分別接種于裝有杜氏小管的 LB 液體培養(yǎng)基中，過程中排盡杜氏小管中的空氣，確保試驗(yàn)準(zhǔn)確性。在 28 ℃的條件下靜置培養(yǎng)，在12、24、36、48 h 時，進(jìn)行觀察并記錄杜氏小管中的產(chǎn)氣情況[19]。

1.4.5 菌株產(chǎn)酸特性

將選取的菌株活化培養(yǎng)24 h 后，以2%的接種量加入LB 培養(yǎng)液中，每4 h 用pH 計(jì)測定菌液pH，連續(xù)測至72 h。

1.5 菌株分類地位確定

采用細(xì)菌基因組提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit-50)，參考試劑盒說明書提取菌株總DNA，運(yùn)用通用引物27F (5′-GAGTTTGATCCTGGCTCA G-3′)和1492R (5′-TACGGCTACCTTGTTACGACT T-3′) 對16S rDNA 片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[20]；4 ℃條件下進(jìn)行保存，擴(kuò)增產(chǎn)物委托甘肅奧科生物科技有限公司測序，將16S rDNA 序列在EZBioCloud 網(wǎng)站進(jìn)行同源序列比較分析并使用MEGA 7.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖，SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)單因素方差分析，用Duncan 法進(jìn)行數(shù)據(jù)多重比較(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的促生能力

供試菌株中，M1 的有機(jī)磷溶磷量最高，為170.37 μg·mL-1，相比其他幾株菌株，溶解有機(jī)磷效果顯著；而Y3 與Y1 溶解無機(jī)磷能力較強(qiáng)，分別為308.50、102.41 μg·mL-1(表2)。綜上，不同菌株溶解有機(jī)磷能力較弱，溶解無機(jī)磷能力強(qiáng)于溶解有機(jī)磷。菌株中只有Y1 及Y3 具有固氮能力，固氮酶活性分別為175.30、255.55 nmol (C2H4)·(h·mL)-1。供試菌株均具有分泌IAA 的能力，其中菌株Y1 分泌IAA 的能力最高，為164.74 μg·mL-1，菌株Y3 分泌IAA 的能力最低，為24.23 μg·mL-1。

表2 不同菌株促生能力Table 2 Growth-promoting ability of different strains

2.2 菌株的生長特性

2.2.1 菌株生長曲線測定

供試菌株的生長曲線如圖1 所示。轉(zhuǎn)接入LB 液體培養(yǎng)基后，0～6 h 菌株處于生長延滯期，生長速度緩慢。菌株Y3 與Y5 自6 h 起至12 h 的D600nm值呈指數(shù)增長，表明菌株處于生長對數(shù)期，繼續(xù)培養(yǎng)，至48 h 菌株處于穩(wěn)定生長期，48 h 后逐漸進(jìn)入衰亡期。菌株Y1、M1、M6 自6 h 至16 h 為生長對數(shù)期，16 h 至40 h 曲線斜率減小，增殖速度變慢，40 h進(jìn)入生長穩(wěn)定期，在56 h 時，D600nm值減小，表示進(jìn)入菌株衰亡期。

圖1 菌株的生長曲線Figure 1 Growth curves of the bacterial strains

2.2.2 溫度對菌株生長的影響

溫度變化對供試菌株生長的影響表現(xiàn)不同(圖2)。在16 ℃時，枯草芽孢桿菌Y3 和Y5 都停止生長，而到19 ℃，開始有微弱的生長，但生長速率不同。其余3 株菌株在16 ℃時，生長較為明顯。19～25 ℃時，5 株菌株隨著所處生長環(huán)境的溫度升高，D600nm值逐漸增長，生長加快。25～31 ℃，菌株M1 生長受到抑制，其余菌株生長趨于平穩(wěn)，但超過31 ℃，D600nm值均減小，菌株生長受到了抑制。到40 ℃以上，所有菌株的生長都明顯受到了抑制。本研究的供試菌株對溫度具有較好的耐受性，19～37 ℃都能生長，但適宜的生長溫度在 25～31 ℃。

圖2 菌株對溫度的響應(yīng)Figure 2 Temperature curves of the bacterial strains

2.2.3 pH 對菌株生長的影響

隨著pH 的改變，菌株生長速率不斷變化(圖3)。pH 4.0 時，所有菌株生長微弱，D600nm在0.005～0.141，在pH 4.5～5.0，菌株開始快速生長，但不同菌株之間存在差異；在pH 4.5 時，菌株Y1 D600nm值為0.014，而菌株M6 在此時D600nm值為2.898；pH 7.0 時，各菌株的生長速率趨于平穩(wěn)。而各菌株在pH 7.5 時的生長速率和pH 6.5 時生長速率相近，從而推測其最適生長pH 6.5～7.5。當(dāng)pH 繼續(xù)增大，到9.0 以上時，所有菌株D600nm值減小，生長都受到了嚴(yán)重的抑制，pH 10.0 時，除M6 以外，所有菌株基本停止生長。供試菌株對pH 具有相對較好的耐受性，pH 4.5～9.5都能生長，但最適的生長pH為6.5～7.5。

圖3 菌株對pH 的響應(yīng)Figure 3 pH curves of the bacterial strains

2.2.4 菌株生長過程中產(chǎn)氣及產(chǎn)酸現(xiàn)象

利用杜氏小管，將菌液靜置培養(yǎng)72 h，每12 h進(jìn)行觀察，在菌液生長過程中并無氣泡產(chǎn)生，在后期發(fā)酵過程中，菌株自身產(chǎn)氣并不會影響整體溶氧情況，阻礙發(fā)酵過程中菌體生長。而在整個菌株生長過程中，pH 穩(wěn)定在6.23～7.52，Y3 與Y5 pH 維持在7.0 左右，而M1、M6 的pH 維持在6.7 左右。而Y1 的pH 變化較為明顯，在16 h 時為6.23，而在后期生長過程中，pH 逐漸平穩(wěn)，64 h 達(dá)到6.78 (圖4)。

圖4 菌株生長過程中pH 變化Figure 4 Changes in pH during bacterial growth

2.3 供試菌株分類地位確定

通過對供試菌株DNA 的提取及PCR 擴(kuò)增檢測，并測序獲得的序列在EZBioCloud 網(wǎng)站(www.ezbio cloud.net)與進(jìn)行比對分析(圖5)。結(jié)果表明，Y5與Y3 相似，鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，Y1 為蕈狀芽孢桿菌(Bacillus mycoides)，M1 為產(chǎn)黃假單胞菌(Pseudomonas synxantha)，M6 為猴假單胞菌(Pseudomonas simiae)。

圖5 代表菌株 16SrDNA 基因序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 5 Phylogenetic tree constructed by the homology of the 16S rDNA gene sequence

3 討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，供試菌株促生特性存在差異，多數(shù)菌株同時具有溶磷、固氮、分泌激素等多種功能特性。馬文彬等[21]對豆科植物根際促生菌進(jìn)行分離并研究發(fā)現(xiàn)多株菌株具有固氮、溶磷等多種功能特性。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株溶解有機(jī)磷能力普遍比溶解無機(jī)磷能力弱，這一結(jié)果與馬驄毓等[22]和蔣永梅[12]的研究結(jié)果相一致：由于細(xì)菌溶磷的過程復(fù)雜，自然環(huán)境中的碳源物質(zhì)、氮源物質(zhì)和微量元素的種類對菌株的溶磷量都有影響。5 株供試菌株中，M1 溶解有機(jī)磷量能力最強(qiáng)；Y3 和Y1 溶無機(jī)磷能力較高。由于部分細(xì)菌在代謝過程中分泌草酸、乙酸、乳酸等有機(jī)酸，同時與金屬離子進(jìn)行結(jié)合。因此，測定溶磷能力的過程中，這部分的溶磷能力難以被測定出來[23-24]。不同類型PGPR 固氮能力存在差異，本研究中涉及菌株僅有Y1 及Y3 具有固氮能力。其余菌株的固氮酶活性較低，其原因可能由于同一地區(qū)采集的寄主植物種類不同，而不同地區(qū)采集地的土壤質(zhì)量存在差異，高寒地區(qū)與較低海拔城市中植株生長時當(dāng)?shù)氐臏囟?、光照[25]等條件差異較大，導(dǎo)致對菌株固氮酶活性有較大影響，后期有待深入研究其相關(guān)機(jī)理。IAA 作為植物的生長素物質(zhì)[26]，調(diào)控植物生長和發(fā)育過程，參與細(xì)胞分裂、組織分化等過程，由PGPR 菌株產(chǎn)生的IAA可直接影響根系與土壤接觸的表面積，從而有效促進(jìn)植物生長。5 株供試菌株中，均具有分泌IAA 的能力。

PGPR 菌株的發(fā)酵過程復(fù)雜，受到諸多條件的影響，因此將其培養(yǎng)環(huán)境加以優(yōu)化十分關(guān)鍵[27]，生物菌劑的工業(yè)化生產(chǎn)是菌劑應(yīng)用推廣過程中面臨的最大問題。在工業(yè)生產(chǎn)中，有一類微生物對于某方面具有特殊功效或者是產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物具有應(yīng)用價值，同時可運(yùn)用于工業(yè)生產(chǎn)開發(fā)，這類微生物就被稱為工業(yè)微生物[28-29]。所以，鑒別工業(yè)微生物最主要的特征是需要滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求，比如培養(yǎng)條件的滿足度、生長速度、生長穩(wěn)定性和生物安全性等為重要評判準(zhǔn)則[29]。因此，決定菌株進(jìn)入規(guī)?；I(yè)開發(fā)的階段的直接前提是菌株性能的穩(wěn)定性。目前，實(shí)驗(yàn)室對于微生物的研究還著重于菌株的功能特性及功能基因挖掘，利用常規(guī)條件進(jìn)行培養(yǎng)，對菌株的培養(yǎng)條件研究欠缺，從而導(dǎo)致某些試驗(yàn)中研究篩選的菌株在實(shí)驗(yàn)室條件下表現(xiàn)的功能特性非常突出，而在工業(yè)化生產(chǎn)過程中并不適用。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株對溫度具有相對較好的耐受性，19～37 ℃都能生長，但適宜的生長溫度在25～31 ℃；菌株在pH 4.5～9.5 都能生長，但最適的生長pH 為6.5～7.5，對pH 具有相對較好的耐受性。由此表明菌株生長并不局限于常用的生長溫度28 ℃、pH 7.0 的實(shí)驗(yàn)室條件。因此，在微生物的篩選工作中，應(yīng)充分認(rèn)識其生物學(xué)特性，研究并明確培養(yǎng)條件。

通過分子生物學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)，Y1、Y3、Y5 均為芽孢桿菌屬，其繁殖能力強(qiáng)、易存活且具有多種促生功能，常作為生防功能菌被報(bào)道[30]，從而在后期將對供試菌株的生防功能進(jìn)行驗(yàn)證。M1、M6 為假單胞菌屬，而假單胞菌是生防微生物的一個重要種類，也是自然界廣泛分布的微生物之一，由于它繁殖迅速、定殖能力強(qiáng)、營養(yǎng)要求簡單，可以抑制多種植物病害，同時具有促進(jìn)植物生長的作用，被廣泛研究[31]，從而由此可以推斷菌株應(yīng)具有抑制病原菌的能力，在后期研究中對此應(yīng)加以驗(yàn)證。

綜上，5 株供試菌株中，M1 溶解有機(jī)磷量能力最強(qiáng)；Y1 和Y3 溶無機(jī)磷能力較高；Y1 和Y3 具有固氮能力；5 株菌均具有分泌IAA 的能力。通過對菌株生長特性測定，菌株延滯期為0～6 h，在40 h已進(jìn)入生長穩(wěn)定期，適宜的生長溫度在25～31 ℃，適宜的生長pH 范圍在6.5～7.5，生長過程中無產(chǎn)氣現(xiàn)象，生長過程中pH 穩(wěn)定在6.23～7.52。對5 株P(guān)GPR菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，Y3 和Y5 為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，Y1 為蕈狀芽孢桿菌(Bacillus mycoides)，M1為產(chǎn)黃假單胞菌(Pseudomonas synxantha)，M6 為猴假單胞菌(Pseudomonas simiae)。為后期PGPR 菌株工業(yè)化開發(fā)奠定基礎(chǔ)。