朱朝玉，范長(zhǎng)儒，張玉良

(臨沂市腫瘤醫(yī)院普通外科二病區(qū)，山東 臨沂 276034)

在全球范圍內(nèi)，肝癌的發(fā)病率在所有癌癥中排名第六位，在癌癥相關(guān)死亡中排名第二位[1]。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占原發(fā)性肝惡性腫瘤的75%～90%，是肝癌相關(guān)死亡的主要原因[2]。早期HCC的癥狀通常不明顯，當(dāng)癥狀出現(xiàn)時(shí)，大多數(shù)HCC已經(jīng)發(fā)展至晚期。HCC外科治療選擇主要是肝移植和手術(shù)切除，然而，有相當(dāng)數(shù)量的中晚期患者已不適合手術(shù)治療，導(dǎo)致預(yù)后很差[3]。因此，探尋可用于HCC治療的新靶標(biāo)尤為重要。Bcl-2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(bcl-2-associated transcription factor 1，BCLAF1)最初發(fā)現(xiàn)是作為一種能與Bcl-2家族發(fā)生作用的蛋白質(zhì)。多年來(lái)，據(jù)報(bào)道BCLAF1參與多種生物過(guò)程，包括T細(xì)胞活化、肺發(fā)育、溶菌感染程序的控制、DNA損傷和修復(fù)[4-5]，甚至轉(zhuǎn)錄后事件，例如mRNA的剪接加工[6]。此外，BCLAF1基因的突變或異常表達(dá)也與人類(lèi)癌癥密切相關(guān)。盡管大多數(shù)研究表明BCLAF1通過(guò)抑制Bcl-2家族的抗凋亡蛋白發(fā)揮腫瘤抑制因子作用，但最近的一項(xiàng)研究報(bào)道BCLAF1調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞的腫瘤發(fā)生，其敲除能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，過(guò)表達(dá)增強(qiáng)致瘤潛力[7]。本研究通過(guò)敲低BCLAF1，借以探討其對(duì)肝癌SMMC-7221細(xì)胞增殖、侵襲及耐藥性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

肝癌SMMC-7221細(xì)胞(目錄號(hào)：TCHu52)購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)上海中科院細(xì)胞庫(kù)；RNA提取試劑盒(貨號(hào)：ZP401)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：ZR102)、qPCR試劑盒(貨號(hào)：ZF201)購(gòu)買(mǎi)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；引物合成及shRNA-BCLAF1載體構(gòu)建由自上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司完成；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(貨號(hào)：11668019)購(gòu)買(mǎi)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；RPMI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)基(貨號(hào)：31800022 )、胰蛋白酶(貨號(hào)：25200056)購(gòu)買(mǎi)自美國(guó) Gibco 公司；胎牛血清(貨號(hào)：04-001-1ACS)購(gòu)買(mǎi)自以色列 BI 公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：20201ES76)購(gòu)買(mǎi)自上海翊圣生物科技有限公司；兔抗人BCLAF1(貨號(hào)：26809-1-AP)、PI3K(貨號(hào)：67071-1-Ig)、p-PI3K(貨號(hào)：60225-1-Ig)、Akt(貨號(hào)：60203-2-Ig)、p-Akt(貨號(hào)：66444-1-Ig)、β-actin(貨號(hào)：66009-1-Ig)單抗，辣根過(guò)氧化酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG二抗(貨號(hào)：10285-1-AP)購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Proteintech Group公司；MTT檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：ZY2050-500T)購(gòu)買(mǎi)自上海澤葉生物技術(shù)公司；Transwell小室(貨號(hào)：3421)購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Corning公司；索拉非尼(貨號(hào)：Y0002098)購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 取出凍存的SMMC-7221細(xì)胞，置于37 ℃水浴條件下融化，凍存液部分溶解時(shí)取出，在無(wú)菌操作臺(tái)下吸取凍存液加入完全培養(yǎng)基混勻后離心去上清液，加入適量添加有10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，于37 ℃、5%CO2濃度條件下恒溫培養(yǎng)。觀(guān)察培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)到合適狀態(tài)后，按照空白對(duì)照組、shRNA-NC(陰性對(duì)照)組、shRNA-BCLAF1組分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在聚苯乙稀管中制備A液：0.8 μg DNA(空白對(duì)照組無(wú)DNA；shRNA-NC組為shRNA-NC載體：F∶5′-GAAACACAGACGGAGGGAA-3′,R∶5′-TTCCCTCCGTCTGTGTTTC-3′； shRNA-BCLAF1組為shRNA-BCLAF1載體：F∶5′-GAAGGACAGACGCAAGGAA-3′，R∶5′-TTCCTTGCGTCTGTCCTTC-3′，靶向BCLAF1基因編碼序列2733-2751bp)稀釋于50 μL無(wú)血清無(wú)抗生素的培養(yǎng)液中，B液：2 μL Lipofectamine 2 000稀釋于50 μL無(wú)血清無(wú)抗生素的培養(yǎng)液中，輕輕混合A、B液，室溫中置10～15 min；吸去SMMC-7221細(xì)胞培養(yǎng)孔的培養(yǎng)基，用無(wú)血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞兩次；將混合后的A、B液加入培養(yǎng)孔，前后搖動(dòng)培養(yǎng)板使其分布均勻；將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱孵育4～6 h后，可以更換含血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24～48 h后可以觀(guān)察轉(zhuǎn)入基因表達(dá)情況。

1.2.2 qPCR鑒定干擾效果 按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組SMMC-7221細(xì)胞RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，按照qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配置反應(yīng)體系進(jìn)行qPCR，采用2-ΔΔCt法以β-actin作為內(nèi)參計(jì)算BCLAF1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。BCLAF1：F∶5′-AAGGTCTGGGTCTGGTrCTG-3′，R∶5′-GAGCATTCTGTGGTGCGATT-3′，擴(kuò)增片段大小122bp；β-actin：F∶5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，R∶5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAA-3′，擴(kuò)增片段大小185 bp。每組SMMC-7221細(xì)胞重復(fù)3次。

1.2.3 Western blot 鑒定干擾效果 提取各組SMMC-7221細(xì)胞蛋白，使用PBS沖洗細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化處理3～5 min，用完全培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)，重懸細(xì)胞后用PBS清洗兩次，離心棄上清。加入50 μL細(xì)胞裂解液，冰浴條件下超聲粉碎細(xì)胞10 s，重復(fù)3次，離心收集上清液。按照BCA法使用試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；根據(jù)測(cè)量濃度加入相應(yīng)體積的待測(cè)樣品于SDS-PAGE凝膠中，以25 mA恒定電流電泳1～2 h ；將凝膠轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，浸入封閉液中2 h，用TBST清洗膜3次，3 min/次；加入適當(dāng)比例稀釋的BCLAF1蛋白一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST清洗膜3次；加入對(duì)應(yīng)濃度二抗，室溫孵育2 h，TBST清洗膜3次；避光加入ECL發(fā)光染色，使用凝膠成像儀進(jìn)行成像分析。采用TotalLab2.0 進(jìn)行灰度分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量，其相對(duì)表達(dá)水平用目的蛋白條帶灰度與內(nèi)參蛋白條帶灰度的比率表示。每組SMMC-7221細(xì)胞重復(fù)3次。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的上述各組SMMC-7221細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，計(jì)數(shù)后以5×103個(gè)細(xì)胞每孔接種100 μL于96孔板，培養(yǎng)48 h后取出培養(yǎng)細(xì)胞，每孔加入20 μL MTT溶液培養(yǎng)4 h，去除培養(yǎng)基加入150 μL DMSO溶液，搖床震蕩10 min，置于酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices，SpectraMax iD)在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔吸光度值，增殖率=各組吸光度值/空白對(duì)照組吸光度值。每組SMMC-7221細(xì)胞重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 分別將各組SMMC-7221細(xì)胞以1×105個(gè)細(xì)胞每孔接種200 μL于Transwell上腔中，同時(shí)加入500 μL含有10%胎牛血清的RPMI 1 640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。24 h后，吸取Transwell上腔多余液體，PBS清洗3次。棉棒在上腔內(nèi)輕輕旋轉(zhuǎn)以吸去殘留水分，加入結(jié)晶紫染料。5 min后，用自來(lái)水緩慢緩沖去除染料溶液。顯微鏡下觀(guān)察透膜細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)取400×顯微鏡視野5個(gè)，侵襲率=各組透膜細(xì)胞數(shù)/空白對(duì)照組透膜細(xì)胞數(shù)×100%。每組SMMC-7221細(xì)胞重復(fù)3次。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的上述各組SMMC-7221細(xì)胞以1×106個(gè)細(xì)胞每孔接種100 μL于6孔板中，培養(yǎng)至融合率達(dá)到95%后，使用無(wú)菌槍頭尖端垂直于培養(yǎng)皿表面進(jìn)行劃痕，PBS沖洗懸浮細(xì)胞，更換新鮮培養(yǎng)基。分別于劃痕即刻及劃痕培養(yǎng)48 h后置于顯微鏡下觀(guān)察拍照，采用Image J 2.1.4.7對(duì)圖片進(jìn)行分析，根據(jù)公式：細(xì)胞遷移率=(劃痕即刻劃痕寬度-培養(yǎng)48 h后劃痕寬度)/劃痕即刻劃痕寬度×100% 進(jìn)行計(jì)算。每組SMMC-7221細(xì)胞重復(fù)3次。

1.2.7 耐藥性檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的各組SMMC-7221細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，計(jì)數(shù)后以5×103個(gè)細(xì)胞每孔接種于96孔板，分別加入添加有濃度分別為0、4、8、12、16 μmol/L的索拉非尼的新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，方法同1.2.4，在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔吸光度值，根據(jù)公式：細(xì)胞活性(%)=各組各濃度索拉非尼培養(yǎng)條件下吸光度值/各組0 μmol/L的索拉非尼培養(yǎng)條件下吸光度值×100% 計(jì)算細(xì)胞活性。每組SMMC-7221細(xì)胞重復(fù)3次。

1.2.8 Western blot 法檢測(cè)PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)水平 取1.2.7中16 μmol/L索拉非尼處理各組SMMC-7221細(xì)胞，抽提蛋白，按照1.2.3種方法測(cè)定各組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)水平。每組SMMC-7221細(xì)胞重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 shRNA敲除BCLAF1基因表達(dá)效果比較

qPCR結(jié)果顯示，空白對(duì)照組BCLAF1基因相對(duì)表達(dá)量為(1.061±0.042)與shRNA-NC組(0.982±0.034)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；shRNA-BCLAF1組BCLAF1基因相對(duì)表達(dá)量為(0.428±0.038)低于空白對(duì)照組及shRNA-NC組(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，空白對(duì)照組BCLAF1蛋白相對(duì)表達(dá)量(0.978±0.061)與shRNA-NC組(0.991±0.032)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；shRNA-BCLAF1組BCLAF1蛋白相對(duì)表達(dá)量(0.346±0.045)低于空白對(duì)照組及shRNA-NC組(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2 各組SMMC-7221細(xì)胞增殖活性比較

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組SMMC-7221細(xì)胞增殖率為(100.0±0.00)%，與shRNA-NC組(98.26±0.71)%比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；shRNA-BCLAF1組SMMC-7221細(xì)胞增殖率為(64.48±1.34)%，低于空白對(duì)照組及shRNA-NC組(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3 各組SMMC-7221細(xì)胞侵襲能力比較

Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組SMMC-7221細(xì)胞侵襲率為(100.0±0.00)%，與shRNA-NC組(98.25±2.51)%比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；shRNA-BCLAF1組SMMC-7221細(xì)胞侵襲率為(34.59±2.27)%，低于空白對(duì)照組及shRNA-NC組(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.4 各組SMMC-7221細(xì)胞遷移能力比較

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組SMMC-7221細(xì)胞遷移率為(84.61±2.12)%與shRNA-NC組(86.22±1.41)%比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，shRNA-BCLAF1組SMMC-7221細(xì)胞遷移率(34.59±1.62)%，低于空白對(duì)照組及shRNA-NC組(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

2.5 各組SMMC-7221細(xì)胞耐藥性比較

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組各濃度索拉非尼處理?xiàng)l件下SMMC-7221細(xì)胞活性與shRNA-NC組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；shRNA-BCLAF1組各濃度索拉非尼處理?xiàng)l件下SMMC-7221細(xì)胞活性低于空白對(duì)照組及shRNA-NC組(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

2.6 各組索拉非尼處理后PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)情況比較

Western blot結(jié)果顯示，各組PI3K、Akt蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；空白對(duì)照組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比率與shRNA-NC組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；shRNA-BCLAF1組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比率低于空白對(duì)照組及shRNA-NC組(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

3 討論

HCC預(yù)后持續(xù)不良的原因之一是大部分病例診斷已到晚期，缺乏有效的治療方案。盡管對(duì)多種化療和靶向治療藥物進(jìn)行了評(píng)估，但對(duì)晚期HCC疾病唯一被證實(shí)的治療方法是索拉非尼，而且總體生存益處不大。因此，探索HCC發(fā)展機(jī)制、尋找可能的治療靶點(diǎn)有助于改善HCC預(yù)后。

BCLAF1最初被鑒定為腺病毒E1B19K(BCL-2的同系物)的蛋白質(zhì)伴侶。BCLAF1參與對(duì)BCL-2的調(diào)控，通過(guò)與抗凋亡蛋白(如BCL-2)結(jié)合而引起凋亡。然而，其功能仍然令人迷惑，因?yàn)樵谌狈CLAF1的小鼠細(xì)胞中未觀(guān)察到明顯的細(xì)胞凋亡缺陷。此外，BCLAF1可通過(guò)拮抗fbeclin-1和BCL-2的相互作用誘導(dǎo)自噬[8]。最近發(fā)現(xiàn)BCLAF1與幾種人類(lèi)惡性腫瘤有關(guān)。BCLAF1在胰腺導(dǎo)管腺癌、結(jié)腸直腸癌和膀胱癌中上調(diào)，并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[9-10]。BCLAF1在HCC中的臨床意義和功能尚不清楚。Zhou等[11]證明BCLAF1在HCC中經(jīng)常上調(diào)，BCLAF1的上調(diào)與Edmondson分級(jí)、較低的總生存率和不良預(yù)后有關(guān)，表明BCLAF1作為癌基因可能參與HCC發(fā)展。為明確BCLAF1對(duì)HCC的作用，本研究通過(guò)觀(guān)察敲低BCLAF1后對(duì)肝癌SMMC-7221細(xì)胞的影響，探討B(tài)CLAF1在HCC中的功能。qPCR和Western blot結(jié)果顯示，shRNA-BCLAF1組BCLAF1基因、蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)，證明干擾因素明顯抑制BCLAF1表達(dá)。MTT法檢測(cè)結(jié)果表明，shRNA-BCLAF1組SMMC-7221細(xì)胞增殖能力低于空白對(duì)照組及shRNA-NC組(P<0.05)；Transwell檢測(cè)結(jié)果表明，shRNA-BCLAF1組SMMC-7221細(xì)胞侵襲能力低于空白對(duì)照組及shRNA-NC組(P<0.05)；劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，shRNA-BCLAF1組SMMC-7221細(xì)胞遷移能力低于空白對(duì)照組及shRNA-NC組(P<0.05)，與既往研究一致，表明SMMC-7221細(xì)胞在敲低BCLAF1基因表達(dá)后，增殖、侵襲及遷移能力受到抑制，提示BCLAF1在HCC中能促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲及遷移。Mou等[12]報(bào)道，BCLAF1可與lncNEAT1啟動(dòng)子直接相互作用并促進(jìn)lncNEAT1(一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，有助于形成易于癌變的轉(zhuǎn)錄組，促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展)表達(dá)，證明BCLAF1通過(guò)靶向lncRNA NEAT1促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲；Shao等[4]報(bào)道BCLAF1可在缺氧條件下結(jié)合HIF-1α，維持長(zhǎng)期缺氧條件下HIF-1α活性，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。惡性腫瘤較強(qiáng)的增殖及侵襲能力是其發(fā)展與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，提示BCLAF1可作為抑制HCC發(fā)展與轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn)在HCC治療中起作用。

索拉非尼是一種口服多激酶抑制劑，通過(guò)抑制絲氨酸-蘇氨酸激酶BRAF和CRAF、受體酪氨酸激酶、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFRs)和血小板源性生長(zhǎng)因子受體(PDGFR- β)，表現(xiàn)出促凋亡和抑制血管生成作用進(jìn)而抑制HCC增殖發(fā)展[13]。迄今為止，索拉非尼仍是FDA批準(zhǔn)的唯一治療不能切除的晚期HCC的全身藥物。然而，肝癌患者對(duì)索拉非尼的獲得性耐藥是一種普遍現(xiàn)象，限制了其臨床應(yīng)用[14]。Yu等[15]采用Kaplan-Meier生存法分析HCC中BCLAF1與索拉非尼耐藥的相關(guān)性，表明高表達(dá)水平BCLAF1可能導(dǎo)致HCC患者對(duì)索拉非尼耐藥。在本研究中，shRNA-BCLAF1組各濃度索拉非尼處理?xiàng)l件下SMMC-7221細(xì)胞活性降低(P<0.05)，提示敲低BCLAF1能增強(qiáng)HCC細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性，BCLAF1能介導(dǎo)HCC對(duì)索拉非尼耐藥，與前人研究一致。

PI3K / Akt通路是人體內(nèi)至關(guān)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，參與正常的細(xì)胞過(guò)程，例如細(xì)胞存活、增殖和凋亡以及許多生理過(guò)程[16]。然而，這種信號(hào)的異常激活已在包括HCC在內(nèi)的人類(lèi)癌癥中廣泛報(bào)道[17]。此外，許多研究報(bào)告稱(chēng)，PI3K/Akt信號(hào)的異常激活在對(duì)索拉非尼的耐藥性發(fā)展中起關(guān)鍵作用，抑制該途徑可提高索拉非尼在多種人類(lèi)惡性腫瘤中的功效[18]。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt通路抑制劑聯(lián)合索拉非尼表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗HCC效應(yīng)，并與抑制PI3K及Akt磷酸化有關(guān)[19]。在本研究中，索拉非尼處理后，shRNA-BCLAF1組p-PI3K、p-Akt水平降低(P<0.05)，表明敲低BCLAF1能通過(guò)抑制PI3K / Akt通路降低HCC對(duì)索拉非尼耐藥性，提示BCLAF1可能通過(guò)激活PI3K/Akt通路介導(dǎo)索拉非尼耐藥，可將BCLAF1作為糾正HCC索拉非尼耐藥的靶點(diǎn)進(jìn)一步研究以為臨床服務(wù)。

綜上，敲低BCLAF1能抑制肝癌SMMC-7221細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力，并降低對(duì)索拉非尼的耐藥性，機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt通路有關(guān)，但BCLAF1在HCC發(fā)展中的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。