陳昌明，黃釗煒，曾 蘋，姚血明，劉 燦，王 瑩，馬武開

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)發(fā)病機制復雜，包括遺傳因素、環(huán)境因素及免疫功能紊亂等，其中腸道菌群失調(diào)作為重要的環(huán)境因素在RA的發(fā)病及病情進展中發(fā)揮重要作用[1-2]。甲氨蝶呤 (methotrexate, MTX)、來氟米特 (leflunomide, LEF)、硫酸羥氯喹 (hydroxychloroquine sulfate, HCQ) 等傳統(tǒng)抗風濕藥物連用是目前臨床規(guī)范化治療RA的主要方案。锝[99Tc]亞甲基二膦酸鹽注射液已用于RA的臨床治療，且療效較好，克服了傳統(tǒng)抗風濕藥起效慢，不良反應率高的缺點[3]?，F(xiàn)有研究[4]認為腸道菌群與傳統(tǒng)抗風濕藥物及宿主之間存在相互影響作用，而暫無研究锝[99Tc]亞甲基二膦酸鹽注射液對RA患者腸道菌群的影響。因此，該研究主要檢測锝[99Tc]亞甲基二膦酸鹽注射液治療RA前后患者腸道菌群的豐度、物種組成及多樣性，探討腸道菌群與宿主的相互影響，為闡述RA患者腸道菌群的特征及提高RA患者的臨床治療有效性和安全性提供參考。

1 材料與方法

1.1 納入與排除標準納入標準：① 臨床診斷符合2010年ACR/EULAR的RA分類標準[5]，RA患者病情評價 (DAS28評分)>3.2分；② 應用锝[99Tc]亞甲基二膦酸鹽注射液 (成都云克藥業(yè)有限責任公司，A：200527，B：2005309) 進行治療，無用藥禁忌；③ 年齡在75歲以下，行動不受限者。排除標準：① 有胃腸炎、消化道潰瘍、胃腫瘤等嚴重胃腸道病史；② 2個月內(nèi)服用過抗生素、DMARDs、糖皮質(zhì)激素等藥物；③ 2周內(nèi)服用中草藥制劑、微生態(tài)制劑、酸奶等；④ 近期存在不潔飲食或酗酒等特殊飲食習慣；⑤ 合并有高血壓、糖尿病、高脂血癥等嚴重心血管系統(tǒng)疾病或代謝性疾??；⑥ 合并有系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎、多發(fā)性硬化癥等其他自身免疫性疾?。虎?妊娠、哺乳期婦女或精神疾病患者；⑧ 擅自停藥或失訪者。

1.2 病例資料按照納入排除標準篩選2019年9-11月貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院風濕免疫科收治的明確診斷為RA的患者32例，并且使用锝[99Tc]亞甲基二膦酸鹽注射液聯(lián)合MTX (15 mg /周) 進行治療，患者疼痛及活動明顯時，短期應用美洛昔康 (7.5 mg/天)。就診基本信息見表1。本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.3 樣品采集對于符合納入標準的RA患者，根據(jù)患者應用锝[99Tc]亞甲基二膦酸鹽注射液分為治療前組 (A組) 及治療后組 (B組)。收集患者入院第一天糞便樣本，即A組樣本。待給予[99Tc]亞甲基二膦酸鹽注射液治療1個療程 (10 d) 后，收集患者糞便樣本，即B組樣本。

表1 患者就診基本信息

1.4 基因組DNA的提取及上機測序分別用采集勺挑取收集好的糞便樣本中間部分置于無菌管中并置于冰上待用，每個樣本稱取0.2 g分裝于2 ml無菌EP管中，剩余樣本存于-80℃冰箱。采用糞便基因組DNA提取試劑盒 (北京TIANGEN公司, DP328) 提取糞便基因組DNA并利用瓊脂糖電泳檢測基因組DNA的純度。Nanodrop定量后取適量檢測合格的腸道菌群DNA樣本于離心管中，用無菌水稀釋至1 ng/ml用作模板，使用Takara Ex TAq (日本Takara公司) 高保真酶和細菌16S rRNA 高變區(qū)V3-V4引物 (338F: 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′, 806R: 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物使用電泳檢測，檢測后使用磁珠純化，純化后作為二輪PCR模板，并進行二輪PCR擴增，并再次使用電泳檢測，檢測后使用磁珠純化。隨后進行文庫制備、文庫質(zhì)檢及Qubit定量，利用Illumina Hiseq 2500高通量測序平臺對檢測合格的文庫樣本進行16S rRNA測序分析。

1.5 生物信息學分析

1.5.1數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計 使用Trimmomatic (version 0.35)、Flash (version 1.2.11)、split_ibraries (version 1.8.0) 及UCHIME (version 2.4.2) 軟件對測序生成的raw data進行低質(zhì)量部分剪切、拼接、過濾，得到有效數(shù)據(jù) (clean data)。

1.5.2OTU分類 利用 Vsearch (version 2.4.2) 軟件以有效數(shù)據(jù)97%的相似度進行基于序列間相似度的分類單元 (operational taxonomic units, OTU) 聚類，選取豐度最高的序列作為該OUT的代表序列。采用RDP classifier Naive Bayesian 分類算法對代表序列與數(shù)據(jù)庫進行比對注釋，得到OTU的注釋信息。

1.5.3Alpha多樣性分析 Alpha多樣性 (簡稱α多樣性) 指某個群落內(nèi)部或環(huán)境內(nèi)部物種的多樣性，重點關注群落內(nèi)的物種多樣性及均勻度，通過單樣本的多樣性分析來反映樣本內(nèi)微生物群落的豐富度和多樣性，物種豐富度和多樣性主要通過α多樣性指數(shù)(Simpson，Chao1，Shannon，Observed species)來表示。本研究利用α多樣性指數(shù)計算統(tǒng)計法對A、B兩組數(shù)據(jù)進行α多樣性分析，通過計算指數(shù)，采用Wilcoxon rank sum test進行α多樣性指數(shù)差異分析。

1.5.4Beta多樣性分析 Beta 多樣性 (簡稱β多樣性) 指不同環(huán)境條件下群落之間物種組成的相似性及差異性。本研究利用R軟件對Weighted的UniFra距離矩陣分別進行非度量多維尺度分析(nonmetric multidimensional scaling,NMDS)，并用二維排列圖顯示群落樣本的結構分布。

1.5.5群落結構分布 對A、B兩組數(shù)據(jù)在門、綱、目、科、屬、種各個不同的分類層級，進行相對豐度的注釋以及匯總，并進行barplot統(tǒng)計并繪制Circos樣本與物種關系圖。

1.6 統(tǒng)計學處理兩組之間比較如果符合正態(tài)分布且方差齊，采用配對樣本的t檢驗或獨立樣本t檢驗，如果不符合正態(tài)分布采用Wilcoxon rank sum 檢驗或Mann-WhitneyU檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 測序結果本次測序共64個樣本，質(zhì)控之后的干凈標簽數(shù)據(jù)量分布在48 152～51 989之間，clean tags經(jīng)過去除嵌合體得到有效標簽 valid tags (即最終用于分析的數(shù)據(jù)) 數(shù)據(jù)量分布在29 578～49 022 之間，各樣本 OTU個數(shù)分布在331～1 680之間。

2.2 α多樣性分析利用α多樣性指數(shù)Observed species 繪制稀釋曲線：觀察到的物種數(shù)目隨著測序數(shù)量的增加而上升，當隨機抽取序列條數(shù)到6 000至8 000條時，觀察到的物種數(shù)目逐漸趨向于平緩 (圖1A)，提示已有數(shù)據(jù)量合理，可以反映樣本中的物種多樣性；利用Shannon多樣性指數(shù)構建的稀釋曲線：當每個樣本中隨機抽取序列條數(shù)到1 000左右時，曲線則趨向于平坦(圖1B)，說明測序數(shù)據(jù)量足夠，能夠反應樣本中大多數(shù)微生物的多樣性信息。

另外，相較于RA患者治療前，RA患者經(jīng)锝[99Tc]亞甲基二膦酸鹽注射液治療后反應物種豐富度指數(shù)的Chao1及Observed species 指數(shù)有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義，提示RA患者經(jīng)锝[99Tc]亞甲基二膦酸鹽注射液治療后腸道菌群豐富度及多樣性有一定程度的上升 (表2)。

圖1 Observed species指數(shù) (A)、Shannon指數(shù) (B) 的稀釋曲線圖

表2 治療前組與治療后組α多樣性指數(shù)數(shù)據(jù)

2.3 β多樣性分析通過Weighted UniFrac NMDS分析顯示，在兩組之間有一定的重疊，但能形成較能區(qū)分的兩組整體腸道群落結構，并且Stress=0.092<0.2，故此分析較為可靠 (圖2)。

圖2 NMDS分析圖

2.4 RA治療前后腸道菌群差異分析根據(jù)物種注釋結果，選取每個樣品在門、綱、目、科、屬以及種水平上最大豐度排名前15的OUT，生成相對豐度柱形累加圖。從門的水平上看，兩組樣本中檢測到的擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門 (Firmicutes)、變形菌門 (Proteobacteria)、放線菌門 (Actinobacteria) 及梭桿菌門 (Fusobacteria) 為優(yōu)勢菌群，占細菌總數(shù)99%以上 (圖3A)。用Metastats統(tǒng)計學算法對序列量差異進行比較檢驗得到 B組所占比例靠前的菌群相對豐度無差異 (P>0.05)，軟壁菌門 (Tenericutes) 豐度降低 (P<0.05) (圖3B)。

進一步在屬水平上對RA治療前后腸道菌群進行比較分析，與RA治療前相比，RA經(jīng)锝[99Tc]亞甲基二膦酸鹽注射液治療后腸道菌群的相對豐度發(fā)生一定變化 (圖4A)，其中瘤胃菌屬_UCG-004 (Ruminococcaceae_UCG-004)、瘤胃菌屬_UCG-013 (Ruminococcaceae_UCG-013)、瘤胃菌屬_UBA1819、丁酸菌 (Butyricicoccus)、稀少菌群克里斯滕森菌屬_R-7_group (Christensenellaceae_R-7_group)、霍爾德曼氏菌屬 (Holdemania)、厭氧弧菌屬 (Anaerovibrio)、戈登氏桿菌屬 (Gordonibacter)、毛絨厭氧桿菌屬 (Lachnoanaerobaculum) 及Cellulosimicrobium菌屬的相對豐度減少 (P<0.05)，而巴氏桿菌屬 (Pasteurella)、毛絨厭氧桿菌屬 (Lachnoanaerobaculum)及口腔桿菌屬 (Stomatobaculum) 的相對豐度增加 (P<0.05) (圖4B)。

圖3 門水平上的物種相對豐度 (A) 及治療前后兩組的相對豐度差異 (B)

圖4 屬水平(A)及屬水平上的物種相對豐度(B)

3 討論

目前研究[6-7]表明腸道菌群失調(diào)可能是影響RA發(fā)生發(fā)展的一個重要環(huán)境因素，腸道菌群失調(diào)會使機體的免疫耐受功能發(fā)生變化，產(chǎn)生各種炎性因子及抗體在關節(jié)處或各器官聚集，啟動細胞免疫或體液免疫反應，攻擊自身組織，導致RA的發(fā)生。例如Teng et al[8]研究發(fā)現(xiàn)分節(jié)絲狀桿菌能夠通過誘導IgA分泌及激活B細胞刺激免疫應答，增強機體自身抗體的產(chǎn)生并通過誘導Th17細胞產(chǎn)生加速關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展。Gomez et al[9]發(fā)現(xiàn)關節(jié)炎易感型小鼠的腸道菌群主要由梭菌樣細菌主導，而關節(jié)炎抵抗型的小鼠腸道則富集了紫單胞菌和雙歧桿菌，證實了腸道菌群可能是RA的潛在生物標志物。Rastawicki et al[10]報道RA患者中大腸桿菌、乳酸菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量較高。Scher et al[11]也發(fā)現(xiàn)腸道菌群失調(diào)的RA患者攜帶的普氏菌屬細菌可能介導RA疾病的發(fā)生。

臨床治療RA以抗炎、鎮(zhèn)痛及延緩病情進展為主。目前公認的治療RA最有效的藥物是DMARDs，但不良反應較多。一種DMARDs藥物與其他藥物聯(lián)用控制RA病情比單用治療效果更好，且能降低不良反應率。锝[99Tc]亞甲基二膦酸鹽注射液能有效降低RA患者IL-1、TNF-α水平，減少滑膜等組織的膠原酶和前列腺素的形成，起到抗炎抗風濕的作用，較少引起感染、肝腎功能損傷及骨髓抑制等不良反應，但該藥療效不如DMARDs藥物。因此應用锝[99Tc]亞甲基二膦酸鹽注射液聯(lián)合MTX治療RA是目前較為有效的治療RA方案之一[12]。由于腸道菌群與抗風濕藥物及宿主之間可能存在相互影響，因此研究藥物對腸道菌群的影響能夠為類風濕關節(jié)炎的發(fā)病機制、疾病預防以及藥物作用機制提供參考。目前關于腸道菌群與RA治療的相關研究較少，且各研究結果存在差異。Zhang et al[13]在單用MTX或與其他DMARDs藥物聯(lián)合治療RA后發(fā)現(xiàn)，RA患者腸道菌群數(shù)量發(fā)生改變腸球菌明顯減少。劉雪梅[14]發(fā)現(xiàn)DMARDs治療后RA患者腸道菌群中鏈球菌屬的相對豐度有明顯的上升。

本研究對應用锝[99Tc]亞甲基二膦酸鹽注射液治療RA患者前后的新鮮糞便樣本進行16S rRNA分析。結果表明在應用锝[99Tc]亞甲基二膦酸鹽注射液治療后，RA患者的腸道菌群多樣性有一定程度的升高，說明RA患者的腸道菌群在經(jīng)治療后得到了一定的恢復。利用Metastats分析得出治療后的軟壁菌門、瘤胃菌屬_UCG-004、瘤胃菌屬_UCG-013、瘤胃菌屬_UBA1819、稀少菌群丁酸菌、克里斯滕森菌屬_R-7_group、霍爾德曼氏菌屬、厭氧弧菌屬、戈登氏桿菌屬、毛絨厭氧桿菌屬及Cellulosimicrobium菌屬的相對豐度降低；而相對豐度增加的菌屬有巴氏桿菌屬、毛絨厭氧桿菌屬及口腔桿菌屬。

軟壁菌門又稱柔壁菌門，菌體無細胞壁，只有一種稱為單位膜的原生質(zhì)膜包圍在菌體四周，目前暫無報道RA與軟壁菌門豐度的改變有關。Di Paola et al[15]在比較青少年特發(fā)性關節(jié)炎 (JIAc) 患者與健康人群腸道菌群結構時發(fā)現(xiàn)，JIA患者糞便中瘤胃菌科豐度增加。而瘤胃菌屬會在反應性關節(jié)炎、強直性脊柱炎、腺瘤、直腸癌、炎癥性腸病等狀態(tài)下大量擴增，本研究顯示治療后組的瘤胃菌屬的相對豐度下降，說明锝[99Tc]亞甲基二膦酸鹽注射液能夠抑制瘤胃菌屬，對人體來說是有益的，值得進一步探討。

由于該研究的樣本量相對較少以及存在一定的地域差異及個體差異，并且患者糞便中的菌群也不能完全反映人體腸道中的固有定植菌群，所以本研究有一定的局限性。進一步研究锝[99Tc]亞甲基二膦酸鹽注射液對患者腸道菌群的影響需要擴大樣本，并建立動物模型驗證實驗結果，并對藥物影響的差異細菌進行深入探討。