劉 瑜，嚴(yán)妤函，黃 方，郭 蕾，陳陽希，楊 晨，張興虎，萬文輝

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是臨床上常見的急危重癥。重癥者因釋放大量炎性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α和白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-6，產(chǎn)生全身炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致多器官功能障礙或衰竭，病死率高[1]。維生素D(vitamin D，VD)是人體中一種重要的脂溶性維生素，具有重要的炎癥和免疫調(diào)節(jié)作用[2]。活化的VD[1,25(OH)2D]通過與細(xì)胞內(nèi)的維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)結(jié)合從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

研究表明，AP的嚴(yán)重程度由環(huán)境和遺傳因素共同決定。VDR基因的遺傳變異可能通過影響VDR的表達(dá)和功能對(duì)循環(huán)中VD濃度平衡以及整個(gè)機(jī)體最終代謝產(chǎn)物的活性產(chǎn)生重要影響，包括影響活性VD對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)能力，從而導(dǎo)致個(gè)體間基因型依賴的AP不同預(yù)后[3]。因此，該研究在漢族AP人群中，探討VDR基因多態(tài)性與AP臨床預(yù)后的相關(guān)性，為早期識(shí)別危重患者提供遺傳學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例資料選取2018年1月至2019年12月原南京軍區(qū)南京總醫(yī)院消化內(nèi)科和普通外科ICU收治的AP患者508例。AP的診斷需符合以下3項(xiàng)中的2項(xiàng)[4]：①急性、持續(xù)、嚴(yán)重的上腹部疼痛；②血清脂肪酶(或淀粉酶)活性至少大于正常值上限3倍；③影像學(xué)檢查(通常采用增強(qiáng)CT)有AP的特征性表現(xiàn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲、漢族、AP診斷明確、病歷資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：①無法獲得知情同意書；②具有其他特殊疾病，如獲得性免疫缺陷綜合征、自身免疫性疾病，器官移植后，心、肝、腎、肺、腦等重要器官功能衰竭終末期；③曾攝入或應(yīng)用過對(duì)炎癥過程有調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，如TNF-α抗體等；④接受免疫抑制劑和激素治療。所有受試者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)原南京軍區(qū)南京總醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。

1.2 臨床資料采集采用調(diào)查表的形式，收集AP患者的社會(huì)人口學(xué)資料、既往病史、吸煙飲酒史、發(fā)生AP的原因、實(shí)驗(yàn)室和輔助檢查結(jié)果，計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)、診斷AP后最高急性生理與慢性健康評(píng)分(acute physiology and chronic health evaluation, APACHE)Ⅱ、序貫器官衰竭(sequential organ failure score，SOFA)評(píng)分、臨床轉(zhuǎn)歸。所有入選患者抽取靜脈血3 ml，枸櫞酸鈉抗凝，-20 ℃保存?zhèn)溆??；诰植恳蛩睾腿硪蛩貙?duì)急性胰腺炎嚴(yán)重程度進(jìn)行分級(jí)[5]：①輕型AP：不存在胰腺(胰周)壞死以及器官功能衰竭。②中型AP：存在無菌性胰腺(胰周)壞死和(或)暫時(shí)性的器官功能衰竭。③重型AP：存在感染性胰腺(胰周)壞死或者持續(xù)性的器官功能衰竭。④危重型AP：感染性胰腺(胰周)壞死合并持續(xù)性器官功能衰竭。依據(jù)臨床轉(zhuǎn)歸，將AP患者分為膿毒癥/非膿毒癥組、重癥(重型+危重型)/非重癥(輕型+中型)組、住院期間死亡/存活組。

1.3 主要方法

1.3.1SNP位點(diǎn)的選擇 ① 利用haploview軟件檢索VDR基因中的標(biāo)簽SNPs；② PubMed檢索文獻(xiàn)，查找hot SNPs； ③ 優(yōu)先考慮功能位置(外顯子、5′UTR及3′UTR)。最終選擇了14個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行研究(表1)。

表1 VDR基因多態(tài)性位點(diǎn)信息

1.3.2基因組DNA的提取和基因分型 采用TGuide Blood genomoic DNA試劑盒提取基因組DNA并行瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)控和定量。基因分型采用上海天昊生物科技有限公司改良的連接酶檢測(cè)反應(yīng)(improved ligase detection reaction, imLDR)技術(shù)。所有SNP位點(diǎn)的基因分型成功率均大于95%。分型結(jié)束后，隨機(jī)選擇50份樣品進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，一致性率為100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)每個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型頻率，進(jìn)行g(shù)oodness-of-fit χ2檢驗(yàn)，判斷是否符合Hardy-Weinberg平衡。組間連續(xù)變量的差異采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布者采用非參數(shù)檢驗(yàn)，分類變量采用χ2檢驗(yàn)。利用Haploview軟件進(jìn)行連鎖不平衡分析，構(gòu)建單倍型。非條件Logistic回歸模型校正年齡、性別、BMI、吸煙飲酒狀態(tài)、慢性病狀態(tài)、APACHE II評(píng)分等，在不同的遺傳模式下分析各位點(diǎn)基因型頻率和單倍型頻率與AP患者不同臨床轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性，計(jì)算P值、比值比(odds ratio,OR)和95%置信區(qū)間(confidential interval，CI)。所有統(tǒng)計(jì)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料共納入AP患者508例(表2)，男性343例(67.52%)，女性165例(32.48%)，年齡18～86(44.81±13.80)歲。膽源性胰腺炎是最常見的類型，占49.80%，其次是高脂血癥型(43.70%)，乙醇性(1.57%)，其他類型胰腺炎相對(duì)少見。中位住院天數(shù)為14(9～35)d，住ICU 天數(shù)3.5(0～18)d，期間發(fā)生膿毒癥158例(31.10%)，重癥AP 211例(41.54%)，死亡47例(9.25%)。所有患者均按照急性胰腺炎診治指南給予治療(表2)。

表2 508例胰腺炎患者臨床資料

2.2 VDR基因多態(tài)性與AP患者臨床轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性所有位點(diǎn)的頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡(表1), 說明該研究位點(diǎn)選擇的樣本具有群體代表性。膿毒癥者與非膿毒癥者在年齡、性別、吸煙飲酒狀態(tài)、BMI上無明顯差異，膿毒癥者具有較高的APACHE II評(píng)分、SOFA評(píng)分，較長的住院和住ICU時(shí)間和較高的死亡率(表3)。非條件Logistic回歸分析顯示，rs12721375(G→A)GA/AA基因型較GG發(fā)生膿毒癥的風(fēng)險(xiǎn)低[OR(95%CI)=0.25(0.08～0.79)，P=0.02]；A等位基因型發(fā)生膿毒癥的風(fēng)險(xiǎn)較G低[2.16 (1.12～4.19)，P=0.009]。rs2853559(A→G)GA較GG發(fā)生膿毒癥風(fēng)險(xiǎn)高[0.23 (0.08～0.7)，P=0.022]，GA/AA較GG膿毒癥風(fēng)險(xiǎn)升高[2.03(1.09～3.79)，P=0.026](表4)。

表3 AP患者不同預(yù)后組間臨床特征比較

表4 VDR基因多態(tài)性與AP患者發(fā)生膿毒癥的相關(guān)性[n(%)]

重癥AP患者與非重癥相比，在年齡、性別、吸煙飲酒狀態(tài)上無明顯差異，重癥者具有較高BMI和APACHE II評(píng)分、SOFA評(píng)分，較長的住院和住ICU時(shí)間和較高的死亡率。非條件Logistic回歸分析顯示，rs11168287(G→A)AA基因型較GG或GG/GA發(fā)生重癥AP風(fēng)險(xiǎn)高[4.17(1.15～15.16)，P=0.030、4.11(1.23～13.70)，P=0.022]；rs2853559(A→G)AA基因型較GG或GG/GA發(fā)生重癥AP風(fēng)險(xiǎn)高[4.61(1.24～17.08)，P=0.022、4.417(1.253～15.58)，P=0.021](表5)。

AP死亡患者較存活患者年齡、性別、吸煙飲酒狀態(tài)、BMI無明顯差異，死亡者具有更高的APACHE II評(píng)分、SOFA評(píng)分，較長的住院和住ICU時(shí)間，較高的死亡率和較高的COPD發(fā)生率。非條件Logistic回歸分析顯示，rs11168283(C→T)CT/TT基因型較CC型發(fā)生死亡風(fēng)險(xiǎn)低[0.45(0.20～0.99)，P=0.046](表6)。

3 討論

AP尤其是重癥AP是臨床常見的急危重癥，在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，且死亡率高。爆發(fā)性的促炎細(xì)胞因子釋放引起全身炎癥反應(yīng)綜合征，可導(dǎo)致胰外重要器官功能障礙或衰竭而死亡，重癥AP的死亡率可高達(dá)30%以上[1]。研究表明，VD通過自分泌或旁分泌方式對(duì)天然和獲得性免疫發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。VD通過活化VDR能促使單核細(xì)胞分化為成熟巨噬細(xì)胞、上調(diào)抗菌肽的表達(dá)、誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的免疫耐受、抑制輔助性T細(xì)胞1(T helper cells 1, Th1)向Th2轉(zhuǎn)化、抑制活化B細(xì)胞向漿細(xì)胞及記憶性B細(xì)胞的分化及免疫球蛋白的產(chǎn)生[2]。既往研究[3,6]表明AP患者普遍存在VD缺乏，且缺乏程度與預(yù)后呈正相關(guān)。AP的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸受遺傳、代謝和環(huán)境因素的共同影響，本文首次在中國漢族人群中，對(duì)AP患者VDR基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)并探討VDR基因多態(tài)性與AP患者預(yù)后的相關(guān)性。

表5 VDR基因多態(tài)性與AP患者發(fā)生重癥的相關(guān)性[n(%)]

表6 VDR基因多態(tài)性與AP患者死亡的風(fēng)險(xiǎn)[n(%)]

本研究納入AP患者508例，男性多于女性，膽源性AP是最常見的AP類型(49.80%)，其次是高脂血癥型(43.70%)，與國內(nèi)報(bào)道相符，而國外主要以膽源性和乙醇性AP為主。隨著國人生活水平的提高，高脂血癥的發(fā)病率逐年增加，其中以高甘油三酯血癥為主，而高甘油三酯是AP的重要病因[7]。508例AP患者中211例(41.53%)進(jìn)展為重癥，本研究同時(shí)從消化內(nèi)科和普通外科ICU選擇患者，普通外科ICU收治的大多數(shù)都是重癥AP，故本研究重癥患者比例較大。死亡47例(22.27%)，均為重癥患者。研究選擇了VDR基因上14個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行研究，最大程度代表了VDR基因上常見的遺傳信息。共有4個(gè)SNPs位點(diǎn)與膿毒癥預(yù)后相關(guān)，均位于內(nèi)含子區(qū)。rs12721375 GA/AA基因型和A等位基因發(fā)生膿毒癥的風(fēng)險(xiǎn)較低(P均<0.05)。rs2853559 GA和GA/AA基因型具有較高的膿毒癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(P均<0.05)；rs11168287 和rs2853559 AA基因型發(fā)生重癥AP的風(fēng)險(xiǎn)較高(P均<0.05)；rs11168283 CT/TT基因型發(fā)生死亡風(fēng)險(xiǎn)較低(P=0.046)。目前對(duì)這4個(gè)SNPs位點(diǎn)的研究較少，Baca et al[8]、Mutti et al[9]分別發(fā)現(xiàn)VDR rs2853559與妊娠婦女體內(nèi)25-羥維生素D水平或近視相關(guān)。Hu et al[10]、Orlow et al[11]分別發(fā)現(xiàn)VDR rs11168287 A等位基因型或AA基因型能增加肺結(jié)核或黑色素瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；Engel et al[12]研究發(fā)現(xiàn)AA基因型能降低乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。rs12721375、 rs11168283則鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。雖然內(nèi)含子處于非編碼區(qū)，但基因間區(qū)SNPs可以通過影響RNA剪接間接影響蛋白質(zhì)合成。此外，內(nèi)含子也有自己的轉(zhuǎn)錄單位，能產(chǎn)生調(diào)控RNA或小蛋白，從而影響基因的表達(dá)[13]。本研究中4個(gè)陽性位點(diǎn)影響AP的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

本研究首次在中國漢族人群中發(fā)現(xiàn)VDR基因遺傳多態(tài)性與AP預(yù)后有關(guān)。由于AP患者均來自于醫(yī)院，研究本身存在選擇偏倚。同時(shí)，本研究樣本量較少，統(tǒng)計(jì)效力不夠，所選擇的位點(diǎn)并不能代表VDR基因中所有的遺傳變異信息，不排除該基因中還有其他位點(diǎn)與AP相關(guān)。下一步還有必要開展重復(fù)性、多中心、大樣本研究對(duì)這一結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。