王文晶，李昆珊，劉鐵軍，劉 昕，仇永樂

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)是腫瘤壞死因子超家族成員之一[1]，能通過抑制腫瘤增殖和促進腫瘤凋亡在多種癌癥治療過程中發(fā)揮作用，曾被認為是極具前景的選擇[2]。然而，惡性腫瘤對TRAIL誘導(dǎo)細胞凋亡的耐藥性阻礙了其應(yīng)用拓展。Yes激酶相關(guān)蛋白(yes-associated protein，YAP)的活化及過表達與多種腫瘤細胞耐藥性相關(guān)。如黑色素瘤細胞對絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶抑制劑的耐藥性源自激動蛋白對YAP/轉(zhuǎn)錄聯(lián)合激活因子通路的重塑活化，卵巢癌細胞對紫杉醇的耐藥性涉及到Y(jié)AP的過表達。近期基因組分析顯示YAP在口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)中過表達[3]。Hiemer et al[4]證明YAP的核積聚可促進口腔鱗癌細胞的增殖和遷移。Kim et al[5]研究表明，YAP能有效的抑制MCF10A 細胞中TRAIL表達。故推測通過YAP抑制劑維替泊芬(verteporfin, VPF)有望提高OSCC細胞對TRAIL的敏感性。該研究為改善口腔鱗癌細胞對TRAIL作用的耐藥性，制備協(xié)同遞送TRAIL/VPF的細胞外囊泡(TNF-related apoptosis-inducing ligand/verteporfin co-loading extracellular vesicles, MSCT-EVs/VPF)并對其體外抗癌活性及相關(guān)機制進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料VPF購自美國MedChemExpress公司；SCC25細胞系來自美國ATCC供應(yīng)商，在含有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。成人間充質(zhì)干細胞狀態(tài)良好，購自美國ATCC供應(yīng)商。用慢病毒轉(zhuǎn)染表達人TRAIL的MSCs建立MSCT細胞模型[6],在含有17% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)和保存。FBS、RPMI-1640、胰酶、DMSO均購自美國Sigma公司。

1.2 細胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)分離MSCs和MSCT細胞(第三代)在37 ℃和5% CO2條件下，在含有17% FBS的RPMI-1640細胞培養(yǎng)基中至(70～80)%融合，收集培養(yǎng)基。后培養(yǎng)基改為10% FBS的RPMI-1640細胞培養(yǎng)基，每48 h更換1次。MSCT細胞(第三代) 在37 ℃和5% CO2條件下，在含有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基加入0.3 mg/ml VPF，48 h后收集培養(yǎng)基。將收集的培養(yǎng)基在1 337 r/min下離心10 min，然后6 453 r/min 4 ℃再次離心，去除細胞和碎片。此后，使用0.22 μm過濾器( 德國membrana公司)對培養(yǎng)基真空過濾。用100 ku(德國Sartorius公司)濃縮5次，最后在24 419 r/min、4 ℃下超速離心2 h。用0.22 μm膜過濾器過濾收集EVs產(chǎn)物，并用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌2次。最終產(chǎn)品儲存在-80 ℃的PBS中。

1.3 EVs表征及質(zhì)譜條件取離心后用10 μl PBS再懸浮EVs樣品，然后加入銅網(wǎng)中沉淀2 min。使用JEM-1400透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)進行觀察，使用Nano Measurer 1.2.5軟件計算粒徑分布范圍。

為定量EVs中的VPF，樣品用0.6 mol/L高氯酸(1 ∶1，v/v)脫蛋白，含有抗氧化劑二硫化鈉(5 mg/ml)，離心，通過0.2 μm尼龍過濾器(美國Phenomenex公司，Phenomenex NY 4 mm)過濾。使用VPF標準，采用高效液相色譜法(Agilent 1260)，以乙腈和水為流動相，流速為1 ml/min，波長為230 nm。

1.4 體外釋放實驗將MSCT-EVs/VPF溶液(2 ml)放入透析袋(MWCO ∶8 000～14 000)。將透析袋的兩端夾緊，將含有0.5%(w/v)吐溫-80的40 ml磷酸鈉緩沖溶液放入燒杯中作為透析液。將燒杯置于恒溫搖床中，將轉(zhuǎn)速設(shè)置為100 r/min，溫度為37 ℃。預(yù)定時間間隔從透析液中采集樣品，后補充相同含量的緩沖液。以14 000 r/min離心10 min，用高效液相色譜法測定透析液中各時間點VPF的含量。

1.5 細胞毒性和凋亡分析將對數(shù)期的SCC25細胞以3×103～5×103個/孔的密度接種于96孔板，37 ℃孵育24 h，細胞貼壁。用不同濃度游離VPF、MSCT-EVs、MSCT-EVs:VPF(游離MSCT-EVs+游離 VPF)、MSCT-EVs/VPF處理細胞48 h，然后加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)孵育4 h。然后，抽取培養(yǎng)基并添加150 μl二甲基亞砜。輕搖10 min溶解甲瓚，用微板閱讀器(美國OPTIMAX公司)測量每個孔在570 nm處的OD值。

將SCC25細胞接種于6孔板中，細胞數(shù)為5×105個/孔，37℃培養(yǎng)24 h，細胞融合至70%。將PBS(空白組照)、VPF(2 μg/ml)、MSCT-EVs(20 μg/ml)、MSCT-EVS ∶VPF(20 μg/ml)和MSCT-EVs/VPF(20 μg/ml)分別加入到6孔板中，培養(yǎng)24 h進行細胞凋亡分析。用胰蛋白酶消化細胞，輕輕攪拌，離心，收集細胞。用AF647、annexin V和2 μg/ml的DAPI染色, 流式細胞儀檢測細胞死亡。

1.6 Western blot實驗VPF(2 μg/ml)、MSCT-EVs ∶VPF(20 μg/ml)、MSCT-EVs/VPF(20 μg/ml)處理SCC25細胞后細胞，用BCA法檢測蛋白質(zhì)含量，SDS-PAGE電泳分離。電泳后，去除凝膠，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉密封1 h， 4 ℃下與一抗孵育過夜。PEST洗滌后，加入相應(yīng)二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育2 h，PBST清洗后觀察ECL的形成。

2 結(jié)果

2.1 MSC-EVs的分離與表征MSCT-EVs/VPF以顆粒大小進行表征，MSCT-EVs/VPF平均粒徑約為100 nm，粒徑分布范圍較窄，見圖1A、B。CD63和CD9是MSC-EVs的典型標志物，見圖1C。CD63、CD9和TRAIL在MSCT-EVs中均有表達，見圖1C、D。MSCs中僅有CD81表達，見圖1C。

2.2 載藥與體外釋藥包封率為(93.7±1.53)%，載藥量為(15.43±0.44)%。透析法檢測MSCT-EVs/VPF的藥物含量。MSCT-EVs/VPF在10 h內(nèi)釋放57.8%的VPF，45 h釋放約82.5%，見圖2B。在釋放試驗的前15 h，MSCT-EVs/VPF表現(xiàn)出快速釋放特性，隨后藥物釋放速率減慢，30 h后藥物釋放進入平臺期。

2.3 細胞毒性

2.3.1細胞毒性和半數(shù)抑制濃度(IC50) 在藥物作用試驗前，先測定MSCT-EVs是否能抑制SCC25細胞的生長。結(jié)果表明，MSCT-EVs和VPF可以劑量依賴性地抑制SCC25細胞的生長，見圖3A、B。圖3C顯示VPF和MSCT-EVs的比例與其對癌細胞的協(xié)同殺傷作用密切相關(guān)。不同比例的游離VPF和MSCT-EVs的IC50值差異較大。MSCT-EVs和VPF的質(zhì)量比(wt%)在10 ∶1～5 ∶1的比例范圍內(nèi)具有最佳協(xié)同效應(yīng)。MSCT-EVs/VPF和MSCT-EVs ∶VPF均可抑制SCC25細胞增殖(圖3D)。在相同的藥物比例下，MSCT-EVs/VPF的IC50顯著低于MSCT-EVs ∶VPF(P=0.003，F(xiàn)=10.67)，顯示出更高效的抑制作用。因此，結(jié)果提示MSCT-EVs/VPF組可能在10 ∶1～5 ∶1(wt%)范圍內(nèi)表現(xiàn)出最佳的協(xié)同效應(yīng)。但由于MSCT-EVs載藥量限制，尚不能確定最佳協(xié)同比例。

圖1 MSC-EVs的表征及標志物分析

圖2 VPF標準曲線及釋放曲線A：根據(jù)HPLC結(jié)果得出的VPF回歸曲線；B：VPF的釋放曲線

圖3 VPF的細胞毒性及半數(shù)抑制濃度

2.3.2MSCT-EVs/VPF誘導(dǎo)細胞凋亡 VPF、MSCT-EVs、MSCT-EVs:VPF和MSCT-EVs/VPF均可以誘導(dǎo)SCC25細胞凋亡，見圖4。聯(lián)合用藥組，高于單獨用藥組。載VPF的MSCT-EVs對癌細胞的殺傷作用強于游離MSCT-EVs:VPF組，見圖4、5。用Annexinv/DAPI檢測MSCT-EVs/VPF對SCC25細胞的殺傷作用。結(jié)果表明，MSCT-EVs/VPF對SCC25細胞的誘導(dǎo)凋亡作用高于游離MSCT-EVs:VPF，見圖5。提示MSCT-EVs/VPF能有效誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，并能減少游離藥物的用量。

2.3.3MSCT-EVs/VPF對SCC25細胞中凋亡相關(guān)蛋白和YAP表達的影響 MSCT-EVs/VPF能夠上調(diào)SCC25細胞中Caspase-3、Bax的表達，同時下調(diào)Bcl-2的表達量。VPF在該濃度下未顯示對凋亡蛋白明顯的調(diào)控作用，但可以提高MSCT-EVs對Caspase-3(P=6.93×10-5,F=290.78)、Bax(P=1.95×10-6,F=1 750.31)、Bcl-2(P=0.000 7,F=90.17)調(diào)控作用。相對于MSCT-EVs:VPF組，MSCT-EVs/VPF對Caspase-3(P=3.12×10-5,F=435.49)、Bax(P=1.8×10-5,F=574.33)、Bcl-2(P=0.041,F=9.67)的調(diào)控作用更強。

圖4 各組對SCC25細胞的凋亡誘導(dǎo)作用

圖5 Annexin V/DAPI檢測SCC25細胞凋亡圖

圖6 MSCT-EVs/VPF對SCC25細胞中凋亡相關(guān)蛋白和YAP、mTOR、p-mTOR表達的影響

隨后實驗檢測了MSCT-EVs/VPF對YAP，mTOR信號通路的調(diào)控作用。MSCT-EVs對YAP、p-YAP、mTOR、p-mTOR無顯著影響，當(dāng)聯(lián)合VPF用藥時， VPF對YAP(P=3.43×10-5,F=414.67)、p-YAP(P=7.07×10-7,F=2 910.74)、mTOR(P=0.000 3,F=139.77)、p-mTOR(P=3.2×10-6,F=1 366.66)信號通路的調(diào)控作用被增強。相對于MSCT-EVs+VPF組，MSCT-EVs/VPF組對YAP(P=0.002 56,F=45.57)、p-YAP(P=1.26×10-5,F=686.54)、mTOR(P=0.002,F=51.24)、p-mTOR(P=3.2×10-6，F(xiàn)=1 366.06)信號的抑制作用更高。見圖6。

3 討論

TRAIL因其對腫瘤細胞的特異性殺傷作用，被廣泛用于癌癥治療相關(guān)研究[7]。然而，由于腫瘤的多藥耐藥性，TRAIL單藥應(yīng)用無法達到預(yù)期治療效果。長期以來，無論是穩(wěn)定性增強的重組TRAIL蛋白還是特異性更高的TRAIL抗體，抗癌效果均有限。因此，探究藥物協(xié)同遞送途徑來增強其效用，對于TRAIL的臨床應(yīng)用具有重要意義[8-9]。YAP信號是多種實體腫瘤靶向、化療和免疫治療反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。YAP的過度表達與OSCC促癌基因的表達水平呈正相關(guān)，能促進腫瘤細胞的增殖和腫瘤的侵襲能力。此外，YAP還能促進OSCC細胞對化療藥物的耐藥性[10]。維替泊芬(VPF)是一種用于治療眼部異常血管的光敏藥物，可直接抑制YAP-TEAD結(jié)合并減少YAP過度表達[11]。Fisher et al[12]研究表明VPF能通過抑制YAP來提高惡性腫瘤細胞對RAFi、TKI或化療藥物的敏感性。然而，維替泊芬僅在高微摩爾濃度下阻斷YAP-TEAD結(jié)合，因此在臨床上應(yīng)用受限[13]。該研究通過超速離心法和0.22 μm過濾制備載VPF的TRAIL轉(zhuǎn)染納米囊泡，提高OSCC細胞對TRAIL的敏感性。

MSCs首先轉(zhuǎn)染TRAIL(MSCTs)，然后用VPF孵育，得到載藥納米囊泡。TEM結(jié)果顯示，EVs納米粒子顆粒圓整，粒徑分布較窄。高速離心法去除粒徑大于220 nm的微泡，再經(jīng)蔗糖密度梯度超速離心進一步純化。載藥囊泡具有較高的載藥量和良好的釋藥曲線。體外實驗表明，載藥系統(tǒng)具有良好的抗腫瘤活性，VPF能增強MSCT-EVs對SCC25的抑制作用，EVs協(xié)同遞送的VPF/TRAIL能更加高效的抑制腫瘤細胞生長。這可能是由于MSCT-EVs/VPF組中MSCT-EVs和VPF能以固定比例進入細胞，作用穩(wěn)定，間充質(zhì)干細胞衍生EVs的細胞歸巢作用增加了VPF/TRAIL細胞攝取。這一結(jié)果與以往研究一致，如在介孔硅中裝載吉西他濱和紫杉醇[14]，以及載負順鉑和二甲雙胍的納米立方體[15]，相較于游離藥物組，納米載藥組顯示出更強的藥效。相較于MSCT-EVs:VPF, 100 ∶5～100 ∶15范圍內(nèi)囊泡內(nèi)的MSCT-EVs和VPF的聯(lián)合應(yīng)用具有良好的協(xié)同作用(P<0.05)。由于載藥量的限制，不能直接計算MSCT-EVs/VPF的最佳配比。由于MSCT-EVs和游離VPF在10 ∶1～5 ∶1(wt%)的比例范圍內(nèi)顯示出最佳抑制作用，因此推測MSCT-EVs/VPF組的最佳比例也位于10 ∶1～5 ∶1(wt%)范圍內(nèi)。

該研究檢測了MSCT-EVs/VPF對SCC25細胞中凋亡相關(guān)蛋白和YAP表達的影響。VPF不能直接調(diào)控SCC25細胞中凋亡蛋白的表達，但可以提高MSCT-EVs對Caspase 3、Bax、Bcl2調(diào)控作用(P<0.05). MSCT-EVs可增強VPF對SCC25細胞內(nèi)YAP、mTOR蛋白的抑制作用。相較于MSCT-EVs+VPF組，MSCT-EVs/VPF對Caspase 3、Bax、Bcl2的調(diào)控作用更強(P<0.05)，與凋亡、細胞活性實驗結(jié)果相符。MSCT-EVs對YAP、p-YAP、mTOR、p-mTOR不具有調(diào)控作用，然而卻能夠加強VPF對YAP、p-YAP、mTOR、p-mTOR的調(diào)控作用，這種作用被EVs的協(xié)同遞送增強。此前的研究表明YAP能夠抑制TRAIL的表達，VPF可通過抑制YAP的表達增強TRAIL作用[5]，與該研究結(jié)果相符。

綜上所述，該研究從MSCT中分離出VPF相關(guān)EVs，證明MSCT-EVs/VPF對口腔鱗癌細胞具有顯著的抑制作用,這種抑制作用源于對凋亡蛋白和YAP調(diào)控。制備的載藥EVs能降低VPF的使用劑量，增強TRAIL對OCSS細胞的敏感性。新型載藥EVs協(xié)同遞送TRAIL/VPF對OCSS細胞展現(xiàn)出高效抑制作用, 為多藥耐藥腫瘤的治療提供新思路。