沈艷玲等

[摘要] 目的 旨在研究CTX聯(lián)合BUS對Wister小鼠卵巢及早期肺功能損傷組織結(jié)構(gòu)的影響。 方法 選取2～3月齡的雌性Wister小鼠60只，隨機(jī)分成四組：A正常對照組、B生理鹽水組、C組CTX+BUS組、D組CTX+BUS+生理鹽水組。C、D兩組第1天以腹腔注射CTX負(fù)荷劑量50 mg/（kg·d），第2天開始8 mg/（kg·d）連續(xù)注射14 d，后皮下注射BUS10 mg/（kg·w），共2次。C組小鼠于第15天處死。D組于第15天開始注射生理鹽水8 mg/（kg·d），共15 d，于第30天處死余組小鼠。在處理期間觀察小鼠的一般情況、體重、各級卵泡數(shù)水平。以化學(xué)發(fā)光法測定各組小鼠血清中E2及FSH的水平，觀察卵巢及肺組織常規(guī)病理切片下的形態(tài)學(xué)變化。 結(jié)果 與A、B組卵巢相比，C組E2 顯著下降、FSH水平顯著增加、各級卵泡數(shù)量減少（P<0.05）。C、D組相比，E2 下降、FSH增加（P<0.05），兩組各級卵泡計(jì)數(shù)雖減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A、B組中E2、FSH、卵泡數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。C組與A、B、D組肺組織對比，肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞水腫， 肺泡間隔內(nèi)可見滲出液。A、B、C組肺組織形態(tài)無異常。 結(jié)論CTX+BUS使原始卵泡和初級卵泡的顯著減少可能與小鼠卵巢中血E2下降有關(guān)，并且CTX+BUS也會造成一過性肺損傷。

[關(guān)鍵詞] 卵巢損傷；性激素；一過性肺損傷

The effects of cyclophosphamide and busulfan on ovarian injuries and early lung injury

SHEN Yanling WU Hui HUANG Huan YIN Tian LI Pan ZHAO Pin WU Changchu LUO Wenqi

Changsha Medical University， Changsha 410219， China

[Abstract] Objective To assess the effects of cyclophosphamide （CTX） and busulfan （BUS） on ovarian injuries and initial injury of lung. Methods Sixty female SD rats age of 2 to 3 months were divided into four groups： group A （control group）， group B （saline group）， group C （CTX+ BUS group）， group D （CTX+BUS+saline group）. SD rats of group C and group D were processed by intraperitoneal injection of CTX 50 mg/（kg·d） at the 1st day and then 8 mg/（kg·d） from day 2， for 14 days. SD rats of group C and group D were processed by subcutaneous injection of BUS 10 mg/（kg·w） for twice， and SD rats of group C were killed at day 15， whereas SD rats of group D had been processing by 8 mg/（kg·d） saline for another 15 days， and all of SD rats were killed at day 30. General conditions， weight， number of levels of folliole of rats of four group were observel every day. Estrogen （E2） and follicular stimulating hormone （FSH） were detected by chemiluminescence method. The lung and ovaries of each group were prepared for HE sections. Results Compared with A， B group of ovarian， levels of E2， number of levels of follicular， FSH in the group C decreased and increased significantly （P<0.05）. Compared with group D， C， E2 decreased， FSH increased （P<0.05）， two groups of follicle count at all levels was reduced， but there was no statistically significant difference. In group B and A， E2， FSH， number of follicles were compared， there was no statistically significant difference. Group C compared with group A， B， D in lung tissue， lung tissue vascular endothelial edema， can be seen in the alveolar interval exudate. Lung tissue form of A， B， C group without exception. Conclusion CTX together with BUS can induce primodial follicles and primary follicles undergo atresia， which can be close to the decreased level of E2. CTX together with BUS can also induce transitory pulmonary injury in early stage.

[Key words] Ovarian injury； Sex hormone； Transitory pulmonary injury

近年來惡性腫瘤趨于年輕化，雖經(jīng)化療后患者的存活率顯著提高，但同時(shí)對女性卵巢也造成一定的損害，如卵泡過早排空，包膜增厚，間質(zhì)纖維化，進(jìn)而卵巢早衰[1，2]。如今化療藥物對卵巢的副作用損傷已逐漸成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。其中，CTX和BUS為細(xì)胞周期非特異性烷化劑，其毒性不僅作用于分裂增殖期細(xì)胞，也可作用于未發(fā)育的卵母細(xì)胞或原始卵泡中的前顆粒細(xì)胞，影響卵泡的發(fā)育和成熟[3]。另有報(bào)道部分化療藥物誘發(fā)肺纖維化所需的時(shí)間較長，患者發(fā)病隱匿，不易引人注意[4]。如何在化療時(shí)保護(hù)卵巢功能和肺功能是亟待解決的問題。本實(shí)驗(yàn)選取經(jīng)典化療藥物環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）和白消安（Busulfex，BUS），觀察其對卵巢功能和肺功能損傷的影響，為深入探索化療藥物對卵巢功能及早期肺損傷的預(yù)防及治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物

具有正常性周期2～3月齡的雌性Wister小鼠60只，體重（23±2）g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，使用準(zhǔn)可證編號：SCXK（湘）2011-0003。全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)，鼠料及飲用水均經(jīng)滅菌處理，自由攝食，室溫20℃～24℃，相對濕度45%～55%，每日光照12 h，晝夜交替。飼養(yǎng)1周后每日晨取陰道分泌物涂片，光鏡下觀察性周期。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

注射用環(huán)磷酰胺購自山西普德藥業(yè)股份有限公司（粉劑，200 mg/支），國藥準(zhǔn)字：H14023686。白消安，購于Sigma公司，國藥準(zhǔn)字：B2635。實(shí)驗(yàn)時(shí)用生理鹽水配成相應(yīng)濃度的水溶液注射。

1.3 方法

1.3.1 分組及用藥 將60只小鼠隨機(jī)分成四組，每組15只。A組（正常組）。B組（生理鹽水組）：每天腹腔注射同等劑量的0.9%生理鹽水，連續(xù)30 d。C組（CTX+BUS組）和D組（CTX+BUS+生理鹽水組）第1天以腹腔注射環(huán)磷酰胺負(fù)荷劑量50 mg/（kg·d），后以8 mg/（kg·d）的維持劑量連續(xù)注射14 d，注射環(huán)磷酰胺后皮下注射白消安10 mg/（kg·w），共2次。C組小鼠于第15天處死。D組于第15天開始注射生理鹽水8 mg/（kg·d），共15 d，于第30天處死A、B、D組小鼠。以上所用動物均摘小鼠眼球以取血，4℃放置過夜后，2000 r/min離心10 min，分離血清于-20℃保存。用藥期間觀察小鼠一般狀態(tài)（生命體征、進(jìn)食情況、大小便、每日測體重1次）。

1.3.2 動情周期的確定 每天9：00取自制微細(xì)棉簽蘸以0.9%生理鹽水后，輕輕于小鼠陰道內(nèi)旋轉(zhuǎn)1圈，行陰道涂片，用95%乙醇固定5 min，顯微鏡下觀察細(xì)胞的種類和形態(tài)。

1.3.3性激素水平的測定方法 采用化學(xué)發(fā)光法測定小鼠血清中的雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）水平，試劑盒為德國Bayer公司生產(chǎn)，嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.3.4 組織形態(tài)學(xué)觀察 C組小鼠第15天處死，取出雙側(cè)卵巢及肺，第30天處死余下組的小鼠。進(jìn)行石蠟切片后，HE染色并光鏡下觀察雙側(cè)卵巢和肺組織的形態(tài)學(xué)變化。分別計(jì)數(shù)各組小鼠的各級卵泡數(shù)并比較各組間的差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用兩樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的一般情況

A、B兩組小鼠活動、攝食等一般情況正常，體重?zé)o下降，對外界刺激的反應(yīng)性好，靈活性強(qiáng)。C、D兩組小鼠在腹腔注射CTX及皮下注射BUS后，體重逐漸下降，活動減少，體毛黯淡無光澤，部分體毛剝脫，注射處皮膚出現(xiàn)小潰瘍，但可自愈。C、D兩組于處理后第2天小鼠體重即下降，至第15天體重達(dá)到最低值；結(jié)束注射化療藥后D組小鼠體重均略有增長，但仍低于對照組（t=6.776，P<0.05）。D組的體重與C組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.266，P<0.05）。A、B兩組的體重比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2小鼠動情周期的測定

A、B組小鼠的動情周期為4～5 d，動情間期為1.5～2.5 d。A、B組涂片內(nèi)上皮細(xì)胞、白細(xì)胞、角化細(xì)胞交替的周期性變化。C、D兩組注入CTX及BUS后在出現(xiàn)較長時(shí)間上皮細(xì)胞及白細(xì)胞后，偶有一個(gè)角化細(xì)胞類型變化。隨著時(shí)間的延長，角化細(xì)胞出現(xiàn)的頻率減少。

2.3性激素水平的測定

注藥結(jié)束后，C、D兩組小鼠激素水平發(fā)生明顯變化。與A組比較，C、D兩組E2水平明顯降低（t=33.999、24.682，P<0.05），F(xiàn)SH水平明顯升高（t=-11.296、-14.333，P<0.05）。其中D組與C組比較E2濃度低，F(xiàn)SH比C組高，有顯著性差異（t=12.276、-10.207，P<0.05）。A、B組E2、FSH的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.036、0.702，P>0.05）。見表1。

2.4小鼠卵泡計(jì)數(shù)

C、D組各級卵泡數(shù)量低于A、B組（P<0.05），其中以原始卵泡及初級卵泡下降最為明顯，D組與C組相比卵泡數(shù)均有下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），這說明CTX+BUS主要作用于原始卵泡和初級卵泡，影響卵泡的發(fā)育和成熟。見封三圖2。

2.5 卵巢及肺形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察，可見A、B組卵巢皮質(zhì)的各級卵泡形態(tài)結(jié)構(gòu)與髓質(zhì)結(jié)構(gòu)未見異常。肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)也未見異常。C、D兩組可見卵泡數(shù)目均明顯減少，卵巢髓質(zhì)萎縮，間質(zhì)纖維化。C組肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞水腫， 肺泡間隔內(nèi)可見滲出液。D組內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞均正常，說明化療藥物可導(dǎo)致一過性肺損傷。見封三圖3。

3 討論

化療是臨床上治療免疫性疾病、血液病和腫瘤的重要手段之一，療效確切?；熕幬飳Π屑?xì)胞選擇性較差，在殺滅病變細(xì)胞的同時(shí)，對正常組織細(xì)胞也有不同程度的損害。其中，女性卵巢是化療敏感器官，化療可造成卵巢功能損害，改變性激素水平，可使患者發(fā)生暫時(shí)或永久性閉經(jīng)，甚至喪失生育力，生活質(zhì)量下降。目前有明確卵巢毒性損害的烷化劑如環(huán)磷酰胺、白消安、氮芥等可致閉經(jīng)、生育能力低下，其中白消安是聯(lián)合化療、手術(shù)的常用藥物之一[5]，目前有數(shù)據(jù)表明每增加1.0 g劑量的環(huán)磷酰胺，發(fā)生卵巢功能衰竭的幾率大約增加 0.13倍[6]。因此本研究選擇CTX腹腔注射+BUS皮下注射處理小鼠進(jìn)行觀察，卵巢HE染色可見C、D組小鼠卵巢組織中原始卵泡和初級卵泡的明顯少于正常組，說明CTX+BUS主要破壞處于發(fā)育中的卵泡，與王方圓的實(shí)驗(yàn)一致[7]。另外血清雌激素來源于卵巢的顆粒細(xì)胞，被視為卵巢儲備功能的直接指標(biāo)[8]。本研究顯示，C、D組小鼠在給藥后15 d，血清中E2顯著下降，F(xiàn)SH顯著上升，說明CTX+BUS損傷了卵巢的顆粒細(xì)胞從而使E2分泌下降，而D組繼續(xù)給予同等劑量的生理鹽水，在不傷害小鼠卵巢的情況下卵巢損傷的程度有所減慢，這可能與小鼠機(jī)體應(yīng)激因素有關(guān)[9]。同時(shí)已有大量資料表明CTX可導(dǎo)致卵巢顆粒細(xì)胞的損傷，其機(jī)制為卵泡內(nèi)的某種信號被激活而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡[10]，而這種機(jī)制有學(xué)者提出Bcl-2/bax的比例決定卵泡是否接受誘導(dǎo)凋亡的信號[11]。目前，Bcl-2家族是較公認(rèn)的凋亡調(diào)控因子之一，大量學(xué)者對此進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探究，梁欣韞研究自身免疫性卵巢早衰小鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡發(fā)生率高，同時(shí)Bax蛋白的表達(dá)明顯上升，Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯下降[12]。朱玲研究表明免疫性卵巢早衰大鼠Bcl-2蛋白的表達(dá)減弱，Bax蛋白的表達(dá)增加從而促進(jìn)了卵泡過早過快的凋亡[13]。邱明寧進(jìn)一步以山羊卵巢間質(zhì)體外分離實(shí)驗(yàn)證實(shí)顆粒細(xì)胞凋亡及卵泡閉鎖與局部Bax基因的表達(dá)有關(guān)[14]。此時(shí)有學(xué)者研究去卵巢大鼠外源性補(bǔ)充E2后，大鼠下丘腦各核團(tuán)Bcl-2蛋白的表達(dá)增加，而Bax蛋白的表達(dá)減少或變化不明顯的實(shí)驗(yàn)，證明了E2能調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax的表達(dá)[15]。然而可能由于種屬特異性，各實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異。而本實(shí)驗(yàn)主要研究CTX+BUS對卵巢的破壞結(jié)果，主要是小鼠卵巢原始卵泡和初級卵泡的耗竭和E2的顯著下降，其實(shí)驗(yàn)機(jī)制可能是化療藥物促使E2減少，從而異常激活Bax基因的表達(dá)，誘導(dǎo)卵泡凋亡甚至耗竭[16]，由此猜測原始卵泡和初始卵泡的顯著減少可能與E2的下降有關(guān)，而E2與卵泡凋亡及bcl-2/Bax三者間調(diào)節(jié)具體的作用機(jī)制，有待后續(xù)的相關(guān)研究來證明。

另外，抗腫瘤藥物可使很多惡性腫瘤患者受益，但這種獲益是以藥物毒性的產(chǎn)生為代價(jià)的，其中一部分患者可發(fā)生肺損傷?；熕幬锸且鹚幬镄苑螕p傷的重要原因，其中包括環(huán)磷酰胺、白消安、博來霉素等[17]。研究表明白消安治療慢性粒細(xì)胞白血病2～3年后，可引起肺纖維化，且常因呼吸衰竭或并發(fā)肺炎而死亡[18]。有相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究在治療相關(guān)的劑量濃度范圍內(nèi)，環(huán)磷酰胺及白消安對肺的影響小[19]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)化療第15天時(shí)小鼠HE染色示肺部損傷，第30天肺部HE肺組織內(nèi)皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞正常，考慮化療藥物使小鼠處于應(yīng)激狀態(tài)致早期肺損傷，停藥后肺部結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常。

化療對卵巢功能的影響可引起不孕，對年輕女性癌癥患者化療前如何評估化療可能對生育功能產(chǎn)生的影響，從而使患者獲得更好的卵巢功能和生育能力，是目前臨床婦科腫瘤醫(yī)師必須重視的課題，也是未來卵巢惡性生殖細(xì)胞腫瘤研究的方向。同時(shí)繼續(xù)探討化療藥物對早期肺功能的影響，相信經(jīng)過研究者們的共同努力，將會為年輕女性癌癥患者化療后保留生育力和正常肺功能提供更多、更有效、更安全以及更經(jīng)濟(jì)的治療方法[20]。

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