陶天柱，張國榮，楊曉明，郭 青 ，劉 珺

膿毒癥是機(jī)體對(duì)感染的免疫反應(yīng)失控引起的致命性器官功能損害，是危重病患者死亡的重要原因[1]。流行病學(xué)研究[2]顯示全球每年因膿毒癥死亡的病例達(dá)到600萬，嚴(yán)重膿毒癥的病死率高達(dá)25%～30%。膿毒癥早期機(jī)體在病原微生物和代謝產(chǎn)物刺激下，產(chǎn)生大量的促炎性炎癥因子和氧自由基。隨著臟器保護(hù)和替代治療技術(shù)的不斷完善，膿毒癥患者多能度過過度炎癥反應(yīng)期，而進(jìn)入長期的免疫抑制狀態(tài)[3]。V區(qū)Ig抑制子(V-domain Ig suppressor of T-cell activation, VISTA)，也被稱為程序性死亡因子同源物(programmed death 1 homolog, PD-1H)，主要表達(dá)于T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表面。既往研究[4]發(fā)現(xiàn)，VISTA分子在抑制淋巴細(xì)胞過度活化和維持免疫穩(wěn)態(tài)的過程中發(fā)揮重要作用。該文擬通過尾靜脈注射抗VISTA抗體(MH5A)，探討在體激活VISTA信號(hào)通路對(duì)膿毒癥小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用及治療價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 膿毒癥小鼠模型建立雄性8～12周齡的C57BL/6小鼠共80只，體質(zhì)量20～30 g，由海軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，于術(shù)前12 h禁食，隨機(jī)數(shù)字表法分為盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture, CLP)組和假手術(shù)(Sham)組。經(jīng)腹部正中切口暴露盲腸，沿距離遠(yuǎn)端1 cm處結(jié)扎，使用18G穿刺針對(duì)穿盲端，輕輕擠出少量腸道內(nèi)容物，將盲腸還納腹腔后間斷縫合腹膜和皮膚，皮下注射生理鹽水1 ml。假手術(shù)組僅暴露盲腸，不給予結(jié)扎或穿孔操作。本實(shí)驗(yàn)中的動(dòng)物處理方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)空軍特色醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin, APC)標(biāo)記的抗小鼠CD4抗體， 異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標(biāo)記的抗小鼠CD8抗體，藻紅蛋白(phycoerythrin, PE)標(biāo)記的抗小鼠VISTA抗體，抗VISTA激動(dòng)型抗體(克隆號(hào)：MH5A)和同型對(duì)照抗體(克?。篐TK888)均購自美國Biolegend公司。小鼠細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6, IL-6)、IL-1β和干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)的ELISA試劑盒均購自美國BD Bioscience公司。脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)檢測試劑盒購自美國Chemicon公司。

1.3 單克隆抗體注射治療將CLP小鼠隨機(jī)分為抗體治療組(MH5A)和同型對(duì)照抗體組(Isotype)，每組8只，分別于CLP術(shù)前2 h給予治療組尾靜脈注射100 μg抗VISTA抗體，對(duì)照組100 μg同型對(duì)照抗體。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測T淋巴細(xì)胞VISTA表達(dá)變化收集CLP或Sham術(shù)后24 h的外周血和脾臟，研磨小鼠脾臟制備單細(xì)胞懸液，裂紅液處理后離心去上清液。PBS重懸制備單細(xì)胞懸液，加入APC標(biāo)記的CD4抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的CD8抗體和PE標(biāo)記的VISTA抗體，避光孵育30 min，PBS洗滌去上清液后，上機(jī)檢測。

1.5 ELISA檢測小鼠外周血細(xì)胞因子表達(dá)收集小鼠外周血離心取上清液，按照ELISA試劑盒操作步驟逐步加樣檢測細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ的表達(dá)。

1.6 小鼠腹腔和外周血細(xì)菌負(fù)荷測定收集小鼠外周血稀釋至103或105倍，制備100 μl懸液；使用2 ml無菌PBS灌洗小鼠腹腔，收集灌洗液稀釋105或107倍，制備懸液。將稀釋后的血和灌洗液均勻涂抹至瓊脂糖平板，于37℃溫箱孵育24 h后計(jì)數(shù)菌落形成單位(CFU)。

1.7 TUNEL染色檢測脾臟細(xì)胞凋亡制備小鼠脾臟石蠟切片，緩沖液孵育后，加入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶和dUTP地高辛染色。37℃孵育1 h后停止反應(yīng)。清洗切片，然后加入抗地高辛過氧化物酶溶液。切片用DAB/H2O2染色，雙苯甲酰胺反染。高倍顯微鏡下計(jì)數(shù)10個(gè)視野中染色陽性的細(xì)胞平均數(shù)。

1.8 小鼠7 d生存期觀察將小鼠隨機(jī)分為Sham組、CLP組、CLP+抗VISTA抗體組和CLP+對(duì)照抗體組，每組12只。抗VISTA抗體組給予抗VISTA抗體100 μg，對(duì)照抗體組給予同型對(duì)照抗體100 μg，其余組別給予100 μl生理鹽水，觀察術(shù)后7 d各組小鼠的生存期。

2 結(jié)果

2.1 膿毒癥小鼠淋巴細(xì)胞VISTA表達(dá)變化如圖1和表1所示，sham和CLP組小鼠外周血和脾臟中CD4+T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞均表達(dá)豐富的VISTA分子，但各組間VISTA平均熒光強(qiáng)度(mean fluores-cence intensity，MFI)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 膿毒癥小鼠外周血和脾臟T淋巴細(xì)胞VISTA表達(dá)變化MFI：平均熒光強(qiáng)度

表1 膿毒癥小鼠外周血和脾臟T淋巴細(xì)胞VISTA表達(dá)變化

2.2 MH5A抗體治療可以顯著降低膿毒癥小鼠的死亡率分別于術(shù)前2 h在體給予抗VISTA抗體或同型對(duì)照抗體，觀察各組小鼠的7 d生存期，結(jié)果顯示：CLP組為16.7%(2/12)，CLP+抗VISTA抗體組66.7%(8/12)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01)。見圖2。

圖2 抗VISTA抗體改善膿毒癥小鼠7 d生存期與CLP組比較：*P<0.05

2.3 抗VISTA抗體抑制促炎性反應(yīng)，并降低細(xì)菌負(fù)荷如表2所示，與CLP組相比，抗體治療組促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ的表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)，外周血和腹腔灌洗液培養(yǎng)后細(xì)菌集落的數(shù)量減少，提示抗體治療組小鼠的細(xì)菌清除能力改善。

2.4 抗VISTA抗體減少膿毒癥小鼠脾臟淋巴細(xì)胞凋亡TUNEL染色顯示，CLP術(shù)后24 h小鼠脾臟中的凋亡細(xì)胞數(shù)增加(圖3)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組相比，抗VISTA抗體治療后脾臟中的細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(30 123 ± 6 400vs45 482 ± 8 652，P=0.03)，提示抗VISTA抗體可以抑制淋巴細(xì)胞的凋亡。

3 討論

隨著膿毒癥病理生理機(jī)制研究的不斷深入，調(diào)控免疫炎癥紊亂已經(jīng)成為治療膿毒癥的新方向。既往研究[5]證實(shí)，膿毒癥時(shí)淋巴細(xì)胞的數(shù)量、功能和表型均發(fā)生顯著變化，且與患者的病情嚴(yán)重程度和預(yù)后密切相關(guān)。免疫檢查點(diǎn)分子是調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的功能的重要靶點(diǎn)，阻斷程序性死亡分子(PD-1)/程序性死亡分子受體配體(PD-L1)或細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)抗原(CTLA-4)都可以改善淋巴細(xì)胞的功能，對(duì)膿毒癥小鼠發(fā)揮保護(hù)作用[6-8]。本文通過在體給予MH5A抗體顯示，調(diào)控VISTA通路可以減少淋巴細(xì)胞的凋亡，抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，改善細(xì)菌清除能力，從而改善膿毒癥小鼠生存期。

多項(xiàng)尸檢研究[9]顯示，在膿毒癥死者的諸多臟器中觀察到免疫細(xì)胞如T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和B細(xì)胞的大量凋亡，且免疫細(xì)胞中的免疫檢查點(diǎn)分子表達(dá)上調(diào)。與其他B7家族的檢查點(diǎn)分子不同，VISTA在對(duì)照組小鼠淋巴細(xì)胞中表達(dá)豐富，而CLP術(shù)后24 h未見顯著的升高，提示VISTA信號(hào)通路在免疫炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)階段即可發(fā)揮明顯的調(diào)節(jié)作用。

表2 抗VISTA抗體降低膿毒癥小鼠外周血細(xì)胞因子和細(xì)菌負(fù)荷

圖3 抗VISTA抗體抑制膿毒癥小鼠脾臟淋巴細(xì)胞凋亡 TUNEL染色×400a:Sham組; b:CLP組; c:CLP+抗VISTA抗體組; d:CLP+Isotype組; 與CLP組比較：*P<0.05

Wang et al[4]發(fā)現(xiàn)，在未活化的淋巴細(xì)胞中加入重組VISTA Ig分子片段，對(duì)淋巴細(xì)胞的凋亡沒有顯著影響。課題組在本研究中觀察到激活VISTA信號(hào)通路可以減少CLP小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的凋亡，但在假手術(shù)組給予MH5A抗體對(duì)細(xì)胞凋亡并無顯著影響(結(jié)果未報(bào)道)，提示VISTA對(duì)淋巴細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用與細(xì)胞自身的活化狀態(tài)可能相關(guān)。MH5A抗體減少淋巴細(xì)胞凋亡可能還受到其他因素的間接影響，如促炎性細(xì)胞因子TNF-α的分泌減少和細(xì)菌負(fù)荷的降低。

膿毒癥早期過度的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致免疫細(xì)胞凋亡和重要臟器直接損害的關(guān)鍵因素。本研究觀察到MH5A抗體可以顯著降低促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，其可能的機(jī)制包括以下3個(gè)方面：① 淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子分泌減少。大量研究[4，10-12]證實(shí)，VISTA是負(fù)性調(diào)控T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)的靶點(diǎn)，利用重組VISTA Ig分子片段或激活型抗VISTA抗體活化信號(hào)通路可以負(fù)性調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的功能，抑制細(xì)胞因子如IL-2和IFN-γ的產(chǎn)生。而IL-2和IFN-γ等細(xì)胞因子在單核巨噬細(xì)胞過度活化的過程中均發(fā)揮一定作用，切斷T細(xì)胞來源細(xì)胞因子的產(chǎn)生可以間接抑制單核巨噬細(xì)胞的活化，降低全身的炎癥反應(yīng)。②VISTA對(duì)髓樣細(xì)胞的直接作用。VISTA可以同時(shí)表達(dá)于淋巴細(xì)胞和髓樣細(xì)胞，發(fā)揮受體和配體的雙重作用，但VISTA對(duì)髓樣細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用目前研究結(jié)論尚不一致。Bharaj et al[13]在HIV感染的患者中研究發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞過表達(dá)VISTA后可以自發(fā)性分泌促炎性細(xì)胞因子如IL-6、IL-8、TNF-α和IL-1β。不同的是，Han et al[14]發(fā)現(xiàn)，與淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用相似，VISTA也可以負(fù)性調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞和漿細(xì)胞樣DC分泌細(xì)胞因子的功能。VISTA分子對(duì)髓樣細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用和機(jī)制尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。③細(xì)菌負(fù)荷的降低。細(xì)菌負(fù)荷和機(jī)體炎癥反應(yīng)的程度可以互為因果，當(dāng)細(xì)菌負(fù)荷降低時(shí)，病原微生物和代謝產(chǎn)物對(duì)免疫細(xì)胞的刺激減少，細(xì)胞因子的產(chǎn)生隨之減少。理論上，VISTA抑制淋巴細(xì)胞的凋亡可以保護(hù)獲得性免疫反應(yīng)的能力，促進(jìn)細(xì)菌的清除，降低全身和局部的細(xì)菌負(fù)荷。

綜上，本研究顯示免疫檢查點(diǎn)VISTA分子是調(diào)節(jié)膿毒癥免疫炎癥反應(yīng)的重要靶點(diǎn)，MH5A抗體可以阻斷淋巴細(xì)胞凋亡途徑，抑制炎癥因子，降低細(xì)菌負(fù)荷，從而對(duì)膿毒癥小鼠發(fā)揮重要保護(hù)作用。但本研究僅從在體研究著手，存在不足之處，后續(xù)研究將進(jìn)一步闡明VISTA對(duì)純化的淋巴細(xì)胞亞群和單核巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，為膿毒癥免疫紊亂的機(jī)制研究提供借鑒，并為膿毒癥的免疫調(diào)節(jié)治療提供理論依據(jù)。