劉 莉，顧亞男，李名聰，黃依璇，張勝權(quán)

甲羥戊酸途徑是存在于所有高等真核生物和很多病毒中的一條代謝途徑。羊毛固醇合成酶[1]是甲羥戊酸途徑膽固醇(cholesterol，CH)合成支路中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，膠質(zhì)瘤中的 MI-2是通過(guò)破壞CH穩(wěn)態(tài)，抑制CH合成和內(nèi)源性肝X受體配體的產(chǎn)生來(lái)介導(dǎo)的，從而導(dǎo)致CH耗竭和腫瘤細(xì)胞調(diào)亡[2-3]。

表皮即皮膚的外層，由角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocytes，KCs)組成，該類(lèi)細(xì)胞分化形成一道防護(hù)屏障，抵御外界環(huán)境傷害。Jans et al[4]表明甲羥戊酸徑中羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑(hydroxymethylglutarate monoacyl coenzyme A reductase inhibitor，PRA)、香葉基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(geranifolyl transferase inhibitor，GGTI)刺激KCs后，能夠抑制Ca2+誘導(dǎo)INV表達(dá)[5]。Zhang et al[6]研究指出甲羥戊酸激酶(mevalonic，MVK)的雜合突變可導(dǎo)致播散型淺表性汗孔角化癥(disseminated superficial actinic porokeratosis，DSAP)，汗孔角化癥皮損的特征之一是KCs凋亡[7]，但其具體機(jī)制尚不清楚。此外，該實(shí)驗(yàn)室前期研究[8]指出羊毛固醇合成酶抑制劑(lanosterol synthase inhibitor，RO)通過(guò)影響周期蛋白表達(dá)從而抑制KCs增殖，但RO對(duì)KCs分化和凋亡的影響尚未研究。因此，該研究使用了RO探討甲羥戊酸途徑異常對(duì)KCs分化和凋亡的影響并探索其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器胎牛血清、 DMEM 、MEPICF 500培養(yǎng)基、0.06 mol/L NaCl 、0.2 mol/L CaCl2、Coating Matrix基質(zhì)、HKGS(×100)和0.25% 胰酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；Dispase購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RIPA蛋白裂解液、青霉素-鏈霉素溶液(×100)購(gòu)自上海碧云天生物公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自中國(guó)上海貝博生物公司；Involucrin、Loricrin、Bcl-2、Bax 及 β-actin均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物公司。貝克曼流式細(xì)胞儀CytoFlex、天能電泳儀、天能化學(xué)發(fā)光成像儀。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 皮膚原代細(xì)胞培養(yǎng)見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8]。

1.2.2細(xì)胞凋亡檢測(cè) 胰酶消化收集KCs細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×104個(gè)/ml，分別接種于12孔板，培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)過(guò)夜，單獨(dú)加入RO(10 μmol/L)或聯(lián)合CH(40 μmol/L)，作用時(shí)間分別為 1、2、3 d，對(duì)照組培養(yǎng)液中加入相同濃度的PBS。3 d后胰酶消化再次收集細(xì)胞，按照凋亡試劑盒操作指南，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果用 Flowjo 10.0分析。

1.2.3凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè) 將上述處理的KCs細(xì)胞用含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液(RIPA)在冰上裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE電泳后，移膜封閉，1 ∶1 000稀釋Bax 和 Bcl-2，1 ∶10 000 β-actin抗體作為一抗， 4 ℃孵育過(guò)夜。TBST漂洗，1 ∶10 000稀釋二抗，室溫孵育2 h。TBST漂洗擦干，按照化學(xué)發(fā)光試劑盒操作方法進(jìn)行發(fā)光和成像。

1.2.4分化相關(guān)蛋白檢測(cè) 將RO單獨(dú)或聯(lián)合CH與KCs 共培養(yǎng)不同時(shí)間加入Ca2+(1.8 mmol/L)處理1d后提取KCs細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后，放入1 ∶1 000稀釋的Involucrin、Loricrin和1 ∶10 000稀釋的 β-actin抗體中4 ℃孵育過(guò)夜。TBST漂洗，繼續(xù)孵育二抗(1 ∶10 000)，室溫孵育2 h。TBST漂洗擦干，按照化學(xué)發(fā)光試劑盒操作方法進(jìn)行發(fā)光和成像。

2 結(jié)果

2.1 RO誘導(dǎo)KCs細(xì)胞凋亡當(dāng)RO(10.0 μmol/L)單獨(dú)處理KCs后，細(xì)胞凋亡率隨著作用時(shí)間的增加而增加，第2、3天細(xì)胞凋亡率與第0天相比，經(jīng)方差分析，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=152.59，P<0.05)；而當(dāng)RO 聯(lián)合CH處理 KCs 細(xì)胞后，CH部分削弱RO對(duì)KCs凋亡誘導(dǎo)作用，在2、3 d細(xì)胞凋亡率與RO單獨(dú)處理 KCs第2、3天細(xì)胞凋亡率相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1=9.42、t2=10.98，P<0.05)。見(jiàn)圖 1。

2.2 細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)RO單獨(dú)處理KCs后，隨著作用時(shí)間的增加，抑制細(xì)胞凋亡蛋白 Bcl-2和Bax的表達(dá)；當(dāng)補(bǔ)充CH 處理KCs后，CH能部分減弱RO對(duì)Bcl-2的表達(dá)抑制作用；Bcl-2/Bax的比值分析表明在單獨(dú)RO與KCs共培養(yǎng)時(shí)，Bcl-2/Bax的比值隨著共培養(yǎng)時(shí)間的增加而降低，而補(bǔ)充CH后，RO對(duì)Bcl-2/Bax 比值降低作用減弱，在處理3 d時(shí)有顯著性差異，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1 RO單獨(dú)或聯(lián)合CH刺激KCs后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

2.3 細(xì)胞分化蛋白表達(dá)Western blot 結(jié)果顯示RO單獨(dú)與 KCs 細(xì)胞共培養(yǎng)，Ca2+處理1 d后， Ca2+誘導(dǎo)的分化標(biāo)志蛋白Involucrin和 Loricrin 的表達(dá)下降；而補(bǔ)充CH到細(xì)胞共培養(yǎng)體系后，RO對(duì)Involucrin 及 Loricrin 的表達(dá)抑制作用未受到顯著影響。見(jiàn)圖 3。

3 討論

甲羥戊酸途徑作為細(xì)胞生命活動(dòng)進(jìn)程的基本途徑，對(duì)于維持細(xì)胞正常的生理功能具有重要意義。皮膚是機(jī)體最重要的器官之一,主要由KCs組成的表皮構(gòu)成，能夠防止皮膚水分流失并且阻止體外有害物質(zhì)損傷皮膚。甲羥戊酸途徑在細(xì)胞中經(jīng)過(guò)一系列生命活動(dòng)過(guò)程可形成甾醇類(lèi)，如CH，可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為膽汁酸、類(lèi)固醇激素等。代謝產(chǎn)生的中間產(chǎn)物及終產(chǎn)物如法尼基焦磷酸，香葉基香葉基焦磷酸提供戊二烯基，參與細(xì)胞某些蛋白的翻譯后修飾，對(duì)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生干擾，導(dǎo)致細(xì)胞的增殖、分化、基因表達(dá)、蛋白糖基化作用以及細(xì)胞骨架的形成等細(xì)胞生命活動(dòng)發(fā)生變化。分化是細(xì)胞生命活動(dòng)的必不可少的過(guò)程，角質(zhì)形成細(xì)胞的分化成熟表現(xiàn)為從基底層向角質(zhì)層的逐漸移行。有研究[9-10]表明甲羥戊酸代謝途徑相關(guān)酶的抑制劑 ALD、PRA等可抑制由 Ca2+誘導(dǎo)的 KCs 細(xì)胞分化標(biāo)志蛋白的表達(dá)，而 CH 補(bǔ)充能夠促進(jìn) KCs 細(xì)胞分化相關(guān)蛋白的表達(dá)。在該研究中， RO對(duì)KCs細(xì)胞Ca2+誘導(dǎo)的分化標(biāo)志蛋白Involucrin和Loricrin 的表達(dá)起抑制作用,而補(bǔ)充CH后對(duì)相關(guān)分化蛋白的表達(dá)抑制并沒(méi)有補(bǔ)救作用，這提示RO與ALD和PRA抑制皮膚KCs分化的分子機(jī)制不同,可能與其下游產(chǎn)物CH的耗盡無(wú)關(guān)。細(xì)胞凋亡對(duì)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起重要作用，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等。Bcl-2和Bax是凋亡途徑中的兩種重要蛋白，Bcl-2/Bax的比值變化影響著細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。當(dāng)其比值下降時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，反之則抑制細(xì)胞的凋亡[11]。該研究表明RO 刺激KCs 細(xì)胞后可時(shí)間性促進(jìn) KCs 細(xì)胞的凋亡，且細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白 Bcl-2/Bax的比值下降；而補(bǔ)充下游產(chǎn)物 CH 后，可減弱由 RO 造成的細(xì)胞凋亡作用，且CH 對(duì)Bcl-2/Bax的比值下降有補(bǔ)救作用，該研究結(jié)果顯示RO可能通過(guò)降低Bcl-2/Bax 的比值而誘導(dǎo) KCs 細(xì)胞凋亡。因此， KCs 的分化和凋亡是一個(gè)由許多分子調(diào)節(jié)的復(fù)雜過(guò)程。該研究的結(jié)果部分解釋了甲羥戊酸途徑功能障礙所致的KCs 分化抑制和凋亡誘導(dǎo)機(jī)制。

圖2 Western blot 分析凋亡蛋白表達(dá)

圖3 Western blot 分析分化蛋白表達(dá)與同時(shí)段RO組比較：*P<0.05