陳天，李昱櫻，楊亞杰，候林慧，常永春，榮二花，吳玉香

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 晉中 030801）

棉屬（Gossypium）有52個(gè)種（變種），其中47個(gè)為二倍體棉種（2n=2x=26），5個(gè)為異源四倍體棉種（2n=4x=52）［1］。栽培種陸地棉（Gossypium hirsutum）和海島棉（G. barbadense）為異源四倍體，是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。陸地棉因其產(chǎn)量高而在世界范圍內(nèi)廣泛種植，海島棉以其優(yōu)良纖維品質(zhì)而聞名，世界上90%以上的棉花纖維產(chǎn)量來(lái)自陸地棉和海島棉，其長(zhǎng)期以來(lái)主導(dǎo)棉花產(chǎn)量和貿(mào)易［2-3］。

自然界異源四倍體棉種基因組是由2個(gè)亞基因組組成，它們被命名為A和D，是在大約100~200萬(wàn)年前舊大陸A基因組祖先與新大陸D基因組祖先雜交然后染色體數(shù)目加倍形成。然而，關(guān)于棉屬異源四倍體棉種A組的真正起源歷史以及A組的分化程度還存在爭(zhēng)議，異源四倍體棉種的供體種也一直是棉屬進(jìn)化研究的熱點(diǎn)。自然條件下由于A、D組棉種之間的生殖隔離，A組和D組棉種很難雜交成功。僅有的報(bào)道如亞洲棉×雷蒙德氏棉［4］、亞洲棉×瑟伯氏棉［5］、亞洲棉×戴維遜氏棉［6-7］、亞洲棉×異常棉［8］，以及本實(shí)驗(yàn)室前期合成的草棉×雷蒙德氏棉［2］等。目前，普遍認(rèn)為二倍體物種草棉和雷蒙德氏棉是異源四倍體棉的祖先，因?yàn)樗鼈兒彤愒此谋扼w在分子水平上高度相似［9-11］。

實(shí)驗(yàn)室前期模擬自然界異源四倍體棉種形成過(guò)程，以A基因組的草棉作母本與D基因組的雷蒙德氏棉雜交獲得雜種，對(duì)雜種植株進(jìn)行秋水仙堿多倍體誘變，最后得到結(jié)鈴的植株，目前已經(jīng)獲得了育性較為穩(wěn)定的人工異源四倍體［12］。本研究旨在探討伴隨著雜交加倍的多倍體物種形成后的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)變化規(guī)律，以及通過(guò)和陸地棉的SRAP分子標(biāo)記比較，揭示人工選擇對(duì)進(jìn)化趨勢(shì)的影響，為棉屬異源四倍體棉種起源進(jìn)化提供確鑿證據(jù)，也為棉花種質(zhì)創(chuàng)新提供新材料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用材料為前期遠(yuǎn)緣雜交及加倍合成的人工異源四倍體，具體合成過(guò)程為：以紅星草棉為母本，野生雷蒙德氏棉為父本雜交獲得雜種，并經(jīng)形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子標(biāo)記鑒定遠(yuǎn)緣雜種為真雜種［2］，然后采用嫁接繁殖獲得大量雜種植株，對(duì)嫁接苗枝條進(jìn)行秋水仙堿多倍體誘變，最后得到結(jié)鈴的植株，收獲種子S1，逐年種植并自交獲得可育的人工異源四倍體S2代和S3代。本試驗(yàn)選用S2代和S3代植株以及親本草棉為材料，并采用自然界異源四倍體陸地棉TM-1作對(duì)照。研究材料基本信息見表1。由于育種工作的艱辛和樣本延續(xù)的實(shí)際困難，本研究中部分活體材料難以保存，存在父本部分?jǐn)?shù)據(jù)缺失和其它樣本重復(fù)數(shù)不足的問(wèn)題。

表1 研究材料基本信息Table 1 Basic information of research materials

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 人工異源四倍體的形態(tài)學(xué)鑒定

將親本和獲得的人工異源四倍體種子S2和S3同時(shí)在培養(yǎng)箱中育苗，出現(xiàn)2片真葉后移栽溫室，盆栽種植，盆栽間距0.5 m。對(duì)雜種植株進(jìn)行長(zhǎng)勢(shì)和形態(tài)性狀觀察，并和母本及陸地棉做比較，選取倒三葉至倒四葉且完全展開的葉片進(jìn)行觀察并測(cè)量分析，從形態(tài)學(xué)角度鑒定比較人工異源四倍體和親本及陸地棉的差異，以及鑒定其本身的真實(shí)性。葉面積測(cè)量?jī)x型號(hào)為YMJ-A。

1.2.2 流式細(xì)胞儀倍性檢測(cè)

對(duì)多倍體后代植株進(jìn)行流式細(xì)胞倍性檢測(cè)，參照Dole?el［13］的方法按以下步驟進(jìn)行操作：（1）從溫室取20 mg的新鮮嫩葉，洗凈放在塑料培養(yǎng)皿的中心，加入1 mL裂解液。（2）立即用一次性手術(shù)刀片將嫩葉切碎，混勻數(shù)次。（3）用42 μm微孔過(guò)濾膜將混合液過(guò)濾至樣品管中。（4）加入3倍濾液體積的DAPI染色液，冰上染色2 min。（5）將懸浮液引入流式細(xì)胞儀，對(duì)細(xì)胞核DNA相對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)。（6）根據(jù)公式計(jì)算待測(cè)樣品倍性，計(jì)算公式如下：

試驗(yàn)所用流式細(xì)胞儀型號(hào)為Partec CyFlow Space。

1.2.3 人工異源四倍體的細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定

（1）取材與固定：取新鮮長(zhǎng)約2~4 mm幼蕾，剝?nèi)グ~，水洗后浸泡在卡諾氏固定液（無(wú)水乙醇∶氯仿∶冰乙酸=5∶3∶2）24 h，轉(zhuǎn)移至70%乙醇中于4 ℃保存?zhèn)溆?。?）制片：剝開固定好的花蕾，取4~5顆花藥置于載玻片上，滴加適量卡寶品紅染液，用解剖針輕擠壓花藥，使花粉母細(xì)胞逸出，去除可見雜質(zhì)，蓋上蓋玻片，酒精燈微烤載玻片2 s，使內(nèi)容物染色效果顯著，最后將濾紙放在蓋玻片上用拇指微壓，吸走溢出染液。（3）鏡檢：將新制備的載玻片放置于顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)500個(gè)以上清晰的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂行為并拍照，統(tǒng)計(jì)500個(gè)以上清晰的花粉粒并拍照。

1.2.4 SRAP分子標(biāo)記鑒定

（1）選取草雷人工異源四倍體及草棉、陸地棉新鮮嫩葉為材料，用CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒（貨號(hào)DL114-01，北京博邁德基因技術(shù)有限公司）提取DNA。（2）通過(guò)基于PCR的相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記（Sequence-related am?plified polymorphism， SRAP）對(duì)提取的DNA樣品進(jìn)行多態(tài)性分析。SRAP-PCR反應(yīng)體系：總體積10 μL，包 含5 μL 2×Taq PCR MasterMix（含 染料），2 μL ddH2O，1 μL正向引物，1 μL反向引物，1μL模板DNA（50 ng·μL-1）。（3）SRAP-PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，35 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。（4）電泳：向凝膠瓶中加入40 mL 8%非變性聚丙烯酰胺工作液、200 μL 10%過(guò)硫酸銨溶液、80 μL四甲基乙二胺，搖勻后灌膠，200 V電壓下電泳100 min，隨后用0.1%染色液銀染30 min，顯影至出現(xiàn)清晰條帶后，置于顯影儀上人工讀帶。SRAP引物參考Li等［14］，序列信息見表2，由生物工程股份有限公司合成，試驗(yàn)所用PCR擴(kuò)增儀型號(hào)為蘭杰柯SCILOGEX梯度PCR擴(kuò)增儀，電泳儀型號(hào)為北京君意JY300C型，顯影儀型號(hào)為北京六一WD-9406型。

表2 SRAP引物序列信息Table 2 Sequence information of SRAP primers

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本研究使用Microsoft Excel和SPSS軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Origin 2019b軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工異源四倍體形態(tài)學(xué)鑒定

本研究對(duì)母本草棉和人工異源四倍體植株形態(tài)進(jìn)行觀察比較（圖1）：母本草棉（圖1A）植株整體為塔狀，枝條緊湊，葉片多且密，葉色為深綠色。人工異源四倍體（圖1B）植株整體為倒塔狀，下部枝葉較少，多集中在植株中上部。

圖1 人工異源四倍體和母本草棉植株形態(tài)比較Fig.1 Plant morphology comparison between artificial allotetra?ploid and G. herbaceum

對(duì)母本草棉、父本雷蒙德氏棉和人工異源四倍體S1、S2的葉片形狀進(jìn)行觀察比較（圖2）：母本草棉葉裂在3~5裂左右，差異較大，中間3個(gè)裂片相比其它的大。父本雷蒙德氏棉為心型葉，無(wú)葉裂。草雷異源四倍體S1和S2葉片趨近母本，葉裂在5裂左右，裂刻深且窄。此外，人工異源四倍體葉片出現(xiàn)葉脈皺縮現(xiàn)象。S1、S2的葉片和陸地棉TM-1相比：大小較陸地棉小，裂片數(shù)較陸地棉多且裂刻較深，顏色較陸地棉深。對(duì)P1、P2及四倍體植株葉面積、葉形指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示人工異源四倍體與親本在葉面積、葉形指數(shù)均存在極顯著差異（表3），并且數(shù)值大小間于親本之間（圖3）。

圖2 不同世代人工異源四倍體和親本及陸地棉葉片形態(tài)比較Fig.2 Leaf morphology comparison between artificial allotetra?ploids of different generations， its parents and G. hirsutum TM-1

圖3 葉面積、葉形指數(shù)在人工異源四倍體及親本之間的變化趨勢(shì)Fig.3 Trends of leaf area， leaf index between artificial allotetra?ploids and its parents

表3 人工異源四倍體和親本葉片性狀的差異顯著性分析Table 3 Difference significance analysis of leaf traits between artificial allotetraploids and its parents

2.2 流式細(xì)胞倍性檢測(cè)結(jié)果

以陸地棉TM-1做參照，用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)人工異源四倍體植株的相對(duì)DNA含量，結(jié)果顯示（表4，圖4），TM-1的熒光峰值為215.94，所選4株S2-1、S2-2、S2-3、S2-4的 熒 光 峰 值 分 別 為246.43、232.39、195.52、232.21，所選1株S3熒光峰值為258.46。檢測(cè)結(jié)果表明，所選5株人工異源四倍體S2代和S3代植株的熒光峰值與陸地棉TM-1接近，均為異源四倍體。同時(shí)可以看到多倍體后代不同單株間熒光強(qiáng)度差異較大，可能是由于在人工合成新多倍體的過(guò)程中，染色體組發(fā)生了復(fù)雜的重組，期間可能發(fā)生片段的丟失等去冗余的情況。

圖4 不同世代人工異源四倍體流式細(xì)胞倍性檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Flow cytometry results for ploidy level in artificial allotetraploids of different generations

表4 不同世代人工異源四倍體流式細(xì)胞倍性檢測(cè)結(jié)果Table 4 Flow cytometry results for ploidy level in artificial allotetraploids of different generations

2.3 人工異源四倍體細(xì)胞學(xué)鑒定

對(duì)陸地棉及親本的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂行為進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)其減數(shù)第一次分裂和減數(shù)第二次分裂均正常，減數(shù)第二次分裂末期形成的四分體大小一致，分布均勻。對(duì)草雷人工異源四倍體S2和S3花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂分別進(jìn)行500次重復(fù)觀察并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，S2和S3減數(shù)分裂都存在異常行為。主要表現(xiàn)在：在減數(shù)分裂末期既出現(xiàn)大小正常的單分體和二分體（圖5A、圖5B），也出現(xiàn)分裂不均等的四分體（圖5C），異常減數(shù)分裂行為可能是第1次減數(shù)分裂前期同源染色體聯(lián)會(huì)出現(xiàn)紊亂，多價(jià)體不均等分離造成；在四分體時(shí)期，會(huì)形成三分體到八分體等異常多分體（圖5E~圖5H），同時(shí)也會(huì)有正常四分體出現(xiàn)（圖5D）。對(duì)觀察結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表5），S2正常四分體比例為23.4%，S3正常四分體比例為44.8%，高于S2，但遠(yuǎn)低于陸地棉。正常四分體和異常四分體都有可能發(fā)育成花粉粒，在研究中觀察到了多種形態(tài)的花粉粒，如破裂的花粉粒（圖6A），橢圓形花粉粒（圖6B），發(fā)育不全的花粉粒（圖6C），正?；ǚ哿＃▓D6D）。對(duì)草雷人工異源四倍體S2和S3花粉粒形態(tài)分別進(jìn)行500次重復(fù)觀察并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表6），結(jié)果顯示，S2正?；ǚ哿１壤秊?5.4%，S3正常花粉粒比例為64.4%，高于S2。統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)一步表明人工異源四倍體的育性在逐代恢復(fù)，但還需要繼續(xù)種植并自交進(jìn)一步穩(wěn)定和提高其育性。

圖6 人工異源四倍體花粉粒形態(tài)Fig.6 Pollen grain morphology for artificial allotetraploid

表6 人工異源四倍體花粉粒形態(tài)數(shù)量及比例Table 6 Number and proportion of pollen grain morpholo?gy for artificial allotetraploid

圖5 人工異源四倍體花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂行為Fig.5 Meiosis behavior of pollen mother cells for artificial allotetra?ploid

表5 人工異源四倍體減數(shù)分裂末Ⅱ多分體數(shù)量及比例Table 5 Number and proportion of polyad for artificial allotetraploid in telophase II of meiosis

2.4 SRAP分子標(biāo)記鑒定

本研究對(duì)25對(duì)SRAP隨機(jī)引物進(jìn)行篩選，選出13對(duì)多態(tài)性好的引物應(yīng)用于本試驗(yàn)。從擴(kuò)增結(jié)果可知（表7），13對(duì)引物共擴(kuò)增出106個(gè)清晰條帶，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出8.15個(gè)條帶，其中有57個(gè)多態(tài)性條帶，單對(duì)引物多態(tài)性條帶比例在22.22%~85.71%之間，平均每對(duì)引物多態(tài)性條帶比例為44.60%。在引物Me4-Em2中不僅擴(kuò)增出相同的條帶，還擴(kuò)增出特異性條帶（圖7左）；在Me2-Em5中除了擴(kuò)增出S2、S3共有的特異性條帶，還擴(kuò)增出S3獨(dú)有的特異性條帶（圖7右）。對(duì)多態(tài)性條帶進(jìn)行分析（表8），人工異源四倍體有26個(gè)條帶與陸地棉具有一致性，18個(gè)條帶與母本草棉具有一致性，13個(gè)為特異性條帶，其遺傳比例分別為46%、31%、23%（圖8）。分析結(jié)果表明，人工異源四倍體與陸地棉染色體組均為AADD，其基因組具有高度同源性，但新形成的異源四倍體與陸地棉分子水平存在差異，這也間接證明人工選擇對(duì)陸地棉基因組進(jìn)化產(chǎn)生的影響。下一步期望通過(guò)和陸地棉雜交，觀察分析其是否存在生殖隔離以及對(duì)其雜種后代進(jìn)行性狀分析鑒定，進(jìn)一步育成生產(chǎn)上有利用價(jià)值的新品種。

圖8 人工異源四倍體的SRAP多態(tài)性分布Fig.8 The resources of SRAP polymorphism for artificial allotetra?ploid

表8 草雷人工異源四倍體SRAP多態(tài)性分析Table 8 Analysis of SRAP polymorphisms for artificial al?lotetraploid

圖7 SRAP引物擴(kuò)增結(jié)果Fig.7 The results of SRAP primes

表7 13對(duì)SRAP引物擴(kuò)增結(jié)果Table 7 The results of 13 pairs of SRAP primer

3 討論

3.1 棉屬多倍體起源與進(jìn)化

多倍體化普遍發(fā)生在植物的進(jìn)化過(guò)程中，是形成新物種的重要途徑。棉花是研究植物多倍體化的一個(gè)重要類群［15］，最初以細(xì)胞學(xué)為基礎(chǔ)，通過(guò)分子系統(tǒng)學(xué)研究將二倍體棉種細(xì)分為A~G和K8個(gè)基因組［16］。大量證據(jù)表明，自然界5個(gè)四倍體棉花是異源多倍體，其中一個(gè)基因組類似于舊世界A基因組二倍體，另一個(gè)基因組類似于新世界的D基因組二倍體［17］。由于自然界異源四倍體的2個(gè)親本基因組存在于不同半球的二倍體物種中，因此異源多倍體棉花是如何以及何時(shí)形成的問(wèn)題已經(jīng)引發(fā)了半個(gè)多世紀(jì)的討論。有研究表明A1組的草棉和A2組的亞洲棉都可能是異源四倍體棉種A基因組的祖先供體種。Stephens等［18］最早采用遺傳學(xué)和形態(tài)學(xué)證據(jù)表明A2是現(xiàn)存異源四倍體棉種的供體種；但Gerstel等［19］通過(guò)細(xì)胞遺傳學(xué)研究堅(jiān)持認(rèn)為A1比A2更接近異源四倍體的供體種。吳玉香等［20］對(duì)草棉×雷蒙德氏棉、草棉×瑟伯氏棉、亞洲棉×雷蒙德氏棉、亞洲棉×瑟伯氏棉四個(gè)雜交組合分析發(fā)現(xiàn)，D組雷蒙德氏棉與A1、A2雜交都能成功產(chǎn)生雜種后代，驗(yàn)證了雷蒙德氏棉作為D基因組供體種。A和D兩個(gè)基因組在棉屬進(jìn)化的早期大約700~1100萬(wàn)年前曾各自經(jīng)歷了單獨(dú)進(jìn)化，約100~200萬(wàn)年前發(fā)生了舊世界棉種A染色體組供體種和新世界D染色體組供體種的雜交，隨后經(jīng)歷了雜種染色體加倍形成了異源四倍體，接著新形成的異源四倍體經(jīng)歷了上千年亞基因組的不對(duì)稱選擇和進(jìn)化［21］。最近幾年，一批人工合成的棉花多倍體已經(jīng)報(bào)道出來(lái)。Liu等［22］以A組草棉和G組澳洲棉為親本雜交再加倍獲得異源多倍體植株（基因組AAGG）；申?duì)顮畹龋?3］對(duì)栽培種陸地棉和野生種斯特提棉的雜種后代及多倍體后代（基因組AADDCC）進(jìn)行陸地棉有參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析了三倍體雜種植株及異源六倍體植株與兩親本的基因表達(dá)水平；楊亞杰等［24］對(duì)草棉進(jìn)行染色體加倍，經(jīng)流式細(xì)胞倍性檢測(cè)和細(xì)胞學(xué)鑒定，獲得了草棉三倍體和同源四倍體植株，并成功收獲多倍體種子。本研究獲得的草雷人工異源四倍體基因組為AADD，與陸地棉基因組一致，為棉屬遠(yuǎn)緣雜交種質(zhì)創(chuàng)新及基因組進(jìn)化提供了新思路。

3.2 新合成人工異源四倍體的應(yīng)用前景

棉屬種間雜種后代遺傳變異非常豐富，通過(guò)人工遠(yuǎn)緣雜交使得培育出具有野生種質(zhì)資源優(yōu)勢(shì)的可栽培棉種成為可能。聶以春等［25］成功將亞洲棉和司篤克氏棉雜交及加倍獲得異源四倍體雜種（基因組A2A2E1E1），經(jīng)過(guò)十二代自交培育出結(jié)鈴率高、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的新棉花種質(zhì)資源。本研究以草棉為母本，雷蒙德氏棉為父本進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，得到AD遠(yuǎn)緣雜種和人工異源四倍體AADD，并從形態(tài)學(xué)和分子水平進(jìn)行了雜種鑒定，分子水平表明雜種中既有父母本的條帶又存在新條帶，說(shuō)明親本染色體進(jìn)行了遺傳重組［2］。人工異源四倍體基因組和陸地棉一致，流式細(xì)胞結(jié)果顯示，所選多倍體植株熒光峰值與陸地棉接近，均為異源四倍體。分子鑒定結(jié)果顯示：在多態(tài)性條帶中，異源四倍體植株有26個(gè)條帶與陸地棉具有一致性，細(xì)胞學(xué)鑒定結(jié)果顯示：S3代比S2代有較高的育性，表明人工異源四倍體植株育性在逐代恢復(fù)。由于草棉與雷蒙德氏棉親緣關(guān)系遠(yuǎn)，雜種一代在減數(shù)分裂時(shí)，染色體無(wú)法正常配對(duì)［2］，在對(duì)其進(jìn)行秋水仙堿加倍處理后，可配對(duì)的同源染色體增多，育性有所恢復(fù)，但還需要繼續(xù)對(duì)其進(jìn)行性狀觀察，并進(jìn)一步恢復(fù)其育性，未來(lái)期望通過(guò)和陸地棉雜交，觀察分析其是否存在生殖隔離以及對(duì)其雜種后代進(jìn)行性狀分析鑒定，進(jìn)一步育成生產(chǎn)上有利用價(jià)值的新品種。下一步也將對(duì)所獲得的AD遠(yuǎn)緣雜種、人工合成的異源四倍體棉種及其參考物種陸地棉進(jìn)行表觀遺傳研究，進(jìn)一步闡明親本基因組在雜種中的互作機(jī)理和表達(dá)模式，探討伴隨著雜交加倍后基因的表達(dá)變化和基因組進(jìn)化趨勢(shì)，為棉屬異源四倍體棉種形成和起源進(jìn)化及其基因表達(dá)調(diào)控提供最直觀的分子遺傳解析。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交和加倍合成人工異源四倍體，并對(duì)其進(jìn)行一系列鑒定分析。形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果表明人工異源四倍體性狀間于2親本之間，流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明其為異源四倍體，花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察結(jié)果表明異源四倍體的育性在逐代恢復(fù)，SRAP分子標(biāo)記結(jié)果表明人工異源四倍體出現(xiàn)了新條帶，并且與陸地棉基因組具有同源性，本研究為探討自然界棉屬異源四倍體起源與進(jìn)化提供了新思路，也為棉屬種質(zhì)創(chuàng)新提供了新材料。