范韋華, 王重陽(yáng)

（河南大學(xué)邁阿密學(xué)院， 河南 開封 475004）

0 引言

多環(huán)芳烴 （Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs）是指分子中含有2 個(gè)或2 個(gè)以上并環(huán)苯環(huán)結(jié)構(gòu)的持久性有機(jī)污染物。由于其在環(huán)境中廣泛分布，難以降解，并具有致癌、致畸、致突變的“三致”特性，嚴(yán)重威脅著生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定性和人類的生命健康安全[1]，已引起各方面的廣泛關(guān)注。2005年4月至2013年12月《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》數(shù)據(jù)表明，我國(guó)受PAHs 污染土壤的點(diǎn)位超標(biāo)率為1.4%，PAHs污染廣泛分布于耕地、工業(yè)廢棄地、工業(yè)園區(qū)、采油區(qū)、采礦區(qū)、污水灌溉區(qū)、干線公路兩側(cè)等地。

目前對(duì)PAHs 的降解方法主要有化學(xué)氧化法、光催化氧化法、化學(xué)淋洗法、微生物修復(fù)技術(shù)、熱修復(fù)技術(shù)、電動(dòng)修復(fù)技術(shù)、植物修復(fù)技術(shù)等[2]。由于微生物修復(fù)技術(shù)具有經(jīng)濟(jì)且環(huán)境友好等特點(diǎn)， 因此在處理有機(jī)污染物方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)[3]。 然而，鹽環(huán)境自身具有以下的特殊性：①滲透壓增加,容易破壞細(xì)胞膜；②降低溶解氧含量；③鹽析作用使得PAHs 的溶解性降低，繼而進(jìn)一步降低生物可利用性；④鹽析作用容易導(dǎo)致酶，尤其是胞外酶的變性[4]。 這些性質(zhì)使得具有良好PAHs 降解能力的普通微生物無法在鹽環(huán)境中發(fā)揮功能。 耐鹽/嗜鹽菌具有較好的鹽度耐受性，在鹽環(huán)境中可發(fā)揮良好的降解作用，從而達(dá)到去除PAHs 的目的，因此，對(duì)此類微生物資源的深入研究將為鹽環(huán)境中PAHs 的降解起到技術(shù)支撐。

1 嗜鹽PAHs 降解菌

近代工業(yè)的發(fā)展使石油得到了越來越廣泛的應(yīng)用，PAHs 是石油中重要的持久性有機(jī)污染物之一。 因此， 隨著石油的開采、運(yùn)輸和使用，大量的PAHs 被排放進(jìn)入環(huán)境中，造成了嚴(yán)重的危害[5]。 生物降解為去除環(huán)境中的PAHs 提供了一種重要的手段，早在1950年，有研究[6]發(fā)現(xiàn)菌屬Pseudomonas中的細(xì)菌可在好氧條件下降解PAHs。 1976年KIYOHARA H 等[7]在土壤中分離得到可降解菲的菌屬Aeromonas。 1989年HEITKAMP M A 等[8]在油田的巖石中分離出可降解芘的菌屬M(fèi)ycobacterium。 截至2018年， 共發(fā)現(xiàn)了100 余屬的細(xì)菌具有降解PAHs 的功能， 其中最典型的為Pseudomonas,Mycobacterium,Rhodoccus 等[9]。絕大多數(shù)PAHs 降解菌均為普通菌，缺乏在鹽環(huán)境中降解PAHs 的能力。嗜鹽菌可耐受較為廣泛的鹽度變化， 且具有營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單、代謝能力強(qiáng)等特點(diǎn),被認(rèn)為是鹽環(huán)境中污染物修復(fù)的重要微生物資源。 但由于其篩選條件的苛刻，此類微生物資源一直較少。 近年來，隨著對(duì)各種PAHs 降解菌的深入研究，分離出的嗜鹽PAHs 降解菌株也越來越多。 如今分離篩選出可降解多環(huán)芳烴的嗜鹽菌主要來自于菌屬Cycloclasticus,Micrococcus,Pseudomonas putida,Alcaligenes,Haloarcula 等。典型的耐鹽/嗜鹽PAHs 降解菌見表1。

表1 典型的耐鹽/嗜鹽PAHs 降解菌

2 嗜鹽PAHs 降解菌的代謝途徑

目前， 對(duì)部分嗜鹽菌中PAHs 降解途徑的研究主要集中在真菌（Aspergillus,Penicillium 等）和細(xì)菌（Marinobacter,Cycloclasticus 等） 對(duì)PAHs 的好氧降解及少數(shù)嗜鹽菌對(duì)PAHs 的厭氧降解。

2.1 好氧代謝途徑

好氧降解指微生物在有氧條件下， 將氧氣作為最終電子受體對(duì)污染物進(jìn)行降解。 在PAHs 降解過程中， 真菌一般通過木質(zhì)素酶系(木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶)和細(xì)胞色素P450 酶系(細(xì)胞色素P450、細(xì)胞色素b5、NADPH- 細(xì)胞色素P450還原酶、NADH-細(xì)胞色素b5 還原酶和磷脂) 降解PAHs[10]。 田晶[11]研究發(fā)現(xiàn)中度嗜鹽菌Aspergillus flavus sp. AD-X-1 和Penicillium chrysogenum sp.APD-X-1 通過木質(zhì)素酶系降解PAHs， 木質(zhì)素酶系通過開環(huán)作用把PAHs 代謝成為水溶性較強(qiáng)的醌類中間產(chǎn)物后再由其進(jìn)行后續(xù)降解。細(xì)胞色素P450 單加氧酶氧化PAHs 形成環(huán)氧化物后水解形成反式二氫二醇類衍生物參與接下來的降解反應(yīng)， 或形成中間體與其他物質(zhì)相結(jié)合，進(jìn)行下一步的降解[12]。

由于降解PAHs 細(xì)菌種類更多， 故在降解多環(huán)芳烴的應(yīng)用比真菌更為廣泛。王重陽(yáng)[9]研究發(fā)現(xiàn)嗜鹽菌Marinobacter sp.N4 和Halomonas sp.G29 通過水楊酸途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)菲的聯(lián)合降解。 于瑤瑤等[13]通過萃取中度嗜鹽菌Demequina salsinemorus sp. BJ1 降解蒽的中間代謝產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析， 發(fā)現(xiàn)主要產(chǎn)物為9,10-蒽醌和鄰苯二甲酸等, 說明其通過鄰苯二甲酸途徑降解蒽。 余志偉[14]采用Cycloclasticus sp.P1 通過2 次雙加氧和開環(huán)生成1-羥基-2-萘甲酸后，經(jīng)水楊酸途徑降解芘。 嗜鹽微生物對(duì)PAHs 的降解也可以同時(shí)存在水楊酸和鄰苯二甲酸途徑。周海燕[15]通過GC-MS 分析嗜鹽菌Halassospira sp.TSL5-1 對(duì)芘的降解過程中發(fā)現(xiàn)同時(shí)存在水楊酸途徑和鄰苯二甲酸代謝途徑。嗜鹽菌對(duì)菲的降解途徑及其中間產(chǎn)物，詳見圖1。

圖1 嗜鹽菌對(duì)菲的降解途徑及其中間產(chǎn)物

2.2 厭氧代謝途徑

大多數(shù)微生物需在有氧的條件下降解PAHs，但在江河湖泊的底泥和海底沉積物中， 研究發(fā)現(xiàn)了兼性厭氧PAHs 降解菌和嚴(yán)格的PAHs 降解菌。 如NADEZHDA F 等[16]從污水處理廠的污泥中分離出可在厭氧條件下降解PAHs 的菌屬Bacillus cereus，SELESI 等[17]從河道底泥中篩選分離出可降解2-甲基萘的厭氧菌群Desulfobacterium sp.N47。厭氧降解途徑主要利用無機(jī)分子作為最終電子受體降解轉(zhuǎn)化PAHs，其主要反應(yīng)涉及羥基化、甲基化、羧化反應(yīng)、延胡索酸鹽結(jié)合反應(yīng)等[18]。 孫明明等[19]研究發(fā)現(xiàn)硫酸鹽還原細(xì)菌降解菲的途徑是通過菲分解成對(duì)甲酚后進(jìn)行甲基羥基化， 生成對(duì)羥基苯甲醇或?qū)αu基苯甲醛后再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為對(duì)羥基苯甲酸和酚， 最后發(fā)生脫羧反應(yīng)后將菲徹底厭氧降解。

好氧降解不僅效率高而且速率快， 是高鹽環(huán)境下治理PAHs 污染最有效的途徑之一。 而厭氧降解因其中間代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單、毒性較小,也逐漸成為多環(huán)芳烴污染治理的有效途徑之一。

3 耐鹽/嗜鹽PAHs 降解菌的降解機(jī)制

3.1 耐鹽/嗜鹽PAHs 降解菌降解機(jī)制

目前研究發(fā)現(xiàn)降解PAHs 的功能基因簇包括nah，phd，nag，phn，nar，nid 等6 類[20]，大部分可降解多環(huán)芳烴的微生物均含有與它們具有很高同源性的基因簇，而在高鹽環(huán)境下，部分基因簇控制的酶系活性較低，對(duì)于嗜鹽菌而言，其降解PAHs 的功能基因簇主要為nah 基因簇和其他基因簇， 嗜鹽PAHs 降解菌nah 降解基因簇排列順序，見圖2。

圖2 嗜鹽PAHs 降解菌nah 降解基因簇排列順序

nah 基因簇是一大類降解基因簇, 目前可分離培養(yǎng)的降解菌株主要以nah 基因簇或經(jīng)典的“nahlike”基因簇為主，如dox，pah，pdo 等。 nah/nah-like基因簇排列順序?yàn)閚ahAaAbAcAdBFCQED, 大部分能降解PAHs 的基因排列順序與組成與其相似。nah降解基因一般由3 個(gè)操縱子組成,nah1 編碼的酶將萘轉(zhuǎn)化成水楊酸，nah2 編碼的酶通過間位裂解將水楊酸降解為中間代謝產(chǎn)物進(jìn)入TCA 循環(huán)， 在nah1和nah2 之間，還存在一個(gè)調(diào)節(jié)基因nah3，該基因表達(dá)后的蛋白會(huì)促進(jìn)nah1 和nah2 的表達(dá)。 如嗜鹽菌群Sphingomonas CHY-1 中基因簇nahAaAbAcAdBFCED 將菲降解成為1,2-二羥基萘，再由基因簇nahGTHINLOMKJ 進(jìn)一步進(jìn)行降解，同時(shí)在nahR 調(diào)控基因下，菲完全降解[21]。 何芬等[22]通過分析嗜鹽PAHs 降解菌群的6 種萘雙加氧酶（ndo）基因型,發(fā)現(xiàn)其中3 種主要基因型（占總克隆子92.7%）與經(jīng)典nah-like 基因的相似度為89%。 張心平等[23]通過對(duì)Pseudomonas sp. ND6 的降解質(zhì)粒pND6 進(jìn)行DNA雜交實(shí)驗(yàn)， 發(fā)現(xiàn)pND6 質(zhì)粒含有與Pseudomonas sp.G7 菌株NAH7 質(zhì)粒同源基因nahY。 王重陽(yáng)對(duì)嗜鹽菌Marinobacter sp. N4 中PAHs 上游降解基因簇Hpah1 的排列方式與Pseudomonas sp. G7 中PAHs降解基因簇nah1 進(jìn)行相似性分析， 相似性達(dá)80%，其推測(cè)認(rèn)為Marinobacter sp.N4 中的Hpah 與Burkholderiales 中的nag 降解基因可能存在水平轉(zhuǎn)移，并由nag 降解基因在海洋鹽環(huán)境中進(jìn)化為耐鹽的Hpah 降解基因簇[9]。

目前， 雖然對(duì)嗜鹽PAHs 降解基因簇大部分由普通PAHs 降解基因進(jìn)化而來， 但還存在其他降解基因簇與其差異性較大。 如Rhodococcus sp.OA1 降解基因簇pcaJIGHBARC，與傳統(tǒng)基因簇調(diào)控的鄰苯二酚和水楊酸降解途徑不同， 其可通過原兒茶酸途徑降解PAHs[24]。 耐鹽菌Cycloclasticus sp.A5 功能基因簇phnA1bA1aA2CA4A3D 與普通PAHs 降解菌Burkholderia sp. RP007 中基因簇排列順序phnRSFECDAcAdB 完全不同[25]。據(jù)此推測(cè)，嗜鹽菌或具有與普通環(huán)境中PAHs 降解菌類似的降解基因簇，也可能具有與普通降解菌差異較大的基因簇，關(guān)于嗜鹽PAHs 降解菌中的降解基因及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，有待進(jìn)一步研究。

3.2 耐鹽/嗜鹽PAHs 降解菌的耐鹽機(jī)制

嗜鹽菌的耐鹽機(jī)制主要有3 個(gè)方面： ①吸鉀排鈉；②胞內(nèi)積累小分子相容性溶質(zhì)；③嗜鹽酶的氨基酸組成特性[26]，這3 個(gè)機(jī)制確保了嗜鹽PAHs 降解菌在高鹽環(huán)境有較好的鹽度耐受性， 可高效降解PAHs。 其中吸鉀排鈉機(jī)制主要由nha H 基因、trk 類基因和Kdp 類基因調(diào)控。nha H 基因通過增強(qiáng)Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性而減少嗜鹽菌細(xì)胞體內(nèi)的Na+濃度，trk 類基因和kdp 類基因通過調(diào)節(jié)K+/Cl-單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來提高細(xì)胞內(nèi)K+濃度，從而維持在高鹽環(huán)境下細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡。 高鹽壓力下嗜鹽菌在胞內(nèi)會(huì)積累小分子相容性溶質(zhì)如糖類、氨基酸等，這些小分子物質(zhì)既不影響細(xì)胞代謝還可提高胞內(nèi)水活度，從而使內(nèi)外滲透壓達(dá)到平衡。 同時(shí)，嗜鹽菌的蛋白質(zhì)肽鏈發(fā)生折疊,形成獨(dú)特的功能結(jié)構(gòu)，保證酶活性正常發(fā)揮[27]。

從分子水平來探索其降解途徑和降解機(jī)制, 分析菌株在高鹽環(huán)境下對(duì)PAHs 的降解特性， 深入研究各類相關(guān)功能基因， 對(duì)于研究微生物高效處理高鹽環(huán)境中有機(jī)污染物方面具有一定的指導(dǎo)意義，可極大促進(jìn)對(duì)PAHs 污染修復(fù)機(jī)理的了解， 更好地解釋環(huán)境中PAHs 的去除過程。 同時(shí)可結(jié)合已獲得PAHs 降解基因簇以及與耐高鹽相關(guān)基因，探究?jī)烧叩膮f(xié)同作用， 利用調(diào)控基因和嗜鹽酶的氨基酸組成特點(diǎn)等將傳統(tǒng)的PAHs 降解菌改造為耐鹽/嗜鹽PAHs 降解高效基因工程菌，可更好地將其應(yīng)用于微生物修復(fù)。 但目前對(duì)于耐鹽/嗜鹽菌的研究還不夠深入，何芬等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，ndo 基因的相對(duì)表達(dá)量在鹽度為10%下較在鹽度為20%下高, 證明了鹽度可抑制嗜鹽菌群功能基因的表達(dá)， 從而影響其降解速率。 但確切的鹽度對(duì)PAHs 生物降解的影響機(jī)制仍有待深入研究。

4 結(jié)論

多環(huán)芳烴的生物降解是目前國(guó)內(nèi)外研究的一大熱點(diǎn)，無論是降解特性、降解途徑、降解機(jī)制還是實(shí)際應(yīng)用等均有深入的研究。 但是如今對(duì)于一些極端條件下，PAHs 降解菌屬不夠豐富，對(duì)其降解機(jī)理的認(rèn)知仍然不足。 隨著高鹽環(huán)境中的多環(huán)芳烴污染日益嚴(yán)重， 嗜鹽微生物的篩選和分子機(jī)制等方面的研究仍將是今后研究的熱點(diǎn)。 目前嗜鹽PAHs 的降解菌屬約有100 多種， 根據(jù)對(duì)PAHs 的降解途徑一般分為好氧降解和厭氧降解。 好氧降解主要通過鄰苯二甲酸和水楊酸代謝途徑降解， 厭氧降解中間代謝產(chǎn)物簡(jiǎn)單，主要涉及羥基化、甲基化、羧化反應(yīng)、延胡索酸鹽結(jié)合反應(yīng)等。 嗜鹽菌降解PAHs 的功能基因簇主要來源于普通的PAHs 降解基因簇的進(jìn)化或其他差異較大的基因簇。 嗜鹽菌的耐鹽機(jī)制包括吸鉀排鈉、 積累小分子相容性溶質(zhì)和嗜鹽酶的氨基酸組成特性3 方面。 關(guān)于嗜鹽PAHs 降解菌的研究可為在高鹽堿環(huán)境下多環(huán)芳烴污染修復(fù)工程的實(shí)際應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。 如可利用微生物技術(shù)去富集篩選降解PAHs 的嗜鹽菌純菌或核心小菌群并對(duì)其降解途徑和降解特性進(jìn)行研究， 對(duì)相關(guān)功能基因進(jìn)行篩選擴(kuò)增,通過基因重組、原生質(zhì)體融合等各種構(gòu)建技術(shù)等分子生物學(xué)手段去構(gòu)建高效基因工程菌以達(dá)到高效的生物修復(fù)。