鄧振進(jìn)，黃海萍，曹俐，周陽，鄔鵬程，高飛，劉向榮，姚健，彭明霞，陳新平

1. 湖南省醫(yī)療器械檢驗(yàn)檢測(cè)所，湖南 長(zhǎng)沙 410011；2. 湖南樂準(zhǔn)智芯生物科技有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410205

引言

化學(xué)發(fā)光是化學(xué)反應(yīng)過程中產(chǎn)生光的現(xiàn)象，這個(gè)過程可以被描述為：A+B→[I]*→產(chǎn)物+光[1]，其中，[I]*是反應(yīng)過程中形成的不穩(wěn)定的中間物質(zhì)，處于激發(fā)態(tài)，由于很不穩(wěn)定，會(huì)釋放出多余的能量回遷到穩(wěn)定的基態(tài)，同時(shí)多余的能量以光能的形式發(fā)射出來[2]?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析儀是將化學(xué)發(fā)光和免疫分析結(jié)合起來的技術(shù)，通過標(biāo)記的抗原或抗體與待測(cè)物進(jìn)行一系列免疫反應(yīng)[3]，最后通過測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度得出待測(cè)物含量[4]。

化學(xué)發(fā)光過程釋放的能量非常微弱，低于常規(guī)光學(xué)儀器檢測(cè)量程，很難對(duì)微弱光強(qiáng)度的重復(fù)性、穩(wěn)定性、光源線性等參數(shù)進(jìn)行控制，目前國(guó)內(nèi)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀生產(chǎn)商大部分采用試劑進(jìn)行生產(chǎn)質(zhì)量控制，其弊端主要有：① 不同生產(chǎn)商可能選擇不同的發(fā)光體系，難以做到“標(biāo)準(zhǔn)化”；② 部分發(fā)光體系是閃光型發(fā)光（如魯米諾-過氧化氫體系），配制的試劑穩(wěn)定發(fā)光期在30 min以下，不易重復(fù)測(cè)量[5]；③ 試劑成本昂貴，不利于日常生產(chǎn)的質(zhì)量控制[6]。為了解決上述弊端，本研究擬研發(fā)一款光源，一方面要適應(yīng)全部發(fā)光體系，使標(biāo)準(zhǔn)化成為可能，另一方面要使用方便，造價(jià)低廉。

1 方法

設(shè)計(jì)主要從設(shè)計(jì)內(nèi)容、設(shè)計(jì)指標(biāo)和設(shè)計(jì)方案三個(gè)方面考慮，而設(shè)計(jì)內(nèi)容主要考慮光源結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、電路設(shè)計(jì)、光源調(diào)控設(shè)計(jì)和化學(xué)發(fā)光免疫分析儀用參考光源四個(gè)方面，具體內(nèi)容，見表1。

表1 考慮設(shè)計(jì)內(nèi)容

1.1 光源結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

根據(jù)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀使用的生物芯片結(jié)構(gòu)和尺寸設(shè)計(jì)，光源外形與生物芯片尺寸完全相同（根據(jù)不同免疫分析儀的結(jié)構(gòu)可定制）。如圖1～4所示，參考光源（包括母光源）與生物芯片結(jié)構(gòu)尺寸完全相同，能夠較好地在儀器中使用。圖1～2示光源結(jié)構(gòu)與生物芯片外形完全一致；圖3示光源開關(guān)、濾光片插槽位于光源背面；圖4示光源充電口位于光源側(cè)面。

圖1 生物芯片外形圖

圖2 參考光源前視圖

圖4 參考光源三維圖

1.2 電路設(shè)計(jì)

供電使用紐扣電池（尺寸較小，適合參考光源結(jié)構(gòu)小型化）或鋰電池（可充電，反復(fù)使用）；由于鋰電池或紐扣電池在使用過程中電壓會(huì)逐漸降低，影響光源發(fā)光穩(wěn)定[7]。電路中采用MAX1724芯片穩(wěn)壓，將電池的電壓升壓至5 V后穩(wěn)定輸出。即使電池電壓降低，也能保證電路5 V恒壓供電。當(dāng)電池電壓低于0.8 V時(shí)，升壓模塊停止工作，光源熄滅。如圖5所示，該電路利用兩個(gè)NPN型三極管Q2和Q3及電阻R9形成恒流模塊，保證能夠恒流供電給發(fā)光件，進(jìn)而保證發(fā)光件處的穩(wěn)定光強(qiáng)輸出，光子計(jì)數(shù)穩(wěn)定性CV<1%，滿足化學(xué)發(fā)光免疫分析儀使用要求。

圖5 母光源供電電路

1.3 光源調(diào)控設(shè)計(jì)

圖6未增加干涉濾光片或中性密度濾光片的光源為母光源，增加干涉濾光片或中性密度濾光片后構(gòu)成參考光源。干涉濾光片可控制光譜輸出，中性密度濾光片可控制輸出光強(qiáng)[8]。

光源使用LED，單色或白色。單色LED可不使用干涉濾光片，根據(jù)所需光譜選擇合適的單色LED[9]。白色LED可配合干涉濾光片使用，干涉濾光片能有效地控制光源輸出光譜（干涉濾光片規(guī)格眾多，可根據(jù)需要選取）。

選擇合適透過率的中性密度濾光片插入母光源中，可有效控制光源的輸出光強(qiáng)，構(gòu)成參考光源。中性密度濾光片透過率可準(zhǔn)確計(jì)量，濾光片透過率與光源相對(duì)強(qiáng)度呈正比，透過率可表述為光源相對(duì)光強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)溯源[10]，可選濾光片型號(hào)和透過率，見表2。

表2 濾光片型號(hào)和透過率

擴(kuò)散凝膠作為光擴(kuò)散劑，能有效地將光散射，實(shí)現(xiàn)光源的均勻輸出[11]。該部分可以模擬試劑各方向均勻發(fā)光特點(diǎn)，提高光源與試劑發(fā)光的相似性。

外殼內(nèi)還設(shè)計(jì)有位于發(fā)光件與第一中性濾光片之間光路上的反射片。發(fā)光件發(fā)出的光通過反射片反射后再經(jīng)過第一中性濾光片，可以避免將發(fā)光件、第一中性濾光片、光輸出窗口設(shè)置在同一直線上，從而避免形成長(zhǎng)直光路，縮小外殼在單一方向上的尺寸。

1.4 化學(xué)發(fā)光免疫分析儀用參考光源

如圖6所示，將合適透過率（τ=0.01%）的中性密度濾光片插入母光源中即構(gòu)成參考光源，將光源強(qiáng)度衰減到儀器線性范圍下限，測(cè)量化學(xué)發(fā)光免疫分析儀的重復(fù)性、穩(wěn)定性[12]；從表2中選擇5個(gè)中性密度濾光片，插入母光源中構(gòu)成參考光源，光源強(qiáng)度覆蓋3個(gè)數(shù)量級(jí)，共構(gòu)成5個(gè)參考光源，測(cè)量化學(xué)發(fā)光免疫分析儀的線性[13]。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)裝置及示意圖

具有單光子探測(cè)器的測(cè)試裝置本身提供暗室或在光暗室內(nèi)測(cè)量來排除環(huán)境干擾。單光子探測(cè)器光譜響應(yīng)范圍需要覆蓋光源光譜范圍，同時(shí)單光子探測(cè)器需要在其線性范圍內(nèi)工作[14]。如濱松H10682-110單光子探測(cè)器，測(cè)試距離：?jiǎn)喂庾犹綔y(cè)器距離光源35 mm[15]，見圖7。

圖7 檢測(cè)裝置及示意圖

2.2 重復(fù)性測(cè)試

選用接近線性范圍下限的參考光源進(jìn)行測(cè)試，連續(xù)測(cè)試10次，將所得數(shù)據(jù)按公式(1)～(2)計(jì)算變異系數(shù)（Coefficient of Variation，CV，%）[16-19]，重復(fù)性測(cè)試結(jié)果，見表3。

表3 重復(fù)性測(cè)試結(jié)果

其中，s是標(biāo)準(zhǔn)差，是10次測(cè)量結(jié)果的算術(shù)平均值，Xi是每次實(shí)測(cè)結(jié)果，n是實(shí)測(cè)的次數(shù)，CV是變異系數(shù)。

2.3 穩(wěn)定性測(cè)試

選用接近線性范圍下限的參考光源進(jìn)行測(cè)試，連續(xù)測(cè)試10次，兩次測(cè)試之間的間隔時(shí)間至少為3 min，記錄測(cè)光值，用公式(3)計(jì)算相對(duì)極差[16-19]，穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果，見表4。

表4 穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果

其中，Xmax是10次測(cè)量結(jié)果的最大值，Xmin是10次測(cè)量結(jié)果的最小值，是10次測(cè)量結(jié)果的平均值。

2.4 光源線性測(cè)試

至少使用5個(gè)強(qiáng)度的參考光源，參考光源發(fā)光強(qiáng)度覆蓋3個(gè)數(shù)量級(jí)，每個(gè)光源重復(fù)測(cè)量3次，并記錄參考光源的測(cè)量結(jié)果。計(jì)算各光源3次測(cè)量結(jié)果的平均值（yi）。以每個(gè)光源的標(biāo)定功率或標(biāo)定的功率相對(duì)值（xi）即透過率為自變量，以實(shí)際測(cè)試得到的發(fā)光值（yi）為因變量求出線性回歸方程，按照公式(4)計(jì)算線性回歸的相關(guān)系數(shù)r[16-19]。

其中，r是相關(guān)系數(shù)，xi是各個(gè)樣品的標(biāo)定功率或標(biāo)定的功率相對(duì)值，yi是各個(gè)樣品測(cè)定結(jié)果的均值，是標(biāo)定功率或標(biāo)定的功率相對(duì)值的均值是光源測(cè)定總結(jié)果的均值。

表5 光源線性測(cè)試結(jié)果

3 討論

目前國(guó)內(nèi)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀生產(chǎn)商大部分采用試劑進(jìn)行生產(chǎn)質(zhì)量控制，試劑難以做到“標(biāo)準(zhǔn)化”：配制的試劑穩(wěn)定發(fā)光期在30 min以下，不易重復(fù)測(cè)量[6]且試劑成本昂貴。本研究根據(jù)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀的原理和技術(shù)特性[16-19]，設(shè)計(jì)參考光源，發(fā)光件為普通的LED燈，本設(shè)計(jì)能夠?qū)崿F(xiàn)皮瓦量級(jí)甚至更低光強(qiáng)級(jí)別的穩(wěn)定光輸出；通過更換干涉濾光片可以實(shí)現(xiàn)任意中心波長(zhǎng)的光譜輸出，從而模擬不同的化學(xué)發(fā)光試劑；通過更換第二中性濾光片可以實(shí)現(xiàn)線性光輸出；可用于化學(xué)發(fā)光免疫分析儀的校準(zhǔn)或進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試、重復(fù)性測(cè)試、線性測(cè)試；結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，適用性好，成本低，測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確可靠[20]，可在脫離試劑的情況下對(duì)儀器進(jìn)行測(cè)試，滿足儀器注冊(cè)檢測(cè)、性能評(píng)價(jià)的需求。參考光源的設(shè)計(jì)具有重大的科學(xué)意義和實(shí)用價(jià)值，批量生產(chǎn)中能提高出廠檢驗(yàn)的效率，能夠?qū)π袠I(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行補(bǔ)充和完善，推動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析行業(yè)發(fā)展。