張曉燕，王玉瑤，張虎娟，蔡宇宇

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥研究院，哈爾濱 150040)

進(jìn)口血竭，又稱麒麟血，為棕櫚科植物麒麟竭(Daemonorops draco Blume)果實(shí)滲出的樹脂加工而成[1-2]．主要的活性成分為血竭素和血竭紅素等黃酮類成分[3-4]，藥理功能有活血化瘀、止血定痛、生肌斂瘡、抗菌、降糖、抗腫瘤等作用[5-10]．主要成分中血竭素的藥理作用最強(qiáng)，廣泛應(yīng)用于血瘀，出血引起的疾病[11-17]．臨床上廣泛用于消化內(nèi)科、肛腸科、婦科以及糖尿病并發(fā)癥的治療[18-20]．

目前，國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有關(guān)于IDB的藥物代謝動(dòng)力學(xué)及組織分布方面的研究．中藥效應(yīng)成分在體內(nèi)的變化情況與選擇性分布對(duì)于闡釋中藥藥效機(jī)理等有著十分重要的意義．本實(shí)驗(yàn)旨在明確IDB口服給藥后血竭素在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)和組織分布特征, 為今后對(duì)血竭的體內(nèi)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

Sprague-Dawley大鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量(220±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(黑)20180004，室溫保持在25 ℃左右，相對(duì)濕度約為50%，光照(12 h亮/暗)，可自由取食和取水．

1.1.2 藥物與試劑

羧甲基纖維素鈉(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；IDB(哈藥集團(tuán)世一堂中藥飲片有限責(zé)任公司，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室鑒定合格)；血竭素高氯酸鹽(中國(guó)食品藥品檢定研究院，96.3%；批號(hào)：110811-201707)；乙腈(迪馬科技，色譜純)；磷酸(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，色譜純)；磷酸二氫鈉、甲醇、氯仿(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，分析純)

1.1.3 儀器

AGL21M冷凍高速離心機(jī)(上海赫田科學(xué)儀器有限公司)；ThermoU3000型高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技公司)XW-80A渦旋混合器(上海琪特分析儀器有限公司)；CM-36型圓形水浴氮吹儀(北京成萌偉業(yè)科技有限公司)；超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；生物安全性超低溫冰箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)

1.2 方法

1.2.1 灌胃液的制備

灌胃藥液為稱取IDB(過(guò)80目篩)粉末適量，超聲混懸于0.5%CMC-Na溶液中配制成0.1 g/mL的混懸液．

1.2.2 色譜條件

色譜柱為Diamonlis C18柱(250×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈∶0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(50∶50)；流速為1 mL/min，柱溫為40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為440 nm．

1.2.3 血漿樣品的采集

大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12 h, 自由飲水，按照血竭1g/Kg的劑量灌胃給藥，分別于給藥后5、15、25、35、45、60、90、120、150、180、240、270、360、480、600、720 min進(jìn)行眼眶取血0.3 mL，4 ℃4 500 r/min離心10 min，分離血漿置-80 ℃?zhèn)溆茫?/p>

1.2.4 血漿樣品的預(yù)處理

取血漿樣品100 μL于1.5 m L離心管, 加100 μL乙腈和400 μL氯仿渦旋混勻3 min, 4 ℃10 000 r/min離心10 min， 吸取上清液，在“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)行色譜分析, 記錄色譜圖．

1.2.5 組織樣品的處理

給藥15、35、60、120、180、270 min取血后, 斷頸處死, 立即取出心、肝、脾、肺、腎組織樣品置-80℃冰箱冷凍保存, 用冰生理鹽水洗去殘血后稱重, 將組織剪碎勻漿, 得勻漿液．取組織勻漿100 μL，加100 μL乙腈和400 μL氯仿渦旋混勻3 min, 4 ℃10 000 r/min離心10 min， 吸取上清液，氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)尤?00 μL甲醇超聲溶解，在“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)行色譜分析, 記錄色譜圖．

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用藥動(dòng)學(xué)程序軟件DAS 2.0, 以房室模型分析方法計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)．

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專屬性

分別測(cè)定空白血漿、空白組織、空白血漿+對(duì)照品、空白組織+對(duì)照品及給藥后的血漿樣品和組織樣品的色譜圖, 結(jié)果表明, 內(nèi)源性物質(zhì)不干擾主藥測(cè)定, 該方法專屬性良好，色譜圖見(jiàn)圖1．

2.1.2 線性關(guān)系

取空白血漿和空白組織勻漿液精密加入對(duì)照品溶液，配制成血竭素質(zhì)量濃度為5、25、50、100、125、250 ng/mL的系列對(duì)照品溶液，按照“2.4”和“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，記錄UA色譜圖．以血竭素的峰面積(A)為縱坐標(biāo)，血竭素質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，得到大鼠血漿和各組織器官中血竭素的線性方程．以信噪比S/N=10作為定量限 (LOQ)，結(jié)果見(jiàn)表1， 血竭素在質(zhì)量濃度5～250 ng/mL內(nèi)線性關(guān)系良好, 滿足生物樣品中血竭素的測(cè)定要求．

圖1 大鼠血漿和肝組織樣品中血竭素色譜圖Figure 1 Chromatograms of dracorhodin in mice plasma and liver tissue samples

表1 血竭素在大鼠血漿和各組織中的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Standard curve of dracorhodin in rat plasma and various tissus

2.1.3 精密度和準(zhǔn)確度

取空白血漿和空白組織勻漿液，加入對(duì)照品溶液，配制成高、中、低(5、50、125 ng/mL)的質(zhì)量控制QC樣品，每一質(zhì)量濃度進(jìn)行6樣本分析，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算日內(nèi)和日間RSD、RE，結(jié)果表明,血竭素在大鼠血漿和各組織日內(nèi)、日間RSD≤4.4%，RE≤±7.6%，符合方法學(xué)測(cè)定要求, 可以進(jìn)行生物樣品中血竭素的測(cè)定．

2.1.4 提取回收率

取空白血漿和空白組織勻漿液，加入對(duì)照品溶液，配制成高、中、低(5、50、125 ng/mL)的質(zhì)量控制QC樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度平行配制6份, 按照“2.4”和“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，依次測(cè)定，另取空白血漿和空白組織勻漿液，按照“2.4”和“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，分別加入與上述相應(yīng)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，依次測(cè)定．以2種方法測(cè)得的血竭素峰面積比值來(lái)計(jì)算提取回收率．表2結(jié)果表明, 高、中、低濃度血漿和各組織樣品中血竭素的提取回收率在83.0%～86.3%，RSD≤4.3%．符合生物樣品中血竭素測(cè)定要求．

2.1.5 穩(wěn)定性

取空白血漿和空白組織勻漿液，加入對(duì)照品溶液，配制成高、中、低(5、50、125 ng/mL)的質(zhì)量控制QC樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度平行配制6份，分別考察室溫下放置12 h、置-80 ℃冷凍14 d后解凍，經(jīng)過(guò)3個(gè)凍融循環(huán)后測(cè)其濃度，計(jì)算RE，考察穩(wěn)定性．RE≤±7.0%，表明血漿和組織樣品在室溫下放置12 h、于-80 ℃冷凍14 d后循環(huán)凍融3次，血竭素較為穩(wěn)定．

2.2 血藥濃度和藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

由圖2和表2可知，SD大鼠口服IDB后血竭素符合藥動(dòng)學(xué)二室模型，體內(nèi)分布迅速且廣泛，起效快，分布速率遠(yuǎn)大于消除速率，藥物在體內(nèi)可在一段時(shí)間內(nèi)保持藥量，有助于疾病的治療．

圖2 血竭素的平均血藥濃度-時(shí)間曲線 (Mean±SD，n=6)Figure 2 Mean plasma concentration-time curves of dracorhodin after oral administration

表2 血竭素的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(Mean±SD，n=6)Table 2 The pharmacokinetic parameters of dracorhodin

2.3 組織分布研究

給藥后15、35、60、120、180、270 min心、肝、脾、肺、腎中的平均藥物濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖3，可以看出，血竭素分布較廣，在各組織中均有分布，分布順序?yàn)楦?腎>心>肺>脾，120 min在心臟和肝臟中達(dá)到峰值，180 min在腎臟達(dá)到峰值．

圖3 胃給予IDB后不同組織中含血竭素量(Mean，n=6)Figure 3 Mean content in different organizations of dracorhodin after oral administration(Mean，n=6)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC技術(shù)建立了IDB活性成分血竭素在大鼠血漿和組織中的含量測(cè)定方法，且方法的專屬性、精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率和穩(wěn)定性等均滿足生物樣本分析要求，可采用該方法進(jìn)行血漿和組織的檢測(cè)分析．

藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SD大鼠口服IDB后血竭素符合藥動(dòng)學(xué)二室模型，生物利用度高，分布速率遠(yuǎn)大于消除速率，藥物在體內(nèi)可在一段時(shí)間內(nèi)保持藥量，有助于疾病的治療．組織分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，血竭素在體內(nèi)分布廣泛且迅速，在各組織中分布程度差異較大，在肝臟腎臟中分布相對(duì)較高，在心組織中有一定分布，脾和肺中分布較少，代謝速度較快，120～180 min后藥物濃度下降明顯．

血竭歸心、肝經(jīng)，其有效成分血竭素在肝臟與心臟中均有選擇性分布，提示其歸經(jīng)與靶向性之間有密不可分的聯(lián)系．肝是造血、儲(chǔ)血和代謝的重要器官，心為血液循環(huán)之“泵”，肝為血之府、心為血之主，IDB有活血化瘀、止血和抗血栓的作用，可能與血竭素具有較強(qiáng)的肝與心的靶向性有關(guān)．也可發(fā)揮作用可以利用血竭素的肝和心靶向性，改善劑型提高肝和心的藥物攝取率，從而提高臨床藥效．同時(shí)，血竭素的腎攝取率較高，僅次于肝，提示血竭可在腎臟疾病的治療中，發(fā)揮較好的靶向療效和應(yīng)用潛力．

本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)IDB中血竭素進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布的特征研究，為血竭的體內(nèi)研究提供了參考依據(jù)．