黃 蓉， 董 超， 余鴻飛， 秦 義， 劉延琳， 宋育陽

（西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院 陜西楊凌712100）

酸性蛋白酶是一種具有豐富的化學(xué)和物理性質(zhì)的天冬氨酸蛋白酶， 其活性位點中心含有一個或更多的羧基，能夠在酸性介質(zhì)（pH＜4.5）中有效地水解蛋白質(zhì)[1]。 這類酶具有極強的耐酸性，在水解過程中不會因微生物的滋生繁殖而腐敗變質(zhì)，普遍應(yīng)用于食品、 釀造等各個工業(yè)的蛋白水解過程中[1-3]。大量的真菌可分泌產(chǎn)生酸性蛋白酶，有研究表明擔子菌也可分泌產(chǎn)生酸性蛋白酶[4]，分泌酸性蛋白酶的原核生物比較罕見[5]。依據(jù)活性位點上官能團的差異，蛋白酶通常被分為4 種類型：含硫類氨基酸Cys 的蛋白酶， 富含羥基類氨基酸Ser的蛋白酶， 富含酸性氨基酸Asp 的蛋白酶和金屬蛋白酶[6]。對于天冬氨酸（Asp）蛋白酶而言，其等電點大致為3.0～5.0 且分子質(zhì)量大約是30～40 ku，最大的酶活性體現(xiàn)位于酸性介質(zhì)中[7-8]，被稱為酸性蛋白酶。

啤酒、 白酒和醬油等的釀造常用酸性蛋白酶作為蛋白澄清劑。在啤酒發(fā)酵糖化階段，利用酸性蛋白酶可降解底物麥芽中的蛋白質(zhì)， 通過添加適量的酸性蛋白酶阻止啤酒遇冷渾濁的現(xiàn)象[9]。有研究報道在白酒釀造過程中， 酸性蛋白酶可以溶解發(fā)酵原料和輔料的成分，促進酒精發(fā)酵，同時降解微生物殘體，賦予白酒香氣物質(zhì)[10-11]。 蛋白質(zhì)與其它物質(zhì)形成的復(fù)合物是組成葡萄酒的物理、 化學(xué)特性的重要指標[7，11]，然而白葡萄酒中來自發(fā)酵原料和輔料的非穩(wěn)定蛋白質(zhì)， 會對葡萄酒的香氣和感官特性造成不良影響[12]。 針對白葡萄酒蛋白沉淀問題， 傳統(tǒng)方法是在發(fā)酵或陳釀過程使用明膠和膨潤土，雖可去除蛋白沉淀，但下膠過程會將葡萄酒中部分穩(wěn)定性蛋白去除[12]，影響葡萄酒的香氣質(zhì)量。 使用蛋白質(zhì)酶解法可將葡萄酒中蛋白質(zhì)水解成小肽[9]，同時對酒液補充部分氨基酸，使葡萄酒獲得良好的澄清度和穩(wěn)定性， 提高葡萄酒的營養(yǎng)價值[10，13]。 目前可利用分子生物學(xué)發(fā)展的平臺，通過基因工程改造酵母菌，使其分泌酸性蛋白酶，在發(fā)酵過程中水解不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，達到改善白葡萄酒的感官品質(zhì)，解決蛋白沉淀的目的。

本研究以宇佐美曲霉（Aspergillus usamii）為酸性蛋白酶基因（pepA）供體，采用酵母細胞表面展示技術(shù)，將宇佐美曲霉的酸性蛋白酶基因pepA整合到釀酒酵母的基因位點， 以期在釀酒酵母發(fā)酵的過程中， 將不穩(wěn)定蛋白質(zhì)水解成氨基酸和小肽， 旨在解決白葡萄酒中蛋白渾濁的問題同時為酵母的生長提供可吸收性氮源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 本研究所用的宿主菌為釀酒酵母單倍體BY4741，武漢淼靈生物科技有限公司（his3Δ1，實驗室改造后為SD-Ura 缺陷性酵母）和釀酒酵母二倍體82-9-35（實驗室前期分離得到，his3Δ1，為SD-Ura 缺陷性酵母）。生物工程公司合成含宇佐美曲霉的酸性蛋白酶基因pepA 的大腸桿菌，利用來自寶生物官網(wǎng)Phanta@Turbe Super-Fidelity DNA Polymerase 擴增體系， 進行PCR 擴增目的片段pepA 基因， 后利用Takala 公司生產(chǎn)的試劑盒直接純化回收。E.coli DH5α 購自于寶生物， 出發(fā)質(zhì)粒為本實驗室保存的大腸桿菌的質(zhì)粒PUC-GAP-α-factor-HQM-SED1（GAP 為啟動子，α-factor-為信號肽，SED1 為釀酒酵母細胞壁蛋白）。

1.1.2 工具酶與主要試劑 0.4 mol/L 碳酸鈉溶液、乳酸緩沖液（pH 3.0）、0.4 mol/L 三氯乙酸、0.5 mol/L 氫氧化鈉、10.00 mg/mL 酪素溶液、100 μg/mL 酪氨酸標準溶液、1 mol/L Tris-HCl （pH 8.0）、0.5 mol/L 乙二胺四乙酸 （EDTA）（pH 8.0）、TE 緩沖液、氨卡青霉素（Amp）、1 mol/L 山梨醇、酵母感受態(tài)制備處理液、酵母全營養(yǎng)培養(yǎng)基（YPD）、尿嘧啶缺陷型合成葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基 （SD-URA）、Luria-Bertain（LB）培養(yǎng)基和LB-Amp 培養(yǎng)基的配制方法參照Zhang 等[14]的方法。 一步克隆試劑盒、DNA 凝膠純化試劑盒、缺失尿嘧啶的DO 添加劑、Taq 酶、DNA Markers 和DNA 限制性內(nèi)切酶（Cla I、Sph I、Sma I），寶生物（大連）有限公司；DNA 高保真聚合酶，南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA提取液 （V酚∶V氯仿∶V異戊醇=25∶4∶1）、1 mol/L 二硫蘇糖醇（DTT）、DNA 純化試劑盒和酵母基礎(chǔ)氮源（YNB），北京索萊寶科技有限公司；引物的合成和DNA 測序交由上海生物工程有限公司完成。

1.1.3 引物與pepA 序列 本試驗所用引物如表1 所示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.1.4 儀器與設(shè)備 FB-K20 恒溫金屬浴，上海楓嶺生物技術(shù)有限公司；MJPS-250 生化培養(yǎng)， 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；SW-CJ-2FD 超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；KQ-300DE 超聲波清洗機， 昆山市超聲儀器有限公司；PB-10 pH計， 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；LDZX-50KBS 滅菌鍋， 上海申安醫(yī)療器械廠；DYY-10C電泳儀， 北京市六一儀器廠；BG-sub M2DI 水平電泳槽，百晶生物技術(shù)有限公司；FRESCO17 低溫高速離心，Thermo；C1000 PCR 儀，Biorad 公 司；GBOX-EF 凝膠成像系統(tǒng)，Syngene 公司；ND-1000微量紫外分光光度計，Nanodrop 公司；DYY-6C 電穿孔儀，北京六一生物科技有限公司；AUW-220D十萬分之一天平，島津公司。

1.2 方法

1.2.1 pepA 基因的合成和TFP6 因子表達載體構(gòu)建 pepA 基因通過NCBI 查找相應(yīng)序列并進行優(yōu)化， 由生工生物工程公司合成， 利用寶生物的DNA 聚合酶擴增體系擴增pepA 基因片段， 上游引 物 pepA -F： AGAGAGGCTGAAGCTATCGAT ATGGTCGTCTTCAGCAAAACCGCT； 下游引 物pepA-R： CAGAACCACCACCACCGCATGCAGCC TGAGCAGCAAAGCCCAGCTT，后用試劑盒直接純化回收。 TFP6 載體PUC-GAP-α-factor-HQMSED1 用快切酶Sph I 和Cla Ⅰ雙酶切，試劑盒直接純化回收。用一步克隆的方法（操作方法參照寶生物In-Fusion RHD Cloning Kit 說明書）連接目的基因片段和線性化質(zhì)粒載體。 具體操作步驟參照OMEGA 質(zhì)粒提取試劑盒和天根的DNA 純化回收試劑盒。

1.2.2 大腸桿菌轉(zhuǎn)化 一步克隆連接的表達載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α， 涂布在LB-Amp 固體平板上，37 ℃培養(yǎng)12～14 h， 挑取單菌落用Taq 酶體系（參考寶生物）進行菌落PCR 驗證，引物為pepA-F 和pepA-R。 將驗證成功的大腸桿菌單菌落接種在LB-Amp 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。

1.2.3 目標酶基因插入酵母基因組 OMEGA 質(zhì)粒提取試劑盒提取大腸桿菌中含有pepA 的重組質(zhì)粒，用DNA 限制性快切酶Sma Ⅰ單酶切后，進行試劑盒純化回收。 將回收后的DNA 片段，轉(zhuǎn)化至SD-Ura 缺陷性釀酒酵母單倍體BY4741 和二倍體82-9-35（目標酶片段依靠His3 組氨酸同源臂與酵母基因組發(fā)生同源重組），后涂布在SD-Ura 平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，挑取酵母單菌落進行酵母菌落PCR 驗證重組酵母。 Taq 酶體系PCR驗證引物： 上游引物為His-f： GCGTACCACCACCATTACACATGT， 下游引物pepA-R：CAGAACCACCACCACCGCATGCAGCCTGAGCAGCA AAGCCCAGCTT。

1.2.4 pepA 信號肽預(yù)測 在網(wǎng)址http：//www.cbs.dtu.dk/services/Signal P/進行pepA 的氨基酸序列的信號肽預(yù)測。

1.2.5 酸性蛋白酶酶活的測定 酶活力單位的定義和酶活的測定方法和計算公式參照文獻[15]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)NCBI 網(wǎng)站中宇佐美曲霉的酸性蛋白酶基因（pepA）序列，用Vector NTI 軟件設(shè)計擴增pepA 目的基因的引物， 引物為pepA-F 和pepAR。pepA 基因由生工生物工程公司合成，進行高保真酶PCR 后，直接用試劑盒純化回收，得到片段為1 182 bp 的目的片段（圖1）。 擴增后pepA 測序結(jié)果與NCBI 網(wǎng)站目的基因pepA 序列一致。 出發(fā)質(zhì)粒PUC-GAP-α-factor-HQM-SED1 用快切酶Sph Ⅰ和Cla Ⅰ雙酶切，直接用試劑盒純化回收，得到TFP 線性質(zhì)粒載體（圖2）；用一步克隆的方法（操作方法參照寶生物In-Fusion RHD Cloning Kit 說明書） 連接目的基因片段pepA 和線性化質(zhì)粒載體（圖3）。具體操作方法參照OMEGA 質(zhì)粒提取試劑盒和天根的DNA 純化回收試劑盒。提取大腸桿菌重組質(zhì)粒測序， 引物為cexu-GAP-f 和pepA-R，測序結(jié)果與預(yù)期一致。

圖1 目的片段電泳圖片F(xiàn)ig.1 Electrophoresis picture of the target fragment

圖2 PUC-GAP-α-factor-HQM-SED1 質(zhì)粒雙酶切Fig.2 Double digestion of PUC-GAP-α-factor-HQM-SED1 plasmid

圖3 質(zhì)粒PUC-GAP-α-factor-pepA-SED1 構(gòu)建流程Fig.3 Construction process of plasmid PUC-GAP-α-factor-pepA-SED1

2.2 電激轉(zhuǎn)化釀酒酵母

參考文獻[13]的方法制備酵母感受態(tài)并進行酵母電轉(zhuǎn)化。 將轉(zhuǎn)化子劃線在YPD 和SD-Ura 平板上，恒溫30 ℃，培養(yǎng)48 h 后，進行菌落PCR 驗證，驗證引物為cexu-GAP-f、his-f 和pepA-R。 圖4 所示的電泳結(jié)果表明，pepA 基因插入位點正確。

圖4 重組菌PCR 擴增Fig.4 Recombinant bacteria PCR amplification

2.3 酸性蛋白酶酶活測定

圖6 為在培養(yǎng)溫度30 ℃條件下，釀酒酵母表面展示的酸性蛋白酶96 h 內(nèi)的酶活曲線圖。 在72 h 左右出現(xiàn)最高酶活，72 h 前隨著酵母培養(yǎng)時間增加，酶活呈現(xiàn)上升的趨勢，而在72 h 后酸性蛋白酶活性隨時間呈下降的趨勢，并且82-9-35-8 的酶活96 h 內(nèi)基本高于BY4741-i。 推測其酶活下降的原因可能是酵母培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)被酵母消耗減少， 酵母自身生長能力下降所致。 其在72 h 前酶活上升的原因與酵母在72 h 內(nèi)繁殖增長相關(guān)。

圖6 BY4741-i 和82-9-35-8 在YPD 培養(yǎng)基上的酶活變化Fig.6 Changes of enzyme activity of BY4741-i and 82-9-35-8 on YPD medium

2.4 監(jiān)測陽性重組菌的生長

重組酵母和宿主菌 （BY4741 和82-9-35）分別在SD-ura 和PD 上劃線培養(yǎng)，48 h 后挑取單菌落接種到50 mL 的SD-URA 選擇性液體培養(yǎng)基和YPD 液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min 培養(yǎng)48 h進行活化后，用血球計數(shù)板進行活菌計數(shù)，以1×106CFU/mL 的接種量接種至150 mL 的YPD 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件30 ℃、200 r/min，每隔12 h 取樣， 用酶標儀測定其在波長600 nm 處的吸光度值。 以生長時間為橫坐標，OD600nm為縱坐標，繪制重組酵母菌株和對照菌株的生長曲線。

表2 酪氨酸標準曲線Table 2 The standard curve of tyrosine

圖5 酪氨酸標準曲線Fig.5 The standard curve of tyrosine

用YPD 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)重組酵母和原菌株，每隔6 h 取樣600 nm 處測定吸光度，繪制重組酵母與對照菌株的生長曲線，如圖7 所示。 0～24 h，所有菌株處于生長延滯期。 24 h 后所有菌株迅速繁殖，30～54 h 是所有酵母的生長對數(shù)期， 在對數(shù)前期，二倍體菌株的生長速度比單倍體快；在對數(shù)后期，單倍體的生長速度超過二倍體，最終單倍體的生長量高于二倍體。表面展示pepA 的二倍體重組酵母在穩(wěn)定期達到的生長量明顯比原菌株高，表明單倍體和二倍體酵母表面展示pepA 并未對菌株的生長有不良影響， 且顯著增強了菌株生長能力。

圖7 酵母在YPD 培養(yǎng)基上的生長曲線Fig.7 Growth curve of recombinant yeast on YPD medium

如圖8 所示，當陽性轉(zhuǎn)化子BY4741-i 和82-9-35-8 在YPD 培養(yǎng)基上的生長進入平衡期前，細胞數(shù)量積累很多，酶活劇烈上升，并在細胞生長平衡期時酶活基本達到最大值。 72 h 左右酶活達到最大值，之后酶活呈下降的趨勢。推測由于培養(yǎng)基營養(yǎng)物有限，細胞相互間競爭，死亡的細胞數(shù)和新生的細胞數(shù)持平，因此酶活曲線呈下降趨勢。

圖8 BY4741-i 和82-9-35-8 在YPD 培養(yǎng)基上的生長曲線與酶活關(guān)系圖Fig.8 The relationship between the growth curve and enzyme activity of BY4741-i and 82-9-35-8 on YPD medium

3 討論

目標蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯的過程受代謝途徑的影響[16-17]。 在釀酒酵母中，異源蛋白的分泌和表達過程與其它真核生物基本相同。 從核糖體開始mRNA 被翻譯成新的肽鏈， 并被轉(zhuǎn)運至高爾基體，高爾基體對多肽鏈存在進一步加工和修飾的作用[17-19]，最終通過囊泡運輸作用被分泌到細胞外部。 若蛋白質(zhì)折疊錯誤， 則內(nèi)質(zhì)網(wǎng)將重新折疊或開通蛋白質(zhì)降解途徑使其分解[20]。 當錯誤的蛋白質(zhì)不能及時修復(fù)并積累時，會導(dǎo)致宿主細胞的凋亡[21]。 在分泌表達過程中，正確的蛋白若未被及時送出胞外，則會在胞內(nèi)積累，導(dǎo)致其活性降低甚至被降解，因此囊泡運輸過程是影響蛋白分泌表達效率的重要限制性因素之一[22-23]。當前研究主要使用融合伴侶包括反式伴侶和順式伴侶來增強目標蛋白的折疊運輸效率， 如依靠篩選CIS 伴侶蛋白可提升蛋白的正確折疊程度[24]。 信號肽引導(dǎo)目標蛋白的具有的作用， 其編碼區(qū)由17 到30 個氨基酸殘基序列組成，一般是10 個帶正電荷的非極性氨基酸[25-26]。大多數(shù)表面展示的宿主細胞的目標蛋白的表達通常以包涵體的形式存在，并非直接分泌表達，但包涵體不具有蛋白活性[27-28]。 因此，信號肽被用來解決包涵體重折疊的影響， 引導(dǎo)外源蛋白在細胞特定位置的分泌[24]。 目標蛋白的信號肽與宿主細胞的融合性存在一定的差異[29-30]，其不恰當使用會對目標蛋白的分泌途徑造成負面影響[26，31]。有研究報道當宿主細胞的二氨基肽酶對信號肽去除不完整時，會影響目標蛋白的活性[32]。 基于以上因素，為了確保表達盒產(chǎn)生的包含酸性蛋白酶的融合蛋白能夠通過細胞機制正確地定向到細胞表面， 本研究引入釀酒酵母自身的翻譯融合伴侶和信號肽α-factor。

連接肽的設(shè)計在確保得到正確構(gòu)象的融合蛋白時， 也要保證融合蛋白能保持正常的分泌和表達[33-34]，否則會影響目的蛋白的活性。 鑒于存在不利影響，本研究選擇具有柔韌性、親水性、易折疊性和小側(cè)鏈氨基酸的接頭肽序列【（G4S）3】[35]，在一些酵母展示載體（例如，pYD1 和pYD5）中具有編碼這種類型連接肽的序列。

展示效率同時應(yīng)考慮要展示的蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量， 其會影響融合蛋白在細胞內(nèi)外的轉(zhuǎn)運和分泌[36]。 Fan 等[32]在分析解纖梭菌DSM 5812 支架II的幾個重復(fù)單元的試驗中， 發(fā)現(xiàn)隨著174 個氨基酸重復(fù)序列的增加， 暴露Aga2-C 端融合蛋白的細胞的百分比下降。 這是由于每個細胞的表面積是有限的， 所以在展示較大蛋白的菌株中存在重組質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象。 Yang 等[33]使用Pir 蛋白作為錨定蛋白時， 發(fā)現(xiàn)展示800 個以上氨基酸的目的蛋白效率很低。 錨定蛋白存在與酵母細胞壁不同的結(jié)合方式， 會影響目標蛋白的展示量和表達活性[27]。 因此，在構(gòu)建細胞表面展示表達盒時，應(yīng)科學(xué)選擇目標蛋白， 同時選擇其與錨定蛋白適合的融合方式[27，37]。 Yamada 等[38]報道，當表面展示纖維素酶的工程酵母菌株通過交配進行二倍化并評估其乙醇發(fā)酵性能時 ， 觀察到乙醇產(chǎn)率增加約2.5 倍。 本研究進行宿主二倍體優(yōu)化，陽性二倍體菌株酸性蛋白酶酶活是陽性單倍體菌株酶活1.7倍左右，這是由于與單倍體菌株相比，二倍體菌株具有更高的細胞生長速率、 細胞產(chǎn)量以及對各種脅迫的耐受性。

4 結(jié)論

本研究通過克隆宇佐美曲霉的酸性蛋白酶基因（pepA），以SED1 為錨定蛋白，GAP 為啟動子成功搭建了釀酒酵母a-凝集素表面展示系統(tǒng)，獲得可通過酵母細胞表面展示技術(shù)表達酸性蛋白酶的兩株釀酒酵母，分別是單倍體BY4741-i 和二倍體82-9-35-8。 監(jiān)測重組酵母的生長，發(fā)現(xiàn)表面展示pepA 未對宿主菌株造成代謝壓力，對其生長有不利影響， 重組酵母的最高酶活性表達時間與其生長進入穩(wěn)定期時間基本一致。 依據(jù)重組釀酒酵母酸性蛋白酶的活性表現(xiàn)， 證明釀酒酵母表面展示技術(shù)可作為葡萄酒介質(zhì)低pH 值條件下的全細胞生物催化劑， 在改善白葡萄酒的蛋白穩(wěn)定性方面的具有可行性。