董冬麗， 林少玲， 孫崇臻， 杜文琪， 吳希陽， 唐書澤*

（1 暨南大學食品科學與工程系 廣州510632 2 福建農林大學食品科學學院 福州350002）

我國漁業(yè)資源豐富， 水產品總產量一直處于世界前列。隨著中國經濟水平的不斷提高，國內水產食品的消費數量呈逐年上升趨勢[1]，然而，食品安全風險也隨之增加。 例如，在對2010—2018年連云港市531 份市售動物性水產品致病微生物污染情況的分析中發(fā)現， 該市市售水產品中均存在不同程度的致病弧菌、諾如病毒、異尖線蟲污染[2]。2017—2019年從廣東省水產品中檢出7 種主要致病菌，其中副溶血弧菌，溶藻弧菌和沙門氏菌是主要污染源[3]。

控制食源性致病菌最傳統(tǒng)、 最有效的方法是熱加工， 然而高溫會導致部分營養(yǎng)流失或感官質量的改變?？赏瑫r保證水產食品營養(yǎng)、感官和安全的非熱加工技術成為水產食品加工行業(yè)的訴求。光動力技術（Photodynamic technology， PDT）是利用光敏劑在特定波長光源的激發(fā)下產生的活性氧（Reactive oxygen species， ROS）對病原體進行滅活，現被應用于多種食源性致病微生物[4-6]的控制。

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus， Va）是海水中的優(yōu)勢菌種，對人致病，水產食品中檢出率較高。霍利斯格里蒙特菌（Grimontia hollisae， Gh），在水產食品中檢出率一般較低， 然而該菌引起的食物中毒事件時有報道[7-9]。 PDT 滅活水產食品致病菌的研究多以副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）和創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus， Vv）為對象[10-12]，PDT 對Gh 和Va 的滅活作用鮮有研究報道。 本文以水溶性姜黃素為光敏劑， 在420 nm LED 藍光激發(fā)下對Gh 和Va 進行滅活，研究其機理，為姜黃素PDT 在水產食品安全防控中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株 霍利斯格里蒙特菌（ATCC 33564）、創(chuàng)傷弧菌（ATCC 27562）購自廣東微生物菌種保藏中心，溶藻弧菌（CMCC 33787）由廣東省出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心食品實驗室微生物部惠贈，副溶血弧菌（分離自上海市臨床病人）由上海交通大學農業(yè)與生物學院惠贈。

1.1.2 試驗試劑 水溶性姜黃素 （姜黃素含量12.9%），美國Sabinsa 公司；2216E 液體培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司； 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基 （Tryptose Soya Agar， TSA），廣東環(huán)凱生物科技有限公司；氯化鈉，廣州化學試劑廠；ROS 檢測試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒，碧云天生物技術；Taq PCR Master Mix，生工生物工程（上海）股份有限公司；細菌DNA 提取試劑盒、瓊脂糖，天根生化科技；引物，擎科生物；一次性培養(yǎng)皿，江蘇晟康醫(yī)療用品有限公司。

1.1.3 儀器與設備 LED 光照設備（420 nm，69.97 mW/cm2）由暨南大學食品科學與工程系和光電工程系自主研發(fā)；DHP 120 恒溫培養(yǎng)箱，上海實驗儀器廠有限公司；HNYC-2102 智能恒溫培養(yǎng)振蕩器，天津歐諾儀器股份有限公司；ST16R 冷凍高速離心機、Legend Micro 17R 微量冷凍高速離心機、Evolution 220 紫外分光光度計， 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Infinite M200 PRO 光柵型多功能微孔板檢測儀，瑞士Tecan 公司；SDS-PAGE 電泳儀，美國Bio-Rad 公司；AG 22331 Hamburg 梯度PCR 儀， 德國Eppendorf 公司；JY600+型PCR電泳儀， 北京君意東方電泳設備有限公司；Tanon 2500 凝膠圖像分析系統(tǒng)、Tanon 5200 蛋白免疫印跡自動曝光儀，廣州譽維生物科技儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)和菌懸液制備 將-80 ℃凍存的菌種在TSA 平板上轉接2 次，挑取典型單菌落接種至10 mL 2216E 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)18～24 h，3 532×g 離心15 min 棄上清，加入10 mL PBS 重懸，制成菌懸液備用。

1.2.2 姜黃素的配制與稀釋 稱取0.0286 g 水溶性姜黃素粉末溶解于10 mL PBS 中制成1 mmol/L姜黃素母液，4 ℃避光保存， 按比例稀釋成所需濃度工作液后用于光動力試驗。

1.2.3 姜黃素的吸收光譜測量 利用紫外分光光度計在波長250 ～800 nm 范圍內對濃度為50 μmol/L 和100 μmol/L 的姜黃素溶液進行全波長掃描測定。

1.2.4 姜黃素PDT 對Gh 和Va 的滅活作用 為避免試驗過程中溫度波動對試驗的干擾，LED 光照設備全程放置在4 ℃冰箱中使用。 試驗設置空白對照組（L-P-），光敏劑對照組（L-P+），光照對照組（L+P-）和光動力試驗組（L+P+）。L-P-組取菌懸液與PBS 各0.5 mL 混合，不做光照處理；L-P+組取菌懸液與一次試驗中所用最大濃度姜黃素溶液各0.5 mL，混合暗培養(yǎng)20 min，不做光照處理；L+P-組取菌懸液與PBS 各0.5 mL 混合， 光照10 min。 L+P+組，將菌懸液與姜黃素溶液（終濃度為50 μmol/L）各0.5 mL 加入12 孔板中，分別暗培養(yǎng)1，5，10，15 min 后在LED 光照設備下同時光照10 min 以探究暗培養(yǎng)時間的影響； 將菌懸液分別與不同濃度姜黃素溶液 （終濃度分別為10，25，50，100，150 μmol/L）各0.5 mL 加入12 孔板中，暗培養(yǎng)10 min 后光照10 min，以探究姜黃素濃度的影響；將菌懸液與姜黃素溶液（終濃度為50 μmol/L）各0.5 mL 加入12 孔板中，暗培養(yǎng)10 min 后，分別光照1，5，10 min 以探究光照時間的影響。

1.2.5 姜黃素PDT 對Vp 和Vv 的滅活作用 L+P+組按如下步驟處理：將Vp 和Vv 菌懸液分別與不同濃度姜黃素溶液（終濃度為50 μmol/L 和100 μmol/L）各0.5 mL 加入12 孔板中，暗培養(yǎng)10 min后光照10 min。L-P-、L-P+和L+P-組處理同1.2.4節(jié)。

1.2.6 平板菌落計數和滅活率計算 對處理后的菌液樣品進行10 倍梯度稀釋，選擇3 個合適的梯度，每個梯度2 個平行。 取200 μL 稀釋液于培養(yǎng)皿中，將冷卻至55 ℃的TSA 倒平板，冷卻凝固后倒置，35 ℃過夜培養(yǎng)并進行菌落計數。計數規(guī)則及計算方法參考GB 4789. 2-2016 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》，所得數值做lg 處理并按式（1）計算滅活率：

式中，N——空白對照組菌落總數，CFU/mL；n——試驗組菌落總數，CFU/mL。

1.2.7 光動力殺菌機理探究

1.2.7.1 菌體內ROS 測定 分別取10 mL Gh 和Va 菌懸液加入10 μL 熒光探針DCFH-DA，混勻后37 ℃培養(yǎng)30 min，無菌PBS 洗滌3 次。 重懸后菌液與PBS（L-P-）或不同濃度（終濃度為10，25，50，100 μmol/L）姜黃素溶液（L+P+）各0.5 mL 加入12 孔板中，暗培養(yǎng)10 min，LED 光照10 min，立即在488 nm 激發(fā)波長，525 nm 發(fā)射波長下測定熒光強度。 無菌對照組用PBS 替代菌懸液進行相同操作。

1.2.7.2 菌體蛋白的SDS-PAGE 分析 收集經1.2.4 節(jié)處理后L-P-和L+P+組的Va 菌液， 每個樣品1 mL，PBS 洗滌3 次， 用40 μL PBS 重懸后加入10 μL 上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min。 配制10%分離膠和5%濃縮膠，取5 μL 蛋白Marker 和12 μL 蛋白樣品上樣。 設置起始電壓為80 V，樣品條帶進入分離膠后轉120 V。指示劑遷移至距底端1～2 cm 處時停止電泳。 考馬斯亮藍染色2～4 h，脫色液漂洗至背景干凈，條帶清晰。蛋白免疫印跡自動曝光儀下顯影并拍照。

1.2.7.3 細菌DNA 的瓊脂糖凝膠電泳分析 取姜黃素PDT 處理后L-P-組、L-P+組（100 μmol/L姜黃素）、L+P-組（LED 光照10 min）和L+P+組（50 μmol/L 和100 μmol/L 姜黃素，LED 光照10 min）的Gh 和Va 菌液各5 mL， 根據細菌DNA 提取試劑盒說明提取DNA。 制備0.8%瓊脂糖凝膠，將3 μL DNA 樣品混合1 μL 上樣緩沖液上樣，80 V 電壓下電泳80 min。 凝膠成像系統(tǒng)顯影并拍照。

取培養(yǎng)后的Gh 和Va 菌液各4 mL 分別提取總DNA， 得DNA 溶液各4 mL。 將菌懸液和所得DNA 溶液同時做L-P-組、L-P+組 （50 μmol/L 姜黃素）、L+P-組 （LED 光照10 min） 和L+P+（50 μmol/L 姜黃素，LED 光照10 min） 處理并收集處理后樣品，每個樣品100 μL。 菌液樣品按試劑盒說明提取DNA。 DNA 樣品不做破壁，蛋白酶K 和加熱處理，余下處理步驟同菌液樣品。以Gh（表1）和Va（表2）的相關毒力基因引物進行PCR 擴增。擴增體系為50 μL，其中Taq PCR Mix 25 μL，前后引物各2 μL，雙蒸水19 μL，DNA 模板2 μL。 反應條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。制備2%瓊脂糖凝膠，取5 μL 擴增產物上樣，80 V 電壓下電泳40 min。凝膠成像系統(tǒng)顯影并拍照。

表1 霍利斯格里蒙特菌毒力基因引物序列Table 1 The primer of virulence gene for Grimontia hollisae

表2 溶藻弧菌毒力基因引物序列Table 2 The primers of virulence genes for Vibrio alginolyticus

1.3 數據處理

試驗數據用SPSS Statistics 25.0 進行單因素方差分析， 顯著性差異P＜0.05，Microsoft Excel 2019 計算和作圖。

2 結果與討論

2.1 水溶性姜黃素的吸收波譜

圖1 顯示水溶性姜黃素在波長250～800 nm范圍內有2 個吸收波峰， 其中最大吸收峰在420 nm 附近，與Gao 等[14]報道的水溶性姜黃素吸收波譜相似。 綜上，光動力試驗中采用420 nm 的藍光LED 光源，符合姜黃素的最大吸收波長，能有效激發(fā)姜黃素發(fā)生光動力反應。

圖1 水溶性姜黃素吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectrum of water soluble curcumin

2.2 水溶性姜黃素PDT 對Gh 和Va 的滅活效果

2.2.1 暗培養(yǎng)時間對PDT 滅活效果的影響 在光照前提供充足的暗培養(yǎng)時間有助于目標菌吸附更多的光敏劑或使光敏劑與目標菌充分接觸，以保證光動力作用的有效發(fā)揮。如圖2 所示，隨暗培養(yǎng)時間的延長，菌落總數整體呈不斷減少趨勢。當暗培養(yǎng)時間增加至10 min 時，光動力殺菌效果最佳，可使Gh 菌落總數降低6.20 lg（CFU/mL）。 繼續(xù)延長暗培養(yǎng)時間至15 min， 光動力殺菌效果略有下降， 表明Gh 細胞與姜黃素的結合已經達到過飽和狀態(tài)。綜上，后續(xù)光動力試驗中暗培養(yǎng)時間均采用10 min。

圖2 暗培養(yǎng)時間對姜黃素PDT 滅活Gh 的影響Fig.2 Effects of dark culture time on curcumin PDT inactivation of Gh

2.2.2 姜黃素濃度對PDT 滅活效果的影響 姜黃素濃度對姜黃素PDT 滅活Gh 和Va 的影響如圖3 所示。 L-P-組 （未處理）、L-P+組 （僅100 μmol/L 姜黃素處理）和L-P+組（僅10 min 光照處理）中Gh 菌落總數無顯著性差異（P＜0.05），Va 結果類似， 表明姜黃素或藍光單獨使用時均沒有殺菌效果， 而二者都是PDT 過程中必不可少的因素。 圖中數據顯示該LED 光照設備能有效激發(fā)姜黃素，對Gh 和Va 產生顯著地滅活作用，滅活效果隨姜黃素濃度的增加而增強， 最終趨于平穩(wěn)。150 μmol/L 姜黃素結合10 min 光照使Gh 和Va菌落總數分別降低7.98 lg （CFU/mL） 和7.80 lg（CFU/mL）。 同時，對比Gh 和Va 降低的菌落總數可知， 隨姜黃素濃度的增加，Gh 菌落總數下降速率更快，這表明Gh 對姜黃素PDT 更加敏感。

圖3 姜黃素濃度對姜黃素PDT 滅活Gh 和Va 的影響Fig.3 Effect of curcumin concentration on curcumin PDT inactivation of Gh and Va

2.2.3 光照時間對PDT 滅活效果的影響 光照劑量由光功率密度和光照時間共同決。研究表明，光照時間對滅活效果的影響大于光功率密度，通過延長光照時間的方式增加光照劑量， 可以更加有效地提高光動力滅活效果[15]。 采用光動力密度為69.97 mW/cm2的LED 藍光光源， 光照時間1，5，10 min 對應的光照劑量分別為4.20，20.99，41.98 J/cm2。 圖4 表明，暗培養(yǎng)時間充足時，姜黃素（50 μmol/L）結合短時間（1 min）光照對Gh 和Va 的滅活作用即可達到99.99%以上。 延長光照時間可以增強PDT 滅活效果， 光照10 min 后Gh和Va 菌落總數分別降低7.26 lg（CFU/mL）和5.41 lg（CFU/mL）。

圖4 光照時間對姜黃素PDT 滅活Gh 和Va 的影響Fig.4 Effects of illumination time on curcumin PDT inactivation of Gh and Va

2.2.4 水溶性姜黃素PDT 對Vp 和Vv 滅活效果的影響 Vp 和Vv 是水產食品中的常見致病菌，其PDT 滅活作用已有較多研究。 鄧曦[10]曾報道0.05 mg/mL 亞甲基藍結合氙燈能使Vp 和Vv 分別降低約8 lg（CFU/mL）（300 J/cm2）和7 lg（CFU/mL）（360 J/cm2）。 Zhang 等[11]發(fā)現100 μg/mL 亞甲基藍經氙燈激發(fā)后（24.996 J/cm2）對Vp 生物膜也具有良好的清除作用 【降低4.05 lg（CFU/mL）】。Wu 等[16]觀察到10 μmol/L 姜黃素結合3.6 J/cm2藍光可使Vp 減少至檢測限以下【降低大于6.5 lg（CFU/mL）】。 本文結果（圖5）顯示，100 μmol/L 水溶性姜黃素濃度結合41.98 J/cm2LED 藍光分別使Vp 和Vv 菌落總數降低7.99 lg （CFU/mL）和6.89 lg（CFU/mL），滅活率高達99.99%以上，滅活效果與上述報道相似， 進一步證明本文采用的水溶性姜黃素PDT 的有效性。 同樣的光動力條件（圖3） 可使Gh 和Va 菌落總數分別降低7.63 lg（CFU/mL）和7.67 lg（CFU/mL），對比可知，水溶性姜黃素PDT 對Gh 和Va 的滅活作用與Vp 和Vv相近。 綜上，水溶性姜黃素PDT 可同時作為Gh、Va、Vp 和Vv 的有效控制手段。

圖5 姜黃素PDT 對Vp 和Vv 的滅活效果Fig.5 Inactivation effects of curcumin PDT on Vp and Vv

2.3 姜黃素PDT 滅活Gh 和Va 的機理

2.3.1 姜黃素光動力誘導菌體內ROS 的產生

有研究發(fā)現， 在ROS 清除劑存在時，PDT 抗菌效果顯著降低，而穩(wěn)定劑的存在可增強其抗菌效果，表明ROS 在PDT 殺菌過程中發(fā)揮重要作用[12]。Freitas 等[17]和檀利軍等[18]采用ROS 試劑盒法檢測到PDT 處理可使細菌體內產生大量ROS，參考此法對Gh 和Va 進行檢測（圖6），結果顯示，PDT 處理后菌液熒光強度較對照組顯著增加， 表明PDT顯著提高Gh 和Va 菌體內ROS 水平，ROS 水平與姜黃素濃度呈正相關。 這一結果與姜黃素濃度對PDT 滅活效果的影響結果相符，即隨姜黃素濃度的增加，菌體內ROS 水平不斷升高，菌落總數不斷降低，對應滅活率不斷增強。 同時，菌落計數結果表明，相同條件下，姜黃素PDT 對Gh 的滅活效果要優(yōu)于Va，對比圖3 和圖6 結果推測，這可能是由于姜黃素PDT 誘導Gh 菌體內產生更高水平的ROS。 綜上，水溶性姜黃素是一種高效光敏劑，易被目標菌吸收，由藍光激發(fā)可以產生高水平的ROS，達到良好的滅活效果。

圖6 姜黃素PDT 誘導菌體內ROS 的產生Fig.6 ROS production in bacteria induced by curcumin PDT

2.3.2 姜黃素PDT 對菌體蛋白的降解 由ROS引起的氧化應激可破壞蛋白質、DNA 和脂類等大分子，導致生物活性改變，加速突變，最終導致細胞死亡[19]。 對細菌外膜蛋白進行SDS-PAGE 分析發(fā)現，PDT 可以對細菌外膜蛋白造成損傷[16]。 如圖7 所示， 不同濃度的姜黃素PDT 均能對Va 菌體蛋白產生破壞作用，隨濃度增加，降解效果增強。為更加直觀反映PDT 對細菌的滅活作用，有研究進一步采用掃描電鏡或原子力顯微鏡觀察到，PDT 處理可使細菌形態(tài)改變， 甚至可以導致細胞破裂，內容物質泄露[20-21]。

圖7 PDT 處理后Va 全蛋白SDS-PAGE 分析圖譜Fig.7 SDS-PAGE analysis of Va total protein after PDT treatment

2.3.3 姜黃素PDT 對細菌基因的損傷 分析圖8可知，與對照組相比，L+P+組的DNA 條帶出現顯著降解，表明從總體水平來看，Gh（圖8a）和Va（圖8b） 經過姜黃素PDT 處理后，DNA 均被嚴重損傷。 Gong 等[22]通過瓊脂糖凝膠電泳分析觀察到姜黃素PDT 不僅可以損傷假單胞菌DNA，并且對RNA 也具有一定的損傷作用。

圖8 姜黃素PDT 處理后Gh 和Va 總DNA 的瓊脂糖凝膠電泳分析圖Fig.8 Agarose gel electrophoresis analysis of Gh and Va total DNA after curcumin PDT treatment

分析光動力處理后細菌DNA 上的毒力基因發(fā)現，姜黃素PDT 處理后的Gh（圖9）和Va（圖10a）毒力基因條帶亮度與對照組相比沒有明顯的減弱。 提取細菌總DNA， 進一步對裸露的細菌DNA 進行姜黃素PDT 處理后檢測毒力基因（圖9和圖10b），結果也未觀察到明顯的條帶降解。 這可能是由于試驗中選擇的毒力基因區(qū)域并非姜黃素PDT 的主要損傷位置， 也可能是因為ROS 的半衰期極短， 試驗中檢測的毒力基因片段長度太短（最長591 bp），PDT 產生ROS 將DNA 降解為較大的片段后，無法進一步將其完全碎片化。

圖9 姜黃素PDT 處理后對Gh 毒力基因的瓊脂糖凝膠電泳分析圖Fig.9 Agarose gel electrophoresis analysis of Gh virulence gene after curcumin PDT treatment

圖10 姜黃素PDT 處理后Va 毒力基因的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.10 Agarose gel electrophoresis analysis of Va virulence genes after curcumin PDT treatment

PDT 滅活致病菌的作用機理被認為是光動力技術作用過程中所得產生ROS， 通過Ⅰ型（自由基）和Ⅱ型（單線態(tài)氧）反應途徑達到滅菌目的[23-24]。本文研究結果顯示，PDT 對Gh 和Va 的滅活作用機理主要是通過誘導菌體內產生高水平的ROS，嚴重損傷菌體蛋白和DNA，最終導致細胞死亡。 然而本文所選擇的毒力基因片段經姜黃素PDT 處理后未見明顯損傷， 其原因有待進一步研究探討。

3 結論

PDT 技術（水溶性姜黃素，420 nm LED 藍光）能夠有效滅活水產食品致病菌Gh 和Va， 其滅活效果與暗培養(yǎng)時間、 姜黃素濃度和光照時間呈正相關。 PDT 對Gh 和Va 的滅活機理主要是通過ROS（自由基、單線態(tài)氧）的產生和強氧化作用，嚴重損傷菌體蛋白和DNA， 最終導致細胞死亡，達到滅菌目的。 鑒于姜黃素光動力技術對霍利斯格里蒙特菌和溶藻弧菌的高效滅活效果， 結合前期關于PDT 對于副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌的滅活效果， 姜黃素光動力技術有可能成為一種新型潛在的水產食品致病菌滅菌技術， 用于水產食品加工安全防控。