朱 凱， 劉閃閃， 葉興乾，2，3， 陳士國，2，3*

（1 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院 智能食品加工技術(shù)與裝備國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南方果蔬保鮮技術(shù)集成科研基地浙江省健康食品制造與品質(zhì)控制國際合作基地 杭州310058 2 浙江大學(xué)馥莉食品研究院 杭州310058 3 浙江大學(xué)寧波研究院 浙江寧波315100）

硫酸化多糖是指在糖單元羥基上含有硫酸根的多糖，包括直接從植物中提取的，人工合成的天然中性多糖的硫酸衍生物[1]。 多糖硫酸化后，硫酸化的羥基顯示出位阻和靜電排斥的變化。此外，多糖鏈的彎曲和延伸以及水溶性增加， 導(dǎo)致生物學(xué)活性的改變[2]。 大量研究表明，與未硫酸化的多糖相比，硫酸化的多糖具有更好的生物特性，如硫酸軟骨素、褐藻多糖硫酸酯、肝素等具有抗凝血、抗癌[3]、抑制糖尿病[4]等生理活性。研究者嘗試將不同來源的植物多糖進(jìn)行硫酸酯化改性， 賦予其更強(qiáng)的生理活性[5-7]。 多糖硫酸酯化修飾是用硫酸基團(tuán)取代大分子糖基單元的烴基， 形成半合成酸性多糖，導(dǎo)致其空間結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)發(fā)生改變，使某些活性降低或不具活性的糖類物質(zhì)產(chǎn)生新活性[8]。如Xie 等[6]對青錢柳多糖進(jìn)行硫酸酯化，增強(qiáng)了其抗氧化性。

果膠是一類廣泛分布于植物細(xì)胞壁的復(fù)雜酸性雜多糖[9]。 根據(jù)果膠結(jié)構(gòu)形式的不同，可將其分為3 種類型， 即： 同型半乳糖醛酸聚糖（Homogalacturonan， HG）、 鼠李半乳糖醛酸聚糖I（Rhamn-galacturonan I， RGI）和鼠李半乳糖醛酸聚糖II（Rhamngalaeturonan II， RGII）[10-11]。果膠具有良好的乳化、增稠、穩(wěn)定和凝膠性能，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和其它工業(yè)上[12-13]。 越來越多的研究表明，果膠還具有改善腸道環(huán)境[14]、控制肥胖、抗腫瘤[15]等多種生理活性。 柑橘罐頭生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生較多的酸水、堿水等工業(yè)廢水，如不加以回收利用而直接排放，就會對環(huán)境造成極大污染，并浪費(fèi)廢水中的糖類等資源。 本課題組研究人員前期從柑橘罐頭的生產(chǎn)廢水中回收柑橘囊衣果膠多糖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其具有高RG-I 含量特征，并具有優(yōu)異的益生、抗癌活性[16]。 通過過氧化氫-銅離子（H2O2-Cu2+）、 超聲-過氧化氫-抗壞血酸 （USH2O2-VC）兩種降解體系，對柑橘囊衣果膠進(jìn)行降解，提高了其生物活性[17]。

常見的多糖硫酸化修飾方法包括氯磺酸-甲酰胺法、氯磺酸-嘧啶法、N（SO3Na）3法、三氧化硫-嘧啶法等。本文參考作者所在實(shí)驗(yàn)室對柑橘果膠的硫酸酯化及其活性的研究結(jié)果[18]，通過TBA和DMSO 兩種方法進(jìn)行硫酸酯化， 并探究柑橘囊衣果膠多糖及其硫酸酯產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘囊衣果膠多糖（PP， Mw=792 ku）提取自生產(chǎn)柑橘罐頭中產(chǎn)生的廢水[16]，果膠降解產(chǎn)物POS1（500 u ＜POS1 ＜3 ku）和POS2（3 ku＜POS2 ＜5 ku）采用H2O2-Cu2+體系制備[17]。

葡聚糖標(biāo)品，美國Sigma 公司；重水，美國CIL公司；DMEM 培養(yǎng)基， 美國Gibco 公司；MCF-7 細(xì)胞系，中國科學(xué)院；其它試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 2659 高效液相色譜儀（Waters2414 示差檢測器，Waters PDAU1966 檢測器）， 美國Waters 公司；3K15 離心機(jī)，美國Sigma-Aldrich 公司；MS105DU 電子天平，瑞士METTLER TOLEDO 公司；1510 全波長酶標(biāo)儀、Nicolet5700 紅外光譜儀，美國Thermo 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 柑橘囊衣果膠多糖及其降解產(chǎn)物硫酸酯化

1.3.1.1 三氧化硫吡啶-DMSO 體系硫酸酯化 稱取200 mg PP、POS1、POS2 各3 份， 分別加入20 mL DMSO 進(jìn)行溶脹， 磁力攪拌12 h 后加入三氧化硫復(fù)合物溶液 （2 g SO3吡啶復(fù)合物溶于4 mL DMSO），于80 ℃下反應(yīng)3 h，待反應(yīng)液冷卻后滴加100 mL 冰水， 純凈水透析72 h （每4 h 更換一次水）， 將所得溶液真空冷凍干燥， 產(chǎn)物分別記為PP-D、POS1-D 及POS2-D 并置于干燥器中備用。

1.3.1.2 TBA-三氧化硫吡啶-DMSO 體系硫酸酯化 稱取PP、POS1、POS2 各3 份， 將其溶于超純水中，完全溶解后，制成果膠溶液。 用TBA 滴定至pH 值在6.0～6.5 之間后，冷凍干燥，制得果膠TBA鹽。

稱取200 mg 果膠TBA 鹽3 份， 分別加入10 mL DMSO 進(jìn)行溶脹， 磁力攪拌12 h 后加入三氧化硫吡啶復(fù)合物溶液（2 g SO3吡啶復(fù)合物溶于4 mL DMSO），于室溫下反應(yīng)3 h，待反應(yīng)后滴加入100 mL 冰水， 純凈水透析72 h （每4 h 更換一次水）， 將所得溶液真空冷凍干燥， 產(chǎn)物分別記為PP-T、POS1-T 及POS2-T 并置于干燥器中備用。

1.3.2 柑橘囊衣果膠硫酸酯及果膠降解產(chǎn)物硫酸酯結(jié)構(gòu)分析

1.3.2.1 紅外光譜分析 （FTIR） 分別取0.5 mg PP、PP-D、PP-T、POS1、POS1-D、POS1-T、POS2、POS2-D、 及POS2-T 干燥樣品與KBr 以1∶100 的比例混勻，經(jīng)壓片機(jī)壓片，利用Nicolet 5700 紅外光譜儀上測定，掃描波長范圍為450～4 500 cm-1。

1.3.2.2 分子質(zhì)量分析（HPSEC） 分別稱取1，3，5，12，50，80，150，270，410 ku 分子質(zhì)量的葡聚糖標(biāo)品及樣品2 mg， 分別溶于1 mL 超純水中，過0.45 μm 水膜。 HPSEC 檢測條件：Waters 2695 高效液相色譜儀，流動相0.2 mol/L NaCl 溶液，流速0.5 mL/min， 進(jìn)樣量20 μL；Waters Ultrahydrogel 250 及Waters Ultrahydrogel 500，柱溫40 ℃；Waters 2414 示差檢測器，40 ℃。

1.3.2.3 單糖組成分析 配制標(biāo)準(zhǔn)單糖（甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖）的混合溶液（各單糖濃度為2 mmol/L）。 取上述混合溶液400 μL 于離心管中， 加入0.3 mol/L NaOH 溶液450 μL，0.5 mol/L PMP（甲醇）450 μL，混勻，置于70 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min 后， 取出并冷卻至室溫， 加入0.3 mol/L HCl 450 μL 中和， 離心去沉淀， 加水至1 mL，加入1 mL 氯仿進(jìn)行萃取，充分震蕩、離心并收集水相，重復(fù)3 次，過0.45 μm 水膜備用。

分 別 取PP、PP -D、PP -T、POS1、POS1 -D、POS1-T、POS2、POS2-D、及POS2-T（2 mg）溶于1 mL 純凈水中，加入1 mL 4 mol/L TFA，置于具塞試管中、氮?dú)夥饪冢?10 ℃水解8 h，冷卻至室溫，加入200 μL 甲醇，一邊用水浴（70 ℃）升溫，一邊氮?dú)獯蹈桑ɑ蛘唠x心濃縮），反復(fù)3 次，待衍生化。

參考Zhang 等[19]方法，并作適當(dāng)調(diào)整。 流動相：A 相： 體積分?jǐn)?shù)15%乙腈+0.05 mol/L pH=6.8的磷酸鹽緩沖溶液：B 相： 體積分?jǐn)?shù)40%乙腈+0.05 mol/L pH=6.8 的磷酸鹽緩沖溶液。 色譜柱：C18 分離柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；紫外檢測波長250 nm；進(jìn)樣體積：10 μL；柱溫：25 ℃；流速1.0 mL/min； 時間梯度：0-10-30 min； 濃度梯度：0-15%-25% B 相。

1.3.2.4 一維核磁共振圖譜分析 （1H-NMR） 分別取5 mg PP、PP-D、PP-T、POS1、POS1-D、POS1-T、POS2、POS2-D 及POS2-T，用99.9%重水交換2次，真空冷凍干燥，再加入0.6 mL 重水溶解，利用Bruker 公司的AVIII 800M 核磁波譜儀在20 ℃條件下進(jìn)行1H NMR 測定。

1.3.3 柑橘囊衣果膠硫酸酯及果膠降解產(chǎn)物硫酸酯抗腫瘤活性的測定

1.3.3.1 MCF-7 細(xì)胞培養(yǎng) 以PP、PP-D、PP-T、POS1、POS1-D、POS1-T、POS2、POS2-D 及POS2-T 為研究對象，探究其對MCF-7 腫瘤細(xì)胞生物活性的抑制作用，具體方法參照Wu 等[20]的研究，并作一定程度的修改。 從-80 ℃冰箱中取出來裝有MCF-7 細(xì)胞的凍存管后，將凍存管置于37 ℃水浴鍋中迅速解凍至液體完全融化。在超凈工作臺內(nèi)，取出細(xì)胞懸浮液加入離心管后，再立刻注入10 倍培養(yǎng)液（DMEM 培養(yǎng)液，含有10%胎牛血清、50 U/mL 盤尼西林、50 μg/mL 鏈霉素以及100 μg/mL 慶大霉素），混合均勻后1 000 r/min 離心5 min，棄掉上清液并向離心管內(nèi)加入10 mL 培養(yǎng)液，混勻后制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞濃度調(diào)至5×104cell/mL。將細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)， 將培養(yǎng)瓶放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)， 每24 h 更換一次培養(yǎng)液并傳代一次，傳代3 次后用于MTT 試驗(yàn)。

1.3.3.2 MTT 法檢測MCF-7 增值

1） 接種細(xì)胞 取處于對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞，1 000 r/min 離心10 min，用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)制1×105cell/mL 后，取100 μL （1×104）MCF-7 細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中， 然后分別加入PP、PP-D、PP-T、POS1、POS1-D、POS1-T、POS2、POS2-D 及POS2-T 以及不含樣品的培養(yǎng)液各100 μL， 濃度梯度均設(shè)置為50，125，250，500 μg/mL，每孔5 個平行孔。 調(diào)零孔不加MCF-7 細(xì)胞懸液， 只加入10%胎牛血清200 μL，每孔5 個平行孔；

2） 培養(yǎng)細(xì)胞 接種細(xì)胞并混勻后置于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)96 h；

3） 呈色 每孔加入5 mg/mL 的MTT 磷酸緩沖液20 μL；

4） 終止培養(yǎng) 同等條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)。 1 000 r/min 離心5 min，然后棄去96 孔培養(yǎng)板孔內(nèi)的培養(yǎng)液，分別加150 μL DMSO 于每孔內(nèi)，震蕩10 min，充分溶解結(jié)晶物；

5） 測定OD 值 酶標(biāo)儀檢測波長570 nm 處的吸光值。 按照下面公式計算細(xì)胞生產(chǎn)抑制率：

細(xì)胞生長抑制率（%）=（1-試驗(yàn)孔OD570nm/對照孔OD570nm）×100

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘囊衣果膠降解產(chǎn)物及其硫酸酯化果膠降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)

2.1.1 果膠硫酸酯化測定 柑橘囊衣果膠及其果膠降解產(chǎn)物的硫酸酯化多糖 （PP、PP-D、PP-T、POS1、POS1-D、POS1-T、POS2、POS2-D 和POS2-T）紅外光譜如圖1a～c 所示。 硫酸酯化前、后的果膠多糖及其寡糖具有非常接近的吸收波形、 吸收強(qiáng)度和峰寬，3 750～3 050 cm-1（O-H）和2 927 cm-1（C-H）處保留原果膠多糖特征吸收峰[21]，說明相關(guān)硫酸酯化法并不會劇烈的改變果膠結(jié)構(gòu)。 同時在827 cm-1和1 242 cm-1附近出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，這分別是C-O-S 的對稱振動吸收峰和S=O 的非對稱伸縮振動吸收峰[22-23]，表明羥基上有硫酸酯基，硫酸化修飾已經(jīng)完成。此外，可以利用800～850 cm-1的區(qū)域來推測酯化反應(yīng)中硫酸基的取代位置， 一般而言，850，830，810 cm-1附近分別是硫酸基在C-3、C-2、C-6 位發(fā)生了取代， 結(jié)合本試驗(yàn)紅外光譜結(jié)果表明， 上述樣品的硫酸酯化反應(yīng)主要發(fā)生在C-2 位。 綜上，采用TBA 和DMSO 體系2 種方法均能實(shí)現(xiàn)對柑橘囊衣果膠及其寡糖的硫酸酯化。

圖1 果膠硫酸酯化前、后的紅外光譜圖Fig.1 FTIR spectra of the pectic polysaccharide before and after sulfate esterification

2.1.2 分子質(zhì)量及單糖組成 采用HPSEC 法和HPLC-PMP 法分別測定了硫酸酯化前、后，柑橘囊衣果膠多糖PP 及其降解物POS1（500 u ＜POS1 ＜3 ku）、POS2（3 ku＜POS2 ＜5 ku）的分子質(zhì)量和單糖組成， 結(jié)果如表1 所示。 分子質(zhì)量測定結(jié)果表明， 與硫酸酯化前相比， 硫酸酯化后PP、POS1、POS2 的分子質(zhì)量均發(fā)生了不同程度的降低，說明反應(yīng)較為劇烈，對糖鏈產(chǎn)生了一定程度的降解[24]。然而值得注意的是，對于果膠寡糖POS1、POS2 而言， 硫酸酯化后分子質(zhì)量并沒有出現(xiàn)像果膠多糖PP 一樣的劇烈下降，可能是由于添加硫酸基團(tuán)增加了寡糖的分子質(zhì)量[25]。 由于TBA 法反應(yīng)相對溫和， 因此其制備的果膠硫酸酯的分子質(zhì)量低于DMSO 法。

表1 柑橘囊衣果膠多糖PP 及其降解產(chǎn)物POS1 和POS2 硫酸酯化前、后的單糖組成和分子質(zhì)量Table 1 Monosaccharide composition and molecular weight of pectin polysaccharide PP and its degradation products POS1 and POS2 before and after sulfation

通過對硫酸酯化前、后的單糖組成分析發(fā)現(xiàn)，兩種體系制備的硫酸酯樣品的單糖組成與硫酸酯化前相比，差異不大。 在Chaouch 等[26]的研究中指出， 硫酸酯化的果膠多糖的阿拉伯糖和木糖比例呈現(xiàn)下降趨勢。 然而，本研究中果膠多糖PP 在硫酸酯化前、 后的單糖組成比例并沒有發(fā)生顯著地改變， 僅在半乳糖醛酸和阿拉伯糖的含量上呈現(xiàn)細(xì)微差異。對于POS1 和POS2，硫酸酯化前、后，單糖組成成分雖沒有變化， 但是組成比例存在一定的差異性。 其中， 通過對比POS1 的酯化產(chǎn)物POS1-D、POS1-T 發(fā) 現(xiàn)，TBA 法制備的硫酸酯（POS1-T）中，鼠李糖物質(zhì)的量比得到了較大的提高，可能是因?yàn)樵谥苽銹OS1-D 的過程中，其它單糖如半乳糖和葡萄糖等，存在一定的脫落現(xiàn)象。

（續(xù)表1）

2.1.3 硫酸酯化后果膠核磁共振圖譜分析 硫酸酯化前、后，果膠、POS1 及POS2 的1H NMR 譜圖如圖2a～c 所示，4.8～4.5 是硫酸基及β-異構(gòu)體C1質(zhì)子信號，而在硫酸酯化以后，各組分的1H NMR譜圖中4.8～4.5 均有新的信號產(chǎn)生，表明生成了新的硫酸酯化產(chǎn)物。 上述3 種樣品經(jīng)過硫酸酯化以后，阿拉伯糖異頭氫信號向低場位移移動，表明阿拉伯糖發(fā)生了硫酸酯化；而Ara-H2 化學(xué)位移δ=4.21 向低場位移至δ=4.48[20]，同時結(jié)合紅外光譜分析結(jié)果，說明在阿拉伯糖的C2 位發(fā)生了硫酸基取代。 此外，根據(jù)此前的報道[27]，果膠的GalA 單元存在2， 3-O-位被硫酸化的現(xiàn)象， 圖2 中硫酸酯化后的PP、POS1 及POS2 的GalA-H4 化學(xué)位移均不同程度地向低場位移， 進(jìn)一步證明了硫酸化位點(diǎn)也發(fā)生于果膠HG 主鏈。 對于PP、POS1 和POS2，硫酸酯化后的化學(xué)位移存在較大的變化，一些氫信號消失或減弱， 可能是因?yàn)樵谥苽淞蛩狨ギa(chǎn)物的過程中，PP、POS1 及POS2 發(fā)生了較大程度的降解，致使一些糖單元脫落，其中半乳糖醛酸異頭氫信號強(qiáng)度減弱較為明顯， 說明糖主鏈發(fā)生了降解。 同時，對于硫酸酯化產(chǎn)物，在δ=5.27 附近出現(xiàn)了新的信號， 這歸屬于阿拉伯糖異頭氫的信號， 這可能是由于果膠側(cè)鏈也發(fā)生了一定程度的降解，暴露出更多的阿拉伯糖側(cè)鏈。與DMSO 法制備的硫酸酯化樣品不同，TBA 法的異頭氫信號相對單一，可能是該種方法的條件相對溫和，取代方式相對單一[22]。

圖2 果膠硫酸酯化前、后的一維核磁共振氫譜圖Fig.2 1H NMR spectra of pectins before and after sulfate esterification

2.2 果膠、POS1、POS2 及其硫酸酯產(chǎn)物的抗腫瘤活性

前期相關(guān)研究表明， 果膠多糖及其降解產(chǎn)物具有一定的抗癌活性[28-30]。體外試驗(yàn)已成為篩選天然的抗腫瘤藥物的重要手段，其中MTT 比色法因其快捷、簡單和污染小等特點(diǎn)而受到人們的重視[31]。如 圖3所示，PP、PP-D、PP-T、POS1、POS1-D、POS1-T、POS2、POS2-D 及POS2-T 均能對體外培養(yǎng)的MCF-7 腫瘤細(xì)胞活性增殖表現(xiàn)出一定的抑制作用，且對于每個樣品，隨著質(zhì)量濃度的升高，抗腫瘤活性也隨之增強(qiáng)， 表明上述9 種物質(zhì)抑制MCF-7 增殖作用呈劑量依賴性，與相關(guān)研究結(jié)果一致[5]。對于PP 而言，兩種體系制備的硫酸酯產(chǎn)物抗腫瘤活性幾乎無差異； 然而對于POS1 和POS2而言，硫酸酯化后，其抗腫瘤活性均得到了一定程度的增強(qiáng)，且相對而言，TBA 體系制備的硫酸酯產(chǎn)物比DMSO 制備的硫酸酯產(chǎn)物效果好。 通過單因素方差分析發(fā)現(xiàn)， 當(dāng)質(zhì)量濃度為50 μg/mL 時，與陰性對照組相比，PP 對MCF-7 細(xì)胞的體外增殖抑制具有顯著性差異 （P ＜0.05），PP-D、PP-T、POS1、POS1-D、POS1-T、POS2、POS2-D 及POS2-T 的其余作用點(diǎn)均表現(xiàn)出極顯著性差異（P ＜0.01）。當(dāng)上述9 種物質(zhì)的質(zhì)量濃度為500 μg/mL 時，它們對MCF-7 細(xì)胞的體外生長抑制率都達(dá)到了最高，其中POS1-T 的效果最佳，為30.25%。 進(jìn)一步表明柑橘囊衣果膠經(jīng)過H2O2-Cu2+體系降解后，其體外抗腫瘤活性增強(qiáng)， 且對降解產(chǎn)物POS1 及POS2 進(jìn)行硫酸酯化后，其體外抗腫瘤活性進(jìn)一步增強(qiáng)。

圖3 果膠、POS1、POS2 及其硫酸酯產(chǎn)物對MCF-7 的抗腫瘤活性Fig.3 Anti-proliferation effects of native pectic polysaccharide， POS1， POS2 and their sulfated products on MCF-7 cells

3 結(jié)論

以柑橘囊衣果膠PP 及其H2O2-Cu2+降解的寡糖POS1 和POS2 為研究對象，采用DMSO 和TBA兩種體系成功地對其進(jìn)行硫酸酯化， 研究了硫酸酯化后產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和生物活性。 通過分子質(zhì)量測定和單糖組成分析表明，經(jīng)兩種體系硫酸酯化后，果膠多糖和寡糖的分子質(zhì)量均呈降低趨勢， 且存在一些單糖單元脫落。 結(jié)合1H-NMR 數(shù)據(jù)，POS1 的半乳糖異頭氫和POS2 的阿拉伯糖異頭氫信號均向低場位移動， 并且各組分的半乳糖醛酸的H4也向低場移動， 說明果膠多糖及寡糖在主鏈和側(cè)鏈均發(fā)生了硫酸酯化?？鼓[瘤活性結(jié)果表明，柑橘囊衣果膠經(jīng)過H2O2-Cu2+體系降解后，其體外抗腫瘤活性增強(qiáng)，且降解產(chǎn)物POS1 及POS2 經(jīng)過硫酸酯化后， 其體外抗腫瘤活性進(jìn)一步增強(qiáng)。 其中，POS1-T 的效果最佳，為30.25%，表明硫酸酯化可以提高果膠的抗腫瘤活性。