劉子祺，錢軍

（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院血液科，江蘇 鎮(zhèn)江 212000）

賴氨酸去甲基化酶6A（lysine demethylase 6A，KDM6A）在20多年前首次被發(fā)現(xiàn)，于2007年被鑒定為特異性組蛋白去甲基化酶［1］，能去除組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化（H3K27me3）修飾的抑制作用，對生理造血有重要意義。髓系腫瘤是骨髓內(nèi)異常造血干祖細胞（hematopoietic stem and progenitor cell，HSPC）的克隆性增生。復(fù)發(fā)和耐藥是多數(shù)患者總體預(yù)后較差的主要原因。KDM6A通過表觀修飾作用調(diào)控關(guān)鍵基因和信號通路，從而影響髓系腫瘤的發(fā)生和預(yù)后。

1 KDM6A的結(jié)構(gòu)和功能

KDM6A，也被稱為X染色體上普遍轉(zhuǎn)錄的四三肽重復(fù)序列，其編碼基因定位于性染色體Xp11.2，包含33個外顯子。KDM6A在人體正常組織中廣泛表達，由1 401個氨基酸殘基構(gòu)成不同的基序，其中在羧基端的催化基序——Jumonji C（JmjC）結(jié)構(gòu)域賦予其H3K27me3的去甲基化活性，而在氨基端的調(diào)控基序——三十四肽重復(fù)（tetratricopeptide repeat，TPR）結(jié)構(gòu)域幫助核定位，二者協(xié)同促進靶基因的轉(zhuǎn)錄及介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用［2-3］。作為KDM6亞家族的一員，KDM6A在人類中有2個旁系同源物：KDM6B和KDM6C。與KDM6A相比，KDM6B缺乏TPR結(jié)構(gòu)域，其編碼基因位于17p13.1；而KDM6C盡管擁有JmjC結(jié)構(gòu)域，但去甲基化活性很低，其編碼基因位于Yq11.221［3-4］。KDM6A通過去甲基化作用解除H3K27me3對基因轉(zhuǎn)錄的抑制，廣泛促進干細胞增殖分化和組織器官發(fā)育，包括神經(jīng)、心臟、肌肉及骨等［5-11］。

2 KDM6A在造血系統(tǒng)中的生理功能

KDM6A在骨髓、脾、胸腺及肝臟等主要造血器官中均表達［12］，提示其對機體造血很可能有重要作用。早期研究觀察到，KDM6A敲減并不促進凋亡，但可使小鼠原代骨髓細胞的紅系、巨核系和B細胞的集落形成減少，其機制主要是KDM6A敲減后RUNX1、MLL1和SCL啟動子區(qū)KDM6A占有率下降，H3K27me3水 平顯著增加［12］。其后研究顯示，KDM6A促進HSPC增殖、遷移及分化，KDM6A敲減后小鼠造血祖細胞系32D細胞遷移能力下降，但整體H3K27me3水平并無變化，KDM6A敲除后小鼠原代HSPC遷移能力同樣顯著降低［13］。HSPC由造血內(nèi)皮細胞通過內(nèi)皮-造血細胞轉(zhuǎn)化（endothelial-hemtopoietic transition，EHT）產(chǎn)生。研究證實，EHT過程依賴維生素C參與，維生素C致整體H3K27me3水平下降、并促進造血相關(guān)基因的染色質(zhì)開放，而KDM6A在這一過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［14］。體外敲除KDM6A的HSPC出現(xiàn)分化相關(guān)基因CAR1/2、LYL1、SCL和GATA1以及腫瘤抑制因子BAX下調(diào)，下調(diào)基因多富集于造血譜系分化及免疫相關(guān)通路，如RPS14和IL2/STAT5通路，而PU.1上調(diào)，主要影響紅系和巨核系的轉(zhuǎn)錄生成［13，15］。最新的研究表明，KDM6A可抑制B細胞分化，其敲除后邊緣區(qū)B細胞增殖和漿細胞形成增加，促凋亡基因的H3K27me3水平升高、漿細胞凋亡減少［16］。然而，Huppertz等［17］認為KDM6A缺失致pro-B細胞向pre-B細胞分化受阻。近年的研究觀察到KDM6A在維持造血穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用，造血干細胞中KDM6A表達隨年齡增長而下降，KDM6A敲除后HSPC衰老相關(guān)標(biāo)志物表達增加，活性氧積累，DNA雙鏈斷裂修復(fù)受損，并且HSPC歸巢和造血重建能力顯著降低［18］。但Huppertz等［17］的研究則認為KDM6A缺失并不影響HSPC歸巢，造血重建能力下降可能是HSPC增殖、分化或存活缺陷所致。此外，KDM6A對自然殺傷（natural killer，NK）細胞的功能有重要作用，敲除或抑制KDM6A后可減少促炎因子IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、IL-2和抗炎因子IL-10，同時改變NK細胞的炎癥轉(zhuǎn)錄譜，包括周期、代謝和信號傳導(dǎo)等通路，導(dǎo)致NK細胞在炎癥功能中的降低［19］。

3 KDM6A在造血系統(tǒng)中的病理作用

3.1 KDM6A在急性髓系白血?。╝cute myelogenous leukemia，AML）中的作用最初對200例AML的腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）研究及其后對1 540例AML的大規(guī)模研究均顯示，AML患者存在著再現(xiàn)性KDM6A突變［20-21］。而對核心結(jié)合因子（core-binding factor，CBF）-AML的研究觀察到KDM6A突變主要發(fā)生于RUNX1-RUNX1T1白血病患者［22］。其后，Greif等［23］對50例正常核型AML患者標(biāo)本測序檢測到2例患者在復(fù)發(fā)時出現(xiàn)KDM6A突變，均位于JmjC域，進一步研究觀察到在白血病細胞株MM-6中也存在KDM6A基因外顯子3～10純合子缺失伴KDM6A表達缺失，賦予MM-6細胞對阿糖胞苷（arabinosylcytosine，AraC）的抗性；對臨床數(shù)據(jù)的分析也顯示細胞遺傳學(xué)正常的AML（cytogenetically normal AML，CN-AML）患者初診時KDM6A低表達可能是不良預(yù)后的一個預(yù)測因素。隨后Stief等［24］對20例伴KDM6A突變AML的研究觀察到多數(shù)突變位于TPR和JmjC結(jié)構(gòu)域，65%患者存在移碼插入/缺失或無義突變，提示功能喪失表型。8例患者在初診時即有KDM6A突變；在12/20例患者中，突變僅發(fā)生在AML亞克隆細胞中，變異等位基因頻率（variant allele frequency，VAF）低于15%。PDX模型證實攜帶E1325X突變的復(fù)發(fā)白血病細胞移植到免疫缺陷小鼠中可致KDM6A-E1325X突變克隆穩(wěn)定再生；在未檢出KDM6A突變的9例AML中出現(xiàn)4例復(fù)發(fā)時KDM6A蛋白表達顯著下降、而3例患者復(fù)發(fā)時卻呈上升態(tài)勢；進一步對35例CN-AML的檢測觀察到45.7%患者KDM6A mRNA表達下調(diào)，而37.1%患者表達上調(diào)［24］。而Boila等［25］卻檢測到原代AML細胞和AML細胞系中KDM6A mRNA和蛋白表達均上調(diào)。這可能與病例構(gòu)成不同有關(guān)。此外，也有研究觀察到不管KDM6A表達如何，AML患者存在著KDM6A高甲基化改變，初診時KDM6A高甲基化患者生存時間縮短［26］。

動物模型研究觀察到，KDM6A條件性敲除后雌性小鼠脾臟重量明顯增加，脾臟和骨髓中以髓系細胞為主，外周血白細胞不同程度增加，而血紅蛋白和血小板則下降，63%的KDM6A-/-小鼠發(fā)展為AML，而KDM6A+/-小鼠和KDM6A+/+小鼠均無AML形成［27］。進一步研究證實KDM6A缺失使HSPC處于白血病前狀態(tài)，HSPC顯著擴增，粒細胞-單核細胞祖細胞和髓系祖細胞增加，而巨核細胞-紅細胞祖細胞和淋巴祖細胞則顯著減少；KDM6A缺失激活白血病發(fā)展過程中的致癌性ETS轉(zhuǎn)錄程序、并通過降低染色質(zhì)的可及性和局部H3K27的乙酰化來下調(diào)GATA驅(qū)動的基因程序［27］。

此外，體內(nèi)外研究證實，KDM6A突變致白血病細胞對AraC的抗性增加，而KDM6A敲減同樣能夠降低細胞對AraC和柔紅霉素的敏感性，KDM6A重新表達則可恢復(fù)其敏感性。KDM6A缺失介導(dǎo)的AraC耐藥是通過下調(diào)對細胞攝取核苷及其類似物具有重要作用的膜轉(zhuǎn)運蛋白ENT1表達所致［24］。然而，有研究觀察到，KDM6A與核小體重塑和脫乙酰酶相互作用，進而調(diào)節(jié)AML細胞中胞質(zhì)分裂因子5/8（dedicator of cytokinesis 5/8，DOCK5/8）的表達，而針對DOCK的小分子抑制劑CPYPP可與DOCK同源區(qū)結(jié)構(gòu)域結(jié)合并抑制DOCK家族蛋白的活性，進而抑制AML細胞活力，減弱AML細胞遷移，并誘導(dǎo)凋亡基因表達，而KDM6A缺乏則進一步使AML細胞對CPYPP抑制敏感［28］。這些結(jié)果提示KDM6A在AML中的作用可能存在著遺傳學(xué)背景和時空背景下的特異性。

3.2 KDM6A在慢性髓系白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）中的作用CML是BCR-ABL融合基因所致的一種造血系統(tǒng)惡性疾病，酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）的廣泛應(yīng)用使得CML患者的預(yù)期壽命近于正常，但仍有2%～3%的患者對TKI治療無反應(yīng)并發(fā)生疾病進展，生存期只有7～11個月［29］。BCR-ABL1酪氨酸激酶區(qū)突變之外的其他基因突變在TKI治療反應(yīng)不佳中的作用已逐漸成為研究熱點之一。最近，Adnan Awad等［29］在TKI療效差的5例慢性期CML標(biāo)本中檢測到1例存在KDM6A-R1163P突變；其后對嘗試TKI停藥的47例CML患者的研究也觀察到30例失去主要分子學(xué)反應(yīng)，其中1例獲得KDM6A-Q1058X突變［30］。盡管KDM6A敲除顯著改變了K562細胞的組蛋白乙?；图谆癄顟B(tài)，但似乎并未影響K562細胞對伊馬替尼、達沙替尼和普納替尼的敏感性；并且，KDM6A敲除后K562細胞對NK細胞殺傷的敏感性降低，雖然KDM6A突變也存在于CML患者的NK細胞，但在NK細胞系NK-92中敲除KDM6A并未影響其對K562細胞的殺傷活性［30］。Zhang等［31］的研究認為，KDM6A在CML患者中表達上調(diào)，并且伊馬替尼耐藥的患者較治療有反應(yīng)者具有更高的KDM6A mRNA水平。與Adnan Awad等［29］的結(jié)果不同，Zhang等［31］觀察到KDM6A敲減/敲除后K562和MEG-01細胞對伊馬替尼誘導(dǎo)的凋亡更為敏感，并且KDM6A對于CML細胞在伊馬替尼作用下的保護效應(yīng)并不依賴BCR-ABL的表達或活性；進一步研究觀察到KDM6A對CML細胞的保護作用也不依賴于其去甲基化酶活性，而是通過調(diào)節(jié)原肌球蛋白受體激酶A（tropomyosin receptor kinase A，TRKA）和神經(jīng)營養(yǎng)受體酪氨酸激酶1（neurotrophic receptor tyrosine kinase 1，NTRK1）發(fā)揮作用，KDM6A被YY1招募到NTRK1增強子位點后，維持NTRK1的組蛋白乙?；?，并與YY1共同允許染色質(zhì)的可及性，促進神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）/TRKA信號傳導(dǎo)，從而保護CML細胞免受伊馬替尼的影響。

3.3 KDM6A在慢性粒單核細胞白血病（chronic myelomonocytic leukoemia，CMML）中的作用CMML是一種具有骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）和骨髓增生性腫瘤（myeloproliferative neoplasm，MPN）重疊特征的克隆性造血干細胞疾病。由于其發(fā)病機制的復(fù)雜性，目前尚缺乏有效治療。Jankowska等［32］首次在72名CMML患者隊列中檢測到7例（10%）存在KDM6A異常：6例突變（4例錯義突變和2例無義突變）和1例缺失，更常見于晚期CMML（CMML-2和CMML-AML）中。對腫瘤體細胞突變目錄數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果顯示，TP53是具有KDM6A突變的全部腫瘤患者中最常見的共突變基因（33.9%）；而在CMML、CMML-AML、AML和MDS患者中，KDM6A突變患者中TP53突變率也高于KDM6A未突變患者（分別為21.7%和6.7%）［33］。動物模型觀察到，小鼠敲除KDM6A后出現(xiàn)CMML樣表現(xiàn)：脾腫大，外周血單核細胞和粒細胞增多但原始細胞＜5%，同時紅細胞和血小板減少，肝脾存在著單核細胞和粒細胞的髓外造血［33］。在具有CMML樣表型的KDM6A敲除小鼠的造血干細胞和祖細胞中觀察到TP53顯著下調(diào)，表明TP53下調(diào)可能導(dǎo)致KDM6A缺失誘導(dǎo)的CMML樣疾?。?3］。該研究組進一步制備了KDM6A和TP53雙敲除小鼠，TP53單雙敲除小鼠死于T細胞淋巴瘤、肉瘤或畸胎瘤，中位生存期為6.2個月，而KDM6A和TP53雙敲除小鼠在KDM6A缺失3個月后也出現(xiàn)脾腫大，外周血、骨髓、肝脾中髓細胞和粒細胞顯著擴增，伴貧血和發(fā)育異常，外周原始細胞達5%～16%，并且小鼠壽命顯著縮短，中位生存期僅3.8個月，表明TP53缺失可促進KDM6A缺失誘導(dǎo)的CMML［33］。進一步研究表明，KDM6A缺失導(dǎo)致造血干細胞自我更新增加，易向髓系分化［33］。

3.4 KDM6A在MDS中的作用一項包含738名MDS、CMML和MDS-MPN患者的大規(guī)模測序中檢測到約2%的KDM6A突變［34］。近期對20例MDS患者的HSPC和間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）的下一代測序研究觀察到，8例（40%）HSPC和8例（40%）MSC均存在低頻KDM6A錯義/無義突變，僅2例患者的HSPC和MSC共同存在KDM6A突變；但同一患者的HSPC和MSC中KDM6A突變位點并不相同［35］。在HSPC和MSC中，KDM6A突變分別與BCORL1和PDGFRA突變的相關(guān)性分析具有統(tǒng)計學(xué)意義（分別為P=0.012和P=0.05）［35］。該研究結(jié)果提示了MDS發(fā)病的異質(zhì)性和復(fù)雜性。最近的動物模型觀察到KDM6A條件性敲除雌性小鼠出現(xiàn)年齡依賴性的MDS樣表型，KDM6A-/-小鼠出現(xiàn)輕度貧血、脾腫大及異常骨髓增生，包括雙核和發(fā)育異常的紅系前體和非典型巨核細胞的前體增加，隨年齡增長更明顯，但小鼠沒有發(fā)展為明顯的白血病，也未死于血細胞減少；競爭性移植小鼠模型也觀察到KDM6A條件性敲除的骨髓細胞造血重建能力下降。此外，KDM6A缺陷基質(zhì)可促進KDM6A敲除HSPC擴增［36］。去甲基化藥物是高風(fēng)險MDS（high-risk MDS，HRMDS）的標(biāo)準(zhǔn)治療手段之一，但多數(shù)患者會耐藥或復(fù)發(fā)。Polgarova等［37］對阿扎胞苷（azacitidine，AZA）治療的38例HR-MDS患者的基因突變進行了動態(tài)監(jiān)測，結(jié)果顯示AZA治療后VAF顯著降低的患者獲得了臨床反應(yīng)，而發(fā)生早期進展的患者突變改變極??；KDM6A突變患者總生存時間延長；但如在治療過程中其VAF下降，反應(yīng)持續(xù)時間反而縮短。

4 總結(jié)

KDM6A的表觀修飾作用對生理造血有重要意義，尤其是在促進HSPC增殖分化以及維持造血系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)方面。對多種髓系腫瘤樣本的測序均顯示存在KDM6A突變且與患者預(yù)后不良相關(guān)，KDM6A敲除的動物模型也出現(xiàn)具有髓系惡性腫瘤特征的血液學(xué)變化。研究者進一步觀察到KDM6A的作用輻射多條關(guān)鍵分子通路，作用機制包括去甲基化酶活性依賴性和非依賴性，且突變的KDM6A易與多個髓系腫瘤病程進展和預(yù)后相關(guān)基因共突變，繼而誘導(dǎo)疾病發(fā)展，促使患者出現(xiàn)耐藥和復(fù)發(fā)。臨床對KDM6A的篩查及開發(fā)靶向藥物有利于為患者制定更加精細化、個體化的治療方案。