呂永 樊哲儒 羅俊苗 王晞 王龍

膿毒癥患者易并發(fā)心房顫動（簡稱房顫）[1—2]，房顫是膿毒癥和膿毒癥休克患者死亡的一個獨立危險因素，新發(fā)房顫與膿毒癥患者重癥監(jiān)護病房的住院時間增加有關，而陣發(fā)性房顫的發(fā)展與死亡率增加明顯相關[3]。膿毒癥時促炎細胞因子的系統(tǒng)性釋放、高循環(huán)應激激素水平、自主神經功能障礙、器官功能障礙都會導致心房的電重構和結構重構，誘發(fā)房顫[4]。然而，與膿毒癥房顫相關的心電改變研究較少，對其發(fā)生機制仍不清楚，筆者以膿毒癥大鼠作為研究對象，探究膿毒癥大鼠心房肌鈉通道（INa）和超快速延遲整流鉀通道（Ikur）的變化，以及對膿毒癥大鼠房顫易感性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級雄性SD 大鼠40只，七周齡，體重（220±50）g，購自武漢大學人民醫(yī)院實驗動物中心。隨機分為兩組:假手術組（n＝20），膿毒癥組（n＝20）。適應性飼養(yǎng)一周后，禁食8 h，采用腹腔注射脂多糖（10 mg/kg）的方法建立膿毒癥大鼠模型，以膿毒癥組大鼠呼吸頻率加快，被毛蓬松豎立，眼周出現血性分泌物，大便呈稀水樣視為造模成功[5]。假手術組腹腔注射相同劑量的生理鹽水，兩組均于術后48 h進行后續(xù)實驗。

1.2 實驗試劑與溶液 脂多糖（Lipopolysaccharide），牛血清白蛋白（BSA），膠原酶Ⅱ（CollagenaseⅡ），乙二醇-雙四乙酸（EGTA），N-2-羧基派哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES），?；撬幔═aurine）及L-谷氨酸（L-Glutamic acid）均來自于美國Sigma公司，其他試劑均來自于國產分析純。

無鈣臺式液（mmol/L）:NaCl 135、KCl 5.4、MgCl21.0、Na H2PO40.33、HEPES 10、Glucose·H2O 10，PH 用NaOH 調至7.40。KB 液（mmol/L）:KCl 40、KH2PO420、L-glutamate 50、Taurine 20、EGTA 0.5、HEPES 10、Glucose·H2O 10、KOH 70、MgCl23，PH 用KOH 調至7.35。酶液:無鈣臺式液60 ml+0.12 g BSA+0.03 gⅡ型膠原酶+100 ul 50 mmol/L CaCl2。記錄INa的細胞外液（mmol/L）:NaCl 135、CsCl 5.4、MgCl21.0、CaCl21.8、Glucose·H2O 10、CdCl20.1，PH 用NaOH 調至7.35～7.40。記錄INa的細胞內液（mmol/L）:CsCl 133、NaCl 5.0、TEA-Cl 20、EGTA 10、HEPES 5.0、Mg ATP 5.0，PH 用Cs OH 調至7.35。記錄Ikur的細胞外液（mmol/L）:NaCl 136、KCl 5.4、MgCl21.0、Na H2PO40.33、HEPES 10、CaCl22.0、Glucose·H2O 10、Cd Cl20.3、BaCl20.5，PH 用NaOH 調至7.40。記錄Ikur的細胞內液（mmol/L）:KCl 140、MgCl21.0、HEPES 10、EGTA 5.0、Na2ATP 5.0，PH 用KOH 調至7.20。

1.3 心電指標及房顫易感性檢測 大鼠稱重后，腹腔注射3%戊巴比妥（60 mg/Kg），大鼠完全麻醉后固定在實驗臺上，進行氣管插管并連接呼吸機正壓通氣，電極一端連接生物電放大器（澳大利亞ADInstruments公司），一端放置在大鼠四肢皮膚下采用Labchart軟件記錄心電圖及分析心率及P 波持續(xù)時間，開胸暴露心臟后刺激電極和記錄電極分別安置在左心房表面，采用連續(xù)6個Burst刺激（5 V，50 Hz，2 s）進行房顫的誘發(fā)，Labchart軟件進行記錄和分析。房顫誘發(fā)率為Burst刺激誘發(fā)出房顫的動物數除以每組動物總數；房顫誘發(fā)成功定義為連續(xù)6個Burst刺激中有1個Burst刺激使心房產生持續(xù)1 s以上的不規(guī)則電活動，肢體心電圖顯示P 波消失，大小不同、間隔不等、形式不同的f波代替P波。

1.4 大鼠心房肌細胞的分離 大鼠稱重后，腹腔注射肝素500 UI/Kg，10 min后腹腔注射3%戊巴比妥（60 mg/Kg），大鼠完全麻醉后開胸，于心臟根部保留主動脈1～2 cm 剪下心臟，立即放入預冷的4℃無鈣臺式液中洗凈血液，1 min內插入主動脈套管，固定在用無鈣臺式液預沖洗的Langendorff灌流裝置（澳大利亞ADInstruments公司）上，用無鈣臺氏液經主動脈逆行灌流，依次結扎肺動脈干，肺靜脈，主動脈分支，使心房完全充盈。整個灌流過程中全程通氧，灌流溫度控制在36.5～37.5℃，灌流速度9～10 ml/min。無鈣臺式液灌流5 min后采用酶液灌流，消化至心房半透明，明顯蓬松變軟時停止消化，剪下心房，于20 ml KB液中剪成1 mm3大小細胞碎塊，通氧孵育10 min，靜置分杯。后吸棄上清液，再次剪碎細胞組織塊加KB 液至20 ml，經200目尼龍網過濾后得細胞懸液，梯度復鈣至1.2 mmol/L，室溫下靜置2 h進行后續(xù)膜片鉗實驗。

1.5 全細胞膜片鉗實驗 細胞外液充氧沖洗細胞池后，將細胞懸液加入細胞池內，待細胞貼壁后選擇梭型，紋理清晰的心房肌細胞進行實驗。采用P97型玻璃微電極拉制儀（美國Sutter公司）拉制玻璃微電極，使玻璃微電極灌注電極內液后入液電阻5～7 MΩ，利用三維操縱器緩慢移動電極，使電極與細胞表面形成高阻封接后破膜，給予漏電流和快慢電容補償，形成全細胞記錄。電流信號經Ag/AgCl引導，由膜片鉗放大器（德國HEKA 公司）放大，Pulse軟件（Version 8.63，Heka）記錄，所有數據儲存在計算機中用于后續(xù)分析。

1.6 電流記錄程序及曲線擬合方法[6—8]INa激活刺激程序:—120 m V 鉗制電壓，200 ms時程，階躍為5 m V，刺激間隔為1 s，從—100 m V 到+55 m V的去極化電壓脈沖刺激引出INa。INa失活曲線刺激程序:將細胞鉗制在—140 m V，先給予200 ms時程，—140 ～—30 m V 的電壓脈沖刺激（階躍為10 m V，刺激間隔為6 s），隨后記錄—35 m V（50 ms）電壓下的INa。INa失活后恢復刺激程序:將細胞鉗制在—120 m V，給予兩個50 ms時程，—30 m V 的去極化刺激P1和P2（時間間隔為10 ～1200 ms），然后恢復至鉗制電壓。Ikur激活刺激程序:將電位鉗制在—50 m V，給予100 ms，+40 m V 的預刺激脈沖，失活瞬間外向鉀電流（Ito）。間隔10 ms，再次將電位鉗制在—50 m V，給予300 ms、階躍10 m V、—40～+60 m V 的系列去極化脈沖記錄Ikur。

INa激活和失活曲線擬合:按照電流/電流最大值（I/Imax）＝1—1/{1+exp[（Vx—V1/2）/k]}進行擬合，其中Vx為不同的去極化脈沖電壓，V1/2為通道激活或失活50%時的脈沖電壓，k為斜率因子。

INa失活后恢復曲線擬合:采用I/Imax＝1—exp（-t/τ）進行擬合，式中，t為恢復時間，τ為通道恢復的時間常數。

Ikur激活曲線擬合:按照電流/電流最大值（I/Imax）＝1-1/{1+exp[（Vx-V1/2）/k]}進行擬合，其中Vx為不同的去極化脈沖電壓，V1/2為通道激活50%時的脈沖電壓，k為斜率因子。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism 8進行統(tǒng)計學分析，Origin 2019b進行繪圖，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。計數資料用率表示，采用卡方檢驗。以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 兩組一般情況 造模后48 h，假手術組無死亡，精神良好，總體狀況無明顯變化，但在進行氣管插管操作時2只大鼠出現意外死亡；膿毒癥組精神萎靡，進食減少，被毛蓬松豎立，眼周出現血性分泌物，大便呈稀水樣，48 h后死亡2只。

2.2 兩組心電指標及房顫易感性比較 與假手術組相比，膿毒癥組心率加快[（405.07±9.95）次/分vs（370.13±11.12）次/分，P＜0.05]；P 波時限（PWD）顯著延長[（17.03±0.35）ms vs（14.04±0.46）ms，P＜0.05]，膿毒癥組房顫的誘發(fā)率更高[（66.7%（12/18）vs 33.3%（6/18），P＜0.05]，兩組Burst刺激后典型肢體導聯(lián)和心房外膜心電圖見圖1。

圖1 兩組大鼠Burst刺激后肢體導聯(lián)與心房外膜心電圖典型表現

2.3 兩組心房肌細胞INa的比較 與假手術組比較，膿毒癥組心房肌細胞INa電流密度明顯降低（在—60 m V 時達到峰值，[（—219.76±13.24）p A/p F（n＝6）vs（—74.56±9.49）p A/p F（n＝6），P＜0.01]（見圖2C）。

與假手術組相比，膿毒癥組INa的激活動力學無差異[（V1/2為（—70.52±0.08）m V（n＝6）vs（—56.22±8.85）m V（n＝6），k1/2為[（1.71±0.10）n＝6]vs（1.26±0.32）（n＝6），P均＞0.05]（見圖2D）]。與假手術組比較，膿毒癥組的失活曲線右移，半失活電壓V1/2從[（—99.88±13.24）m V（n＝6）移動到（—74.56±9.49）m V（n＝6），P＜0.01]，k1/2無顯著差異[（7.81±0.39）（n＝6）vs（7.57±0.65）（n＝6），P＞0.05]（見圖2E）。

與假手術組比較，膿毒癥組的INa失活后恢復曲線左移，通道恢復時間從[（16.09±0.97）ms，n＝6]減小到[（9.28±0.82）ms，n＝6]，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）（見圖2F）。

圖2 兩組心房肌細胞INa的比較

2.4 兩組心房肌細胞Ikur的比較 兩組大鼠心房肌細胞Ikur電流密度無顯著差異（在+60 m V 時達到峰值，[（5.38±0.53）m V，n＝6 vs（4.80±0.63）m V，n＝6，P＞0.05]（見圖3C）。與假手術組比較，膿毒癥組Ikur激活曲線左移，半數激活電壓V1/2降低[（31.86±1.01）m V，n＝6 vs（47.06±3.67）m V，n＝6]（P＜0.01），k1/2無顯著差異[（26.16±2.00），n＝6 vs（22.63±1.18），n＝6]（P＞0.05）（見圖3C）。

圖3 兩組心房肌細胞Ikur的比較

3 討論

膿毒癥可對心臟功能及心電生理造成明顯的影響，目前研究膿毒癥心臟損傷常采用盲腸結扎模型和毒血癥模型，但盲腸結扎模型易形成局部膿腫，且實驗過程中人為因素可導致膿毒癥嚴重程度的變化，不易控制。而脂多糖作為革蘭陰性桿菌重要的致病物質，可以有效的激活心肌細胞炎癥通路造成心臟損傷，且通過腹腔注射脂多糖操作簡單，重復性、可控性強，模型標準化程度高[9]，因此筆者采用腹腔注射脂多糖的方式來構建膿毒癥心臟損傷模型。

既往的研究多集中于膿毒癥后心室功能的改變，缺乏對膿毒癥后心房心電生理改變的研究[10—12]。而心房心電改變在心房顫動的發(fā)生和維持中發(fā)揮著至關重要的作用，房顫發(fā)生時主要表現為心房有效不應期的縮短和傳導速度的下降，跨膜離子流的改變是這其中最重要的決定因素。多種機制參與了房顫的發(fā)生，普遍認可的折返學說認為房顫的發(fā)生與持續(xù)與折返環(huán)的數量密切相關，而折返環(huán)的數量又與波長（傳導速度×有效不應期）呈負相關[13]。心房肌細胞INa是動作電位啟動和傳播的基礎，也是決定傳導速度的關鍵因素，在動作電位的0期，鈉離子通道快速打開產生內向的鈉去極化電流（INa），INa的下降會使傳導速度明顯減慢，進而導致折返環(huán)數量的增加，從而導致房顫的發(fā)生和持續(xù)[13—14]。筆者通過研究膿毒癥后心房肌細胞離子通道改變，發(fā)現膿毒癥對大鼠鈉通道激活無明顯影響，但膿毒癥大鼠心房肌細胞INa電流密度明顯低于假手術組，半失活電壓增大，通道關閉后再次恢復開放時間減小，這提示膿毒癥大鼠可能通過降低INa電流密度，減少離子內流，減慢失活，縮短鈉通道恢復時間，減慢傳導速度，進而增加折返環(huán)的數量來參與房顫的發(fā)生和維持。

Ikur只在心房表達，具有快速激活動力學，很少或沒有失活，在動作電位的早期復極化發(fā)揮重要作用[15]。因Ikur電流的心房特異性，其被認為是一個具有抗房顫優(yōu)勢的心房選擇性藥物靶點[16]。有研究表明，Ikur電流的持續(xù)激活可能使心肌細胞適應性的減少Ikur電流密度，易于早期后除極，增加心房對應激誘導的觸發(fā)活動的易感性，增加心房復極離散度，促進各向異性傳導，引發(fā)并維持房顫[17]。本研究結果表明，膿毒癥大鼠Ikur電流密度與假手術組相比無明顯差別，但半數激活電壓顯著降低，提示膿毒癥可能通過促進Ikur電流的激活進而增加房顫的易感性，為膿毒癥后房顫的治療提供了新的方向。

綜上所述，本研究發(fā)現膿毒癥大鼠房顫易感性明顯增加，心房鈉離子電流密度明顯降低，半數失活電壓增大，超快速延遲激活鉀電流半數激活電壓降低，這些心房肌離子通道電流的改變可能通過減慢傳導速度，增加折返環(huán)的數量等參與了膿毒癥大鼠房顫的發(fā)生和維持。此外內毒素釋放、炎癥、自主神經功能障礙、電解質紊亂、機械通氣、藥物的使用和心功能障礙都可能導致膿毒癥后房顫的發(fā)生[18—19]，但具體的機制仍有待進一步的研究，明確其中的相關機制將為膿毒癥房顫患者的預防和治療提供新的理論依據。