張浩寬，郭 盛*，尚爾鑫，張 森，嚴(yán) 輝，錢(qián)大瑋，高 松，李俊科，段金廒*

山茱萸藥材加工過(guò)程廢棄物制備木醋液的化學(xué)成分分析及抑菌活性評(píng)價(jià)

張浩寬1，郭 盛1*，尚爾鑫1，張 森1，嚴(yán) 輝1，錢(qián)大瑋1，高 松2，李俊科2，段金廒1*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心/國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點(diǎn)研究室，江蘇 南京 210023 2.河南宛西制藥股份有限公司，河南 南陽(yáng) 473000

探究不同熱解溫度山茱萸果核木醋液化學(xué)成分及其抑菌活性，篩選出最優(yōu)熱解溫度，為山茱萸果核資源的開(kāi)發(fā)與利用提供理論依據(jù)。采用干餾法（306～600 ℃）制取山茱萸果核木醋液，溫度每升高50 ℃收集1次；采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)對(duì)其進(jìn)行定性定量分析；通過(guò)濾紙片法測(cè)定不同熱解溫度山茱萸果核木醋液對(duì)大腸桿菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果，采用微量肉湯稀釋法對(duì)抑菌活性最優(yōu)熱解溫度木醋液進(jìn)行最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）測(cè)定。共收集到6個(gè)熱解溫度木醋液，通過(guò)GC-MS分析鑒定出62種化合物，對(duì)其中10種相對(duì)含量較高的化合物（乙酸、糠醛、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、正戊酸、愈創(chuàng)木酚、甲基環(huán)戊烯醇酮、2,6-二甲氧基苯酚）進(jìn)行定量分析，結(jié)果10種化合物除糠醛外均以熱解溫度506～556 ℃收集的木醋液樣品（W506～556）中質(zhì)量濃度最高，其中丙酸質(zhì)量濃度高達(dá)45.07 mg/mL；抑菌實(shí)驗(yàn)顯示，W506～556抑菌效果最佳，其對(duì)大腸桿菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC分別為0.781 25%、0.781 25%和1.562 50%。相關(guān)性分析結(jié)果顯示山茱萸果核木醋液的抑菌活性與其有機(jī)酸類(lèi)和酚類(lèi)物質(zhì)的質(zhì)量濃度密切相關(guān)。不同熱解溫度山茱萸果核木醋液化學(xué)組成及含量存在差異，以熱解溫度為506～556 ℃所得木醋液具有較好的抑菌活性；山茱萸果核木醋液可作為其資源利用的新途徑。

山茱萸；山茱萸果核；木醋液；化學(xué)成分分析；抑菌活性；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

山茱萸為山茱萸科山茱萸屬植物山茱萸Sieb.et Zucc的干燥果肉[1]，具有補(bǔ)益肝腎、澀精固脫之功，是我國(guó)中醫(yī)臨床常用中藥。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2019年全國(guó)山茱萸種植面積已超過(guò)2.6萬(wàn)hm2，其年產(chǎn)量以干貨計(jì)約6萬(wàn)t。山茱萸果核是山茱萸產(chǎn)地加工過(guò)程中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物，其重量約占全果的2/3[2]。近年來(lái)，雖有報(bào)道從山茱萸果核中提取淺色栲膠或利用其制備活性炭[3-4]，但并未實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，多數(shù)山茱萸果核的處理方式仍為集中堆放或焚燒處理，不僅是浪費(fèi)資源，也加大了環(huán)境承載壓力。因此，亟需開(kāi)展山茱萸果核潛在價(jià)值挖掘及資源化利用研究。

木醋液又稱(chēng)植物酸，是木材在干餾后導(dǎo)出的蒸汽氣體混合物經(jīng)冷凝分離后得到的一種紅褐色液體，具有醋酸的酸味和煙熏氣味。隨著炭化工業(yè)的發(fā)展，除木材外，其他生物質(zhì)材料，如竹、果殼、果核等也可作為熱解原材料生產(chǎn)相似的木醋液。大量研究表明，木醋液具有較好的抑菌活性[5-7]，已在國(guó)內(nèi)外獲得了廣泛應(yīng)用，并根據(jù)其精制程度的不同用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、食品加工、醫(yī)藥保健等領(lǐng)域[8]。隨著畜禽養(yǎng)殖行業(yè)“禁抗、減抗”政策的出臺(tái)，木醋液作為天然抑菌劑，應(yīng)用前景將更為廣闊，原料需求也將逐年增加。因此，尋找可用于高抑菌活性木醋液制備的新原料已成為相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)，已有棗核、山楂核、山杏殼、杜仲枝等中藥材產(chǎn)地加工過(guò)程產(chǎn)生的副產(chǎn)物用于制備木醋液的研究報(bào)道[9-12]，其中山楂核木醋液更是“紅核婦潔洗液”產(chǎn)品的主要組分。此外，本課題組前期也對(duì)益母草莖葉、黃蜀葵莖葉、甘草藥渣、丹參藥渣等中藥固廢物進(jìn)行了熱解炭化制備木醋液研究[13]。目前，尚未見(jiàn)利用山茱萸果核制備木醋液的相關(guān)研究報(bào)道。

基于此，本研究以山茱萸果核為原料，采用干餾法制取木醋液，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)對(duì)不同熱解溫度所得木醋液的化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定，并評(píng)價(jià)其抑菌活性，以期為山茱萸果核資源的潛在價(jià)值發(fā)現(xiàn)及資源化利用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 材料與試劑

1.1.1 山茱萸果核 山茱萸果核由河南宛西制藥股份有限公司提供。2020年11月采自河南省南陽(yáng)市西峽縣米坪鎮(zhèn)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定為山茱萸科植物山茱萸Sieb.et Zucc的成熟果核，樣品采集后自然風(fēng)干。

1.1.2 供試菌種 大腸桿菌（CICC20658）、痢疾志賀氏菌（CICC23829）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923），購(gòu)于廣東省微生物菌種保藏中心。

1.2 儀器與試劑

HZ01型干餾釜（溧陽(yáng)市海佐機(jī)械制造有限公司），DHG-9023型鼓風(fēng)干燥培養(yǎng)箱（太倉(cāng)市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），UV-5100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司），Quitix125D型電子天平（德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），IS-RDV1型恒溫振蕩器（美國(guó)精騏有限公司），LRH-150型液晶生化培養(yǎng)箱（太倉(cāng)市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），S-B50L型立式壓力蒸汽滅菌器（江蘇省金壇市醫(yī)療器械廠），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），氣相色譜-四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（Clarus SQ 8T，美國(guó)PerkinElmer公司）。

酵母粉（批號(hào)LP0021，英國(guó)OXOID公司），胰蛋白胨（批號(hào)LP0042，英國(guó)OXOID公司），MH肉湯培養(yǎng)基（批號(hào)HB6231，青島海博生物技術(shù)有限公司）；乙酸（批號(hào)H1808008）、丙酸（批號(hào)A1903124）、異丁酸（批號(hào)k1822187）、丁酸（批號(hào)d1917157）、異戊酸（批號(hào)C1919091）、戊酸（批號(hào)g1818016），對(duì)照品均購(gòu)自于Aladdin公司（德國(guó)Darmstadt）；糠醛（批號(hào)DST201201-149）、愈創(chuàng)木酚（批號(hào)DST201125-369）、甲基環(huán)戊烯醇酮（批號(hào)DSTDJ027501）、2,6-二甲氧基苯酚（批號(hào)DST201109-120）對(duì)照品均購(gòu)自于成都德思特生物技術(shù)有限公司；水楊酸甲酯（批號(hào)110707-201614）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；正構(gòu)烷烴混標(biāo)C7～C40（批號(hào)397593）購(gòu)于美國(guó)O2si smart solutions公司。各對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%，醋酸乙酯為分析純，紅核婦潔洗液（批號(hào)200736）購(gòu)于山東步長(zhǎng)神州制藥有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 山茱萸果核木醋液制備與精制

稱(chēng)取795 g山茱萸果核粉末（40目篩）置于密閉式干餾釜中，以5 ℃/min的升溫速率將材料從室溫升至目標(biāo)溫度600 ℃，到達(dá)溫度后保溫30 min。在冷凝裝置中通入冷卻水，冷凝干餾時(shí)產(chǎn)生的氣體，從開(kāi)始餾出液體時(shí)記錄為初始溫度（306 ℃），溫度每升高50 ℃收集1次餾份，共收集到6份餾出液。參照棗核木醋液制備方法[14]，將收集的餾出液放入4 ℃冰箱靜置30 d，木醋液分離為3層，上層為少量油狀物，中層為澄清木醋液，下層為粘稠的木焦油等，采用虹吸法獲取中層的木醋液，加入5%粉末狀活性炭，常溫下恒溫振搖器振搖1 h（300 r/min），靜置3 d，抽濾，得精制山茱萸果核木醋液。不同熱解溫度木醋液產(chǎn)量及精制得率見(jiàn)表1。

表1 不同熱解溫度山茱萸果核木醋液產(chǎn)量及精制得率

由表1可知，山茱萸果核木醋液以高于406 ℃為主要餾出溫度段。精制處理后各熱解溫度木醋液的得率隨熱解溫度的升高而降低，這是由于隨著溫度的升高，木醋液中木焦油的含量也越高，經(jīng)過(guò)精制后，木焦油被除去，故得率降低。因熱解溫度306～356 ℃所得木醋液（W306～356）產(chǎn)量較低，難以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，故將其與熱解溫度356～406 ℃所得木醋液（W356～406）合并。

2.2 山茱萸果核木醋液組成成分分析

2.2.1 GC-MS定性分析條件 色譜條件：色譜柱為DB-FFAP毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），進(jìn)樣口溫度為250 ℃，進(jìn)樣量為0.5 μL，采用分流進(jìn)樣，分流比為30∶1，氦氣作為載氣，體積流量1.00 mL/min；柱溫60 ℃，恒溫3 min后，以5 ℃/ min的速率升溫至240 ℃，恒溫10 min。

質(zhì)譜條件：EI源，電子能量70 eV，離子源溫度150 ℃，傳輸線溫度200 ℃，質(zhì)量掃描范圍為/35～400，溶劑延遲2 min。質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)：NIST17。

2.2.2 保留指數(shù)（retention index，RI）的測(cè)定 取正構(gòu)烷烴混合對(duì)照品（C7～C40）0.1 mL溶于1 mL醋酸乙酯，取適量備用，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄保留時(shí)間，運(yùn)用單一線性升溫公式（1）計(jì)算各待測(cè)化合物的RI[15]。

RI＝100＋100[r()－r()]/[r(＋1)－r()] （1）

r代表保留時(shí)間，表示待分析化合物，和＋1分別表示正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)。且r()＜r()＜r(＋1)

2.2.3 樣品溶液制備及分析測(cè)定 分別精密量取各精制木醋液1 mL置于5 mL具塞玻璃試管中，精密加入2 mL醋酸乙酯振搖萃取，4 ℃靜置過(guò)夜，取上層醋酸乙酯萃取液，按上述試驗(yàn)方法和條件進(jìn)行GC-MS分析，獲得不同熱解溫度山茱萸果核木醋液GC-MS總離子流圖（圖1）。

按上述GC-MS條件測(cè)定，5個(gè)熱解溫度山茱萸果核木醋液揮發(fā)性成分的總離子流圖如圖1所示，除W306～406所檢測(cè)到成分較少外，其余熱解溫度木醋液所含成分較為相似，但其相對(duì)含量有所差異。所有色譜峰信息依據(jù)NIST17標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索和人工解析，從匹配度、質(zhì)譜圖相似度等方面比較，計(jì)算待測(cè)組分的RI，與NIST Chemistry WebBook數(shù)據(jù)庫(kù)中保留指數(shù)文獻(xiàn)值（RI*）對(duì)比進(jìn)行定性，確定物質(zhì)種類(lèi)，并根據(jù)峰面積歸一化法確定物質(zhì)的相對(duì)含量，結(jié)果見(jiàn)表2。在5個(gè)熱解溫度所得木醋液樣品中分別鑒定出22、47、57、62、60種組分。其中共有組分主要為有機(jī)酸類(lèi)、酚類(lèi)、醛類(lèi)和酮類(lèi)，有機(jī)酸類(lèi)主要包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、正戊酸等；酚類(lèi)主要包括愈創(chuàng)木酚、苯酚等；醛類(lèi)主要包括糠醛和5-羥甲基糠醛等；酮類(lèi)主要包括乙酰氧基-2-丙酮、2,5-己二酮等。采用面積歸一化法計(jì)算由低至高5個(gè)不同熱解溫度木醋液中共有組分相對(duì)含量，結(jié)果顯示，總有機(jī)酸相對(duì)含量分別為24.09%、51.18%、54.82%、66.82%和67.04%；總?cè)╊?lèi)相對(duì)含量分別為65.38%、24.41%、12.11%、5.33%和3.26%；總酚類(lèi)相對(duì)含量分別為1.69%、3.82%、5.75%、5.28%和7.37%。總酮類(lèi)相對(duì)含量分別為6.16%、5.59%、4.84%、3.84%和4.18%。此外尚有少量的醇類(lèi)、酯類(lèi)、烷類(lèi)和含氮類(lèi)化合物。

圖1 不同熱解溫度山茱萸果核木醋液GC-MS總離子流圖

2.3 主要成分的含量測(cè)定

通過(guò)GC-MS分析W506～556鑒定出62種化合物，根據(jù)峰面積篩選出相對(duì)含量較高的前10種化合物乙酸、糠醛、丙酸、異丁酸、正丁酸、異戊酸、正戊酸、愈創(chuàng)木酚、甲基環(huán)戊烯醇酮、2,6-二甲氧基苯酚，以該10種成分作為主要成分對(duì)不同解熱溫度山茱萸果核木醋液進(jìn)行定量分析。

表2 山茱萸果核木醋液GC-MS成分鑒定及相對(duì)含量分析結(jié)果

續(xù)表2

“—”表示無(wú)或未檢測(cè)到 A-W306～406B-W406～456C-W456～506D-W506～556E-W556～600

“—”indicates none or not detected A-W306—406B-W406—456C-W456—506D-W506—556E-W556—600

2.3.1 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密取水楊酸甲酯20.80 mg，置于10 mL量瓶中，加醋酸乙酯溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密量取各精制木醋液1 mL置于5 mL具塞玻璃試管中，精密加入2 mL醋酸乙酯振搖萃取，4 ℃靜置過(guò)夜，取上層醋酸乙酯萃取液，即得供試品溶液。

2.3.3 對(duì)照品儲(chǔ)備液制備 取適量對(duì)照品，精密稱(chēng)定，置于10 mL量瓶中，加醋酸乙酯溶解并稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度分別為乙酸54.29 mg/mL、丙酸46.27 mg/mL、異丁酸54.87 mg/mL、丁酸50.38 mg/mL、正戊酸42.02 mg/mL、異戊酸41.36 mg/mL、糠醛25.81 mg/mL、愈創(chuàng)木酚4.65 mg/mL、甲基環(huán)戊烯醇酮8.47 mg/mL和2,6-二甲氧基苯酚4.54 mg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。繼以醋酸乙酯分別等比稀釋2、4、8、16、32、64、128倍，即得不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密量取適量混合對(duì)照品溶液，置于10 mL量瓶中，分別精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，再加醋酸乙酯稀釋至刻度，搖勻。以各待測(cè)化合物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)（），各待測(cè)化合物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。各化合物線性關(guān)系考察，結(jié)果見(jiàn)表3。各化合物2在0.992 3～0.999 3，表明線性良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取“2.3.3”項(xiàng)下方法制備的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按照“2.2.1”項(xiàng)下及表3中定量離子條件測(cè)定，結(jié)果表明，10種待測(cè)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)RSD值均小于1.48%，說(shuō)明儀器的精密度良好。

表3 線性關(guān)系和加樣回收率考察結(jié)果

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜、質(zhì)譜條件分別進(jìn)樣，結(jié)果表明，按表3中定量離子進(jìn)行分析，10種待測(cè)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值均小于1.36%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，依據(jù)“2.2.2”項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜條件在0、1、2、4、6、8 h取樣測(cè)定，結(jié)果表明，10種待測(cè)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值均小于1.78%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定的木醋液樣品，分別加入適量對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各被測(cè)成分的加樣回收率和RSD值，結(jié)果見(jiàn)表3，10種對(duì)照品的平均回收率在97.39%～102.13%，RSD值均小于2.14%，表明方法的準(zhǔn)確性較好。

2.4.6 樣品含量測(cè)定 取各解熱溫度木醋液3份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取100 μL供試品溶液加入100 μL內(nèi)標(biāo)溶液，混勻，按上述實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量為0.5 μL，分流比為30∶1。混合對(duì)照品及樣品的GC-MS總離子流圖見(jiàn)圖2。記錄峰面積，以各化合物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算樣品質(zhì)量濃度，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，除糠醛外，其余9種成分質(zhì)量濃度均隨熱解溫度的升高呈先升高后降低的趨勢(shì)，而糠醛質(zhì)量濃度隨溫度升高呈降低趨勢(shì)。9種成分均在W506～556中達(dá)到最高，6種有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)總質(zhì)量濃度為209.14 mg/mL，約占該木醋液樣品總質(zhì)量的20%，其中丙酸質(zhì)量濃度最高，達(dá)45.07 mg/mL。

1-乙酸 2-糠醛 3-丙酸 4-異丁酸 5-丁酸 6-異戊酸 7-正戊酸 8-水楊酸甲酯（內(nèi)標(biāo)） 9-甲基環(huán)戊烯醇酮 10-愈創(chuàng)木酚 11-2,6-二甲氧基苯酚

2.5 抑菌活性及相關(guān)性分析

2.5.1 抑菌圈直徑的測(cè)定 采用濾紙片法測(cè)定不同熱解溫度所得山茱萸核木醋液對(duì)大腸桿菌、痢疾桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑。分別用接種環(huán)刮取已活化好的大腸桿菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌單菌落，接種于Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基中，于37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，通過(guò)測(cè)量吸光度（A）值，用無(wú)菌水制成含菌數(shù)為1×106CFU/mL的菌懸液。LB固體培養(yǎng)基滅菌后傾倒在直徑90 mm的培養(yǎng)皿中，吸取配制好的菌懸液100 μL，加入LB固體培養(yǎng)基中，用涂布棒將菌液涂布均勻。取高壓滅菌后直徑6 mm的空白藥敏紙片，分別加入20 μL各熱解溫度木醋液原液，空白對(duì)照組加入20 μL無(wú)菌水，陽(yáng)性藥組加入20 μL紅核婦潔洗液。將加好木醋液的藥敏紙片貼于已涂菌的培養(yǎng)基表面，各熱解溫度木醋液均設(shè)3個(gè)重復(fù)。將細(xì)菌平板倒置于37 ℃生化培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h，十字交叉法測(cè)量其抑菌圈直徑，參照藥物敏感試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)（表5），判斷不同解熱溫度山茱萸果核木醋液抑菌活性強(qiáng)弱。結(jié)果見(jiàn)表6。

表4 不同溫度山茱萸果核木醋液主要化學(xué)成分質(zhì)量濃度

“—”表示未檢測(cè)到

“—”indicates no detection

由表5、6可知，406～600 ℃的木醋液對(duì)供試菌種均有一定的抑制效果，敏感度在中敏到高敏之間，3種供試菌對(duì)于有效木醋液的敏感順序?yàn)椋毫〖矖U菌＞大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌；不同解熱溫度山茱萸果核木醋液對(duì)于供試菌種的抑制效果強(qiáng)弱順序?yàn)閃506～556＞W(wǎng)456～506＞W(wǎng)556～600＞W(wǎng)406～456。對(duì)于大腸桿菌和痢疾桿菌，W506～556的抑菌效果與其他解熱溫度木醋液和紅核婦潔洗液組均具有極顯著性差異，對(duì)于金黃色葡萄球菌，W506～556的抑菌效果與W556～600和W406～456組具有極顯著性差異。此外，W456～506與W506～556的產(chǎn)量都很大，并且兩者對(duì)于供試菌的抑制效果相近，提示在以后的工業(yè)生產(chǎn)中可將2段合并利用。山茱萸果核木醋液整體上對(duì)革蘭陰性菌的抑制效果優(yōu)于革蘭陽(yáng)性菌，對(duì)痢疾桿菌的抑制作用最強(qiáng)。

2.5.2 最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測(cè)定 參照美國(guó)臨床標(biāo)準(zhǔn)協(xié)

表5 藥物敏感試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)

會(huì)（CLSI）M07-A9微量肉湯稀釋法[16]，選取抑菌效果最明顯的W506～556進(jìn)行MIC的測(cè)定。在超凈工作臺(tái)中吸取100 μL MH依次加入滅菌96孔板的第1、2、3行木醋液組的2～12列中，第4、5、6行陽(yáng)性藥組的2～12列中，第7、8行空白對(duì)照組的1～12列中；吸取木醋液100 μL加入第1、2、3行的第1列孔中，混合均勻后吸取100 μL加入到第1、2、3行的第2列孔中，混合均勻后再吸取100 μL到各行第3孔，依次進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)詈笪?00 μL制備好的菌懸液加入96孔板中，混合均勻，使木醋液濃度為25%～0.048 83%。陽(yáng)性對(duì)照組、空白對(duì)照組同上。置于37 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用肉眼觀察可100%抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的濃度為MIC。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以紅核婦潔洗液作為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌水作為空白對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)表7。W506～556對(duì)大腸桿菌和痢疾桿菌的MIC為0.781 25%，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為1.562 50%。

表6 抑菌圈測(cè)量結(jié)果()

Table 6 Measurement result of bacteriostatic zone ()

表6 抑菌圈測(cè)量結(jié)果()

組別抑菌圈直徑/mm大腸桿菌痢疾桿菌金黃色葡萄球菌 W306～406——— W406～45611.60±0.97c12.23±0.75d10.82±0.46b W456～50614.93±0.82b17.10±0.54b14.48±0.91a W506～55616.83±0.75a18.80±0.65a14.87±1.62a W556～60011.93±1.02c12.90±1.16d11.73±1.51b 紅核婦潔洗液12.63±1.27c15.75±0.92c13.75±1.56a 空白———

—表示無(wú)抑菌效果；同列間標(biāo)不同字母表示具有極顯著性差異（＜0.01）

—means no bacteriostatic effect; Different letters in the same column indicate extremely significant differences (< 0.01)

2.5.3 相關(guān)性分析 選取不同熱解溫度木醋液相對(duì)含量較高的10種成分（正戊酸、丁酸、異戊酸、乙酸、丙酸、異丁酸、糠醛、愈創(chuàng)木酚、2,6-二甲氧基苯酚、甲基環(huán)戊烯醇酮），采用SPSS 22.0軟件，以抑菌圈直徑為自變量（），成分含量為因變量（）進(jìn)行相關(guān)分析，建立10個(gè)成分質(zhì)量濃度與其藥效學(xué)的Pearson相關(guān)系數(shù)，見(jiàn)表8。

表8顯示，山茱萸果核木醋液抑菌效果與糠醛質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)，與其他9種成分呈正相關(guān)。3種供試菌的抑菌圈直徑與所測(cè)10種成分質(zhì)量濃度的相關(guān)性均為強(qiáng)相關(guān)，6種酸類(lèi)成分中異戊酸相關(guān)性最高，酚類(lèi)中愈創(chuàng)木酚相關(guān)性最高，這提示山茱萸果核木醋液的抑菌活性與其酸類(lèi)和酚類(lèi)物質(zhì)協(xié)同作用密切相關(guān)。

表7 MIC測(cè)量結(jié)果

表8 主要化學(xué)成分質(zhì)量濃度與抑菌強(qiáng)度Pearson相關(guān)系數(shù)

3 討論

隨著畜禽養(yǎng)殖行業(yè)“禁抗、減抗”政策的出臺(tái)，市場(chǎng)對(duì)于天然抑菌劑的需求顯著增加。木醋液因其抑菌作用明確，已廣泛用于天然抑菌劑的開(kāi)發(fā)。本課題組前期基于文獻(xiàn)報(bào)道及課題組研究實(shí)踐，提出了基于熱解炭化技術(shù)的中藥資源固廢物生物炭及木醋液資源化利用策略[13]。中藥山茱萸作為我國(guó)大宗藥材之一，其采收加工過(guò)程中產(chǎn)生大量的果核資源如何資源化利用已成為山茱萸產(chǎn)業(yè)亟待解決的問(wèn)題。為充分利用山茱萸果核資源，減少藥材生產(chǎn)過(guò)程中的浪費(fèi)和排放，本研究采用熱解炭化技術(shù)制備了山茱萸果核木醋液，考察了不同熱解溫度山茱萸果核木醋液的組成成分及質(zhì)量濃度，并對(duì)其針對(duì)大腸桿菌、痢疾桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示山茱萸果核木醋液具有良好的抑菌活性，提示其可作為開(kāi)發(fā)利用山茱萸果核資源的一種途徑。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)木醋液發(fā)揮抑菌活性的化學(xué)組成進(jìn)行了研究，但研究結(jié)果尚不一致。有研究表明，木醋液有機(jī)酸的含量與其抑菌活性直接相關(guān)[5-6]；也有研究表明木醋液中酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)其抑菌活性起決定性作用[17-18]。為明確山茱萸木醋液中發(fā)揮抑菌活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究選取抑菌效果較好的W506～556對(duì)其主要活性組分進(jìn)行了分析，其醋酸乙酯萃取液中共鑒定出62種化合物，面積歸一化法計(jì)算其相對(duì)含量較高的為有機(jī)酸類(lèi)，占66.98%，其次為酚類(lèi)、醛類(lèi)和酮類(lèi)等成分。有研究在棗核木醋液中鑒定出35種化合物[9]，在杜仲枝木醋液中鑒定出33種化合物[12]，對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)各類(lèi)木醋液中所含化合物類(lèi)型基本相似，主要為有機(jī)酸類(lèi)、酚類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)、醇類(lèi)和酯類(lèi)等，僅為具體占比有所差異，其可能與熱解原材料、熱解工藝及精制方法等不同有關(guān)。此外，采用外標(biāo)法對(duì)山茱萸果核木醋液的10種主要成分進(jìn)行了含量測(cè)定，10種成分中除糠醛外均在W506～556中質(zhì)量濃度達(dá)到最高，W506～556中有機(jī)酸含量可達(dá)20%以上。通過(guò)將不同解熱溫度木醋液樣品10種主要組質(zhì)量濃度與其抑菌活性進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑菌效果與有機(jī)酸質(zhì)量濃度整體呈正相關(guān)，而與糠醛質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)。也有研究報(bào)道，糠醛可用于農(nóng)藥的生產(chǎn)，具有殺蟲(chóng)殺螨的作用，但糠醛有劇毒，也被世界衛(wèi)生組織列入3類(lèi)致癌物清單中。上述結(jié)果提示，相較于其他熱解溫度所得木醋液，W506～556在具有良好抑菌活性的同時(shí)安全性也更高。

綜上所述，山茱萸果核木醋液作為天然抑菌劑具有較好的應(yīng)用潛力。本研究結(jié)果為山茱萸果核木醋液作為抑菌劑開(kāi)發(fā)提供了理論基礎(chǔ)，也為山茱萸果核的資源化利用提供了新的途徑。此外，在制備山茱萸果核木醋液的同時(shí)也形成了生物炭，其在土壤改良、環(huán)境污染治理等方面有著廣闊的應(yīng)用前景，倘若將其用于山茱萸種植產(chǎn)業(yè)，不僅會(huì)提升山茱萸果核資源利用效率，也有助于構(gòu)建山茱萸資源循環(huán)經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)鏈，促進(jìn)山茱萸產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Chemical constituent analysis and antibacterial activity evaluation of wood vinegar prepared from waste produced in the processing of

ZHANG Hao-kuan1, GUO Sheng1,SHANG Er-xin1, ZHANG Sen1, YAN Hui1, QIAN Da-wei1, GAO Song2, LI Jun-ke2, DUAN Jin-ao1

1.Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization/ National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine/ Key Laboratory of Chinese Medicinal Resources Recycling Utilization of National Administration of Traditional Chinese Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2.Henan Wanxi Pharmaceutical Co., Ltd., Nanyang 473000, China

The chemical compositions and antibacterial activities of the wood vinegar offruit core with different pyrolysis temperatures were evaluated, and the optimal pyrolysis temperature was screen out, so as to provide theoretical basis for the development and utilization offruit core resources.The dry distillation method (306—600 ℃) was used to prepare wood vinegar fromfruit core, and the vinegar samples were collected every time the temperature rises by 50 ℃.Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) was used for qualitative and quantitative analysis their compositions.The inhibition effect offruits core wood vinegar on,andwas determined by filter paper method.The minimum inhibitory concentration (MIC) of wood vinegar obtained with optimal temperature was determined by broth dilution method.A total of 62 compounds in the wood vinegar were identified by GC-MS analysis.Among them, 10 compounds (acetic acid, furfural, propionic acid, isobutyric acid, n-butyric acid, isovaleric acid, n-valeric acid, guaiacol, cyclotene, 2,6-dimethoxyphenol) with relatively high content were quantitatively analyzed.The results showed that the contents of 10 compounds except furfural were the highest in wood vinegar (W506—556) collected at 506—556 ℃, and the content of propionic acid was up to 45.07 mg/mL; The results of bacteriostatic test showed that W506—556had the best bacteriostatic effect on,and, and the MICs were 0.781 25%, 0.781 25% and 1.562 50%, respectively.Correlation analysis showed that the antibacterial activity offruitcore wood vinegar was closely related to the contents of organic acids and phenols.There were differences in chemical composition and content offruitcore wood vinegar pyrolyzed at different temperatures.The wood vinegar obtained at 506—556 ℃ had better antibacterial activity.The wood vinegar can be used as a new way of resource utilization for.

;fruit core; wood vinegar; chemical constituents; content determination antimicrobial activity; GC-MS

R284.1

A

0253 - 2670(2022)05 - 1372 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.05.012

2021-10-25

中央本級(jí)重大增減支項(xiàng)目（2060302）；國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)及人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（ZYYCXTD-D-202005）；江蘇省“六大人才高峰”項(xiàng)目（YY-026）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-21）

張浩寬（1994—），男，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂Y源與鑒定。E- mail: zhk18795862381@163.com

通信作者：郭 盛，男，副研究員，主要從事中藥資源化學(xué)與資源循環(huán)利用研究。E-mail: guosheng@njucm.edu.cn

段金廒，男，教授，主要從事中藥資源化學(xué)與資源循環(huán)利用研究。E-mail: dja@njucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 王文倩]