陳 燕， 郭 聰， 王 瑩， 李玉娟

(江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇南通 226541)

杜梨(Bunge)隸屬于薔薇科梨屬，原產(chǎn)于我國，耐寒耐旱，是常用的梨砧木。杜梨的枝葉、樹皮、根和果實均有藥效，能消食止痢，潤肺止咳。杜梨作為我國本土樹種，耐鹽堿性強，具有林用、觀賞、果用等許多優(yōu)良特性，是一個值得深度開發(fā)的樹種。將杜梨種植在難以治理的鹽堿化等地區(qū)進(jìn)行綠化，可以緩解環(huán)境污染、水土流失，擴(kuò)大綠化面積，提高觀賞性和生態(tài)效益。近年來，江蘇省極力推進(jìn)沿海大開發(fā)，沿海灘涂綠化與生態(tài)保護(hù)建設(shè)方興未艾。

國內(nèi)外對杜梨的生物學(xué)研究多集中于耐鹽、耐旱的分子機(jī)制上，與葉色相關(guān)的研究只有馬春暉等報道過，即以我國梨屬主要植物種(杜梨、豆梨、西洋梨)以及近緣屬植物榅桲為試材，通過植物葉片色澤和類別進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)它們之間存在一定的相關(guān)性。然而，尚未見關(guān)于其葉片轉(zhuǎn)錄組測序方面的研究報道。

RAN-Seq測序技術(shù)能夠分析植物整體轉(zhuǎn)錄活動，是研究彩葉植物呈色機(jī)制的重要方法。郭聰?shù)劝l(fā)現(xiàn)了7個轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控花青素生物合成途徑來改變美國紅楓葉色。Gang等通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)黃綠葉突變體樺樹中光合作用天線蛋白代表最重要的富集途徑，其表達(dá)水平對葉片顏色的形成至關(guān)重要。褚江濤對三角楓新品種齊魯金葉片進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，共鑒定出75個差異表達(dá)基因，并通過轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測，篩選出180個下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子基因。陸小雨等對紅花槭特殊單株不同色葉進(jìn)行代謝組和轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)秋季花青素苷通路中大量基因的表達(dá)量上調(diào)是紅花槭葉片變色的主要驅(qū)動因子。申建雙研究了金葉連翹葉片的呈色機(jī)制，對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，與金葉連翹葉色形成及響應(yīng)光照度有關(guān)的基因45個、轉(zhuǎn)錄因子23個。其中，15個基因表達(dá)不受光照度影響，30個基因和23個轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)均受光照度的影響。最終篩選出6個基因和1個轉(zhuǎn)錄因子在黃葉型連翹中顯著低表達(dá)或不表達(dá)，為連翹葉色變黃及響應(yīng)不同光照度的關(guān)鍵候選基因。

綜上，轉(zhuǎn)錄組測序已廣泛應(yīng)用于植物葉片呈色機(jī)制的分子研究中，但目前還未見杜梨葉色轉(zhuǎn)錄組測序分析相關(guān)的報道。本研究以轉(zhuǎn)色期杜梨青葉、花葉、紅葉為試驗材料，分析比較基因表達(dá)差異，以期開發(fā)出可用于耐鹽地開發(fā)，集綠化、林用等多功能的紅葉杜梨園林植物新品種(系)，做到春天觀花、夏天觀果、秋后賞紅葉，為城市美化與江蘇沿海地區(qū)大開發(fā)生態(tài)環(huán)境建設(shè)作出貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2019年11月下旬于江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所杜梨培育基地采集杜梨單株上不同分枝的紅葉、花葉、青葉為試驗材料(圖1)，每組葉片分別取3次重復(fù)，編號見表1；將葉片用錫箔紙包裹好后，迅速置于液氮中。

杜梨高通量測序和分析由北京百邁克生物科技有限公司負(fù)責(zé)進(jìn)行。

1.2 試驗方法

1.2.1 杜梨總RAN提取及質(zhì)量檢測 采用試劑盒法提取RNA并采用超微量分光光度計對樣品RNA質(zhì)量、濃度、完整性進(jìn)行檢測。杜梨葉片的總 RNA 的提取是采用試劑盒NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific，美國)。RNA 樣品的完整性是通過 NanoDrop6000 (AgilentTechnologies，美國)進(jìn)行檢測。

1.2.2 cDNA文庫構(gòu)建 以合格的mRNA為模板，通過六堿基隨機(jī)引物、AMPure XP beads核酸純化試劑盒和 PCR 富集等相關(guān)工具和技術(shù)獲得 cDNA 文庫。

1.2.3 文庫質(zhì)控及測序 使用Q-PCR方法對cDNA文庫的有效濃度(文庫有效濃度>2nmol/L)進(jìn)行準(zhǔn)確定量；庫檢合格后，用Illumina平臺進(jìn)行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜梨轉(zhuǎn)錄組測序與組裝

對9個樣品的轉(zhuǎn)錄組測序和分析，共獲得67.78 Gb測序數(shù)據(jù)，各樣品總堿基數(shù)均達(dá)到6.79 Gb，測序數(shù)據(jù)質(zhì)量大于或等于30的堿基所占的百分比(Q30)在91.73%及以上，GC含量百分比均在46.22%及以上(表1)，可用于下一步組裝。利用StringTie軟件對比對到參考基因組上的片段(mapped reads)進(jìn)行拼接組裝，共得到60 611個基因，并與原有的基因組注釋信息進(jìn)行比較，經(jīng)篩選共發(fā)掘出1 059個新基因。

表1 杜梨樣品測序數(shù)據(jù)評估

2.2 差異表達(dá)分析

皮爾遜相關(guān)系數(shù)(Pearson’s correlation coefficient，)是評估生物學(xué)重復(fù)相關(guān)性的重要指標(biāo)，越接近1，說明相關(guān)性越強。從圖2可以看出，CK1、CK2、CK3，B1、B2、B3，H1、H2、H3之間的均大于0.900，表明樣本間相關(guān)性強，所有樣本數(shù)據(jù)均可用于后續(xù)分析。

將(fold change，差異倍數(shù))≥2且(false discovery rate，錯誤發(fā)現(xiàn)率)<0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，對杜梨3組不同顏色葉片的差異表達(dá)基因進(jìn)行對比分析。從表2、圖3可以看出， 青葉和花葉共有57個DEGs表達(dá)量發(fā)生變化，其中15個DEGs上調(diào)，42個DEGs下調(diào)；青葉和紅葉共有2 084個DEGs表達(dá)量發(fā)生變化，其中1 447個DEGs上調(diào)，637個DEGs下調(diào)；紅葉和花葉對比下，共有1 795個DEGs表達(dá)量發(fā)生變化，其中568個DEGs上調(diào)，1 227個DEGs下調(diào)。

表2 杜梨差異表達(dá)基因數(shù)量統(tǒng)計

將每組差異基因進(jìn)行比對，通過韋恩圖來了解差異基因在每組中的分布情況(圖4)，青葉與花葉、青葉與紅葉之間共有20個差異表達(dá)基因；紅葉與青葉、花葉之間共有1 258個差異表達(dá)基因，花葉與青葉、紅葉之間共有20個差異表達(dá)基因，三者共有9個差異表達(dá)基因。

2.3 基因功能注釋

將全部基因序列與COG(clusters of orthologous groups，直系同源群)、GO(gene ontology，基因本體)、KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes，京都基因與基因組百科全書)、KOG(eukaryotic orthologous groups，真核生物同源組)、Pfam(protein family，蛋白家族)、Swiss-Prot(manually annotated and reviewed protein sequence database)、eggNOG(evolutionary genealogy of genes：non-supervised orthologous groups)、NR(non-redundant，非冗余數(shù)據(jù)庫)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(表3)發(fā)現(xiàn)，共57 669個基因得到功能注釋，注釋率為95.15%。其中，序列長度在≥300～1 000 bp之間的基因占總注釋基因的37.91%(21 862/57 669)，序列長度≥1 000 bp的占59.71%(34 436/57 669)。對差異表達(dá)基因功能注釋進(jìn)行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)青葉與花葉、青葉與紅葉、花葉與紅葉分別有56、2 064、1 769個差異表達(dá)基因被注釋，分別占98.25%(56/57)、99.04%(2 064/2 084)、98.55%(1 769/1 795)，均超過98%(表4)，表明差異表達(dá)基因的高注釋率可能為杜梨色葉研究和新品種選育提供了理論基礎(chǔ)。

表3 unigene功能注釋統(tǒng)計

表4 差異表達(dá)基因功能注釋統(tǒng)計

2.4 差異表達(dá)基因GO分類和功能富集

將杜梨全部基因序列與GO 數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)30 403個基因得到了功能注釋，其中差異表達(dá)基因得到功能注釋數(shù)最多的為青葉與紅葉，共1 394個；注釋率最高的為青葉與花葉，為76.79%(表5)。注釋的基因涉及49個功能組，主要集中在膜(細(xì)胞組分)、催化活性(分子功能)、代謝過程(生物學(xué)過程)等(圖5)。通過GO分類，把杜梨基因按照功能進(jìn)行分類，為杜梨抗逆性等研究提供了依據(jù)。

表5 GO數(shù)據(jù)庫三大功能主類DEG數(shù)

2.5 差異表達(dá)基因KEGG注釋和富集分析

通過KEGG數(shù)據(jù)庫比對，共有16 594個杜梨基因得到注釋。其中，青葉和花葉有11個DEGs可以分配到16個KEGG通路中，6個差異表達(dá)基因呈上調(diào)趨勢，5個基因呈下調(diào)趨勢，顯著富集在碳代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、植物-病原體相互作用以及倍半萜和三萜生物合成中；青葉和紅葉共有383個差異表達(dá)基因得到注釋信息，分配到105個KEGG通路中，其中262個差異表達(dá)基因呈上調(diào)趨勢，121呈下調(diào)趨勢，顯著富集在植物-病原體相互作用、碳代謝等通路中；紅葉和花葉共有318個差異表達(dá)基因得到注釋信息，分配到106個KEGG通路中，其中119個差異表達(dá)基因呈上調(diào)趨勢，199個呈下調(diào)趨勢，顯著富集在植物-病原體相互作用、碳代謝等通路中(圖6、圖7)。綜上，碳代謝、植物-病原體相互作用一直是杜梨葉片轉(zhuǎn)色過程中排名前三的代謝通路，可能參與杜梨葉片轉(zhuǎn)色。

2.6 與葉色相關(guān)基因分析

類黃酮是植物中通過苯丙烷途徑合成的次生代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)生3種主要化合物：黃酮醇，原花青素和花青素，與葉色息息相關(guān)。在杜梨葉片轉(zhuǎn)色期間，從紅葉、花葉、青葉等3種不同葉色的葉片中篩選出10個與類黃酮相關(guān)的基因，分別屬于UDPGT(Chr2.g42475、Chr11.g09871、Chr11.g10237、Chr14.g49947、Chr15.g03978)、NAD dependent epimerase/dehydratase family(Chr5.g05869)、2OG-Fe(Ⅱ) oxygenase superfamily(Chr5.g09527)、ABC transporters(Chr12.g36590)、Transferase(Chr17.g27158)、Chalcone(Scaffold29.g59180)等6個基因家族，主要通過類黃酮的生物合成過程、花青素還原酶活性調(diào)節(jié)、黃酮醇合酶活性調(diào)節(jié)、花青素在紫外線下于組織中積累、黃酮類生物合成過程等機(jī)制對杜梨葉色進(jìn)行調(diào)控(表6)。

表6 與葉色相關(guān)差異表達(dá)候選基因及GO注釋

為了探索這10個基因在杜梨葉片轉(zhuǎn)色期間的表達(dá)模式，本研究對這10個基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果(圖8)發(fā)現(xiàn)，每個基因都呈現(xiàn)出不同的表達(dá)水平，大部分轉(zhuǎn)錄因子在紅葉中的表達(dá)量大于在青葉和花葉中的表達(dá)量。

2.7 SNP分析

本研究對所篩選出的SNP位點數(shù)目、轉(zhuǎn)換類型比例、顛換類型比例進(jìn)行統(tǒng)計分析，從表7可以看出，共篩選出452 501個SNP位點，發(fā)生頻率為1/411。其中，堿基轉(zhuǎn)換位點共277 789個，占SNP總數(shù)61.39%；堿基顛換位點共174 712個，占38.61%。所有的變異類型中，轉(zhuǎn)換類型遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于顛換類型，本研究結(jié)果極大地豐富了杜梨SNP位點信息，為今后杜梨種質(zhì)資源篩選、新品種選育等研究提供了理論基礎(chǔ)。

表7 SNP類型分析

3 討論與結(jié)論

近年來，RNA-Seq、Chip-Seq等新一代技術(shù)取得了前所未有的發(fā)展，已經(jīng)通過轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組等不同層面和角度對植物呈色機(jī)制進(jìn)行深度解析，為彩葉植物新品種培育等研究奠定了基礎(chǔ)。其中，紫薇、美國紅楓、銀杏、花葉矢竹、墨蘭、鳳香果等彩葉植物已進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序。本研究對杜梨葉片(青葉、花葉、紅葉)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，共獲得了67.78GB總堿基，Q30堿基比例均大于91.73%。通過組裝得到60 611個基因，包括1 059個新基因，為今后杜梨葉片呈色機(jī)制的研究、相關(guān)基因的挖掘以及新品種的選育提供了理論基礎(chǔ)。

相關(guān)研究表明，同一個轉(zhuǎn)錄分析中unigene的序列越長，匹配率越高。本研究共發(fā)現(xiàn)57 669個基因得到功能注釋(注釋效率為95.15%)，其中有21 862個已注釋基因的序列長度在≥300～1 000 bp 之間，34 436個已注釋基因序列長度≥1 000 bp，與前者研究相似。類黃酮物質(zhì)在植物葉片變色期起到重要的作用，其包含的一類物質(zhì)——花色苷是植物葉片呈色的主要因素，其中UDPGT家族在花色苷合成途徑中起重要的作用。本研究共篩選出10個與類黃酮相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，其中屬于UDPGT家族的共有5個轉(zhuǎn)錄因子，推測這5個UDPGT轉(zhuǎn)錄因子可能與郭聰?shù)仍诿绹t楓轉(zhuǎn)錄組中和王瑩等在紫薇轉(zhuǎn)錄組中篩選的UDPGT轉(zhuǎn)錄因子具有同源性，在杜梨葉片變色期起到重要的作用。另外，在杜梨轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)Chr5.g09527在3種葉片中的表達(dá)量顯著高于其他的轉(zhuǎn)錄因子，但在杜梨葉片轉(zhuǎn)色期的作用還需進(jìn)一步分析。

SNP分子標(biāo)記在品種鑒定、功能基因定位等方面具有重要的作用。本研究從杜梨葉片轉(zhuǎn)錄組中共搜索到452 501個SNP位點，發(fā)生頻率為1/411，低于水稻(1/89)、玉米(1/61)等模式植物以及梨(1/344)、蘋果(1/288)、葡萄(1/64)、火龍果(1/204)等果樹，可能與基因組測序深度深、物種間的遺傳背景差異大有關(guān)，也可能與SNP檢測方法有關(guān)。另外，在杜梨葉片轉(zhuǎn)錄組中的所有SNP變異類型中，堿基轉(zhuǎn)換類型(61.39%)高于顛換類型(38.61%)，這與梨(31.50%、31.66%)等大多數(shù)植物研究結(jié)果相似。堿基轉(zhuǎn)換類型比例高可能與甲基化等原因相關(guān)。

本研究對杜梨轉(zhuǎn)色期葉片進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序和分析，共獲得了67.78 Gb測序數(shù)據(jù)，通過組裝共獲得60 611個基因，其中包含1 059個新基因；使用Blast軟件將全部基因序列與8個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，統(tǒng)計到57 669個基因得到功能注釋；GO分析顯示30 403個基因得到功能注釋，共涉及49個功能組，主要集中在膜(細(xì)胞組分)、催化活性(分子功能)、代謝過程(生物學(xué)過程)等中；KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)16 594個基因得到注釋，要對碳代謝和植物-病原體相互作用等生物學(xué)過程進(jìn)行調(diào)節(jié)；在杜梨不同顏色的葉片中共篩選出10個與類黃酮相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，主要通過類黃酮的生物合成過程、花青素還原酶活性調(diào)節(jié)、黃酮醇合酶活性調(diào)節(jié)、花青素在紫外線下于組織中積累、黃酮類生物合成過程等機(jī)制對杜梨葉色進(jìn)行調(diào)控，并且大部分轉(zhuǎn)錄因子在紅葉中的表達(dá)量大于在青葉和花葉中的表達(dá)量；在杜梨葉片轉(zhuǎn)錄組中共搜索到452 501個SNP位點，發(fā)生頻率為1/411，所有的變異類型中轉(zhuǎn)換類型遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于顛換類型。