王 燦 梁 楓 劉學醫(yī) 周逢倉 呂向陽 胡 霞

(安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校，蕪湖 241000)

黃藥子，別名黃藥、黃藥根，系薯蕷科植物黃獨(DioscoreabulbiferaL.)的干燥塊莖，可涼血、降火、消癭、解毒，臨床可用于食道癌、胃癌的治療[1-2]。雖療效突出，但因肝毒性，制約了其在臨床廣泛應用[3]。要充分發(fā)揮其療效價值，勢必要對其進行減毒。

炮制為中藥獨特加工處理技術，通過一定制法使藥材改性或增效、應用安全[4]。目前對黃藥子的炮制研究較為匱乏，未見不同炮制方法對黃藥子抗腫瘤作用影響的報道。本研究擬通過體內(nèi)外實驗評價不同炮制方法對黃藥子的減毒增效作用，除既往已有一定研究的當歸之外，嘗試使用在諸多方劑與配伍中應用廣泛、療效確切且不良反應少的黃芪，結(jié)合臨床常用的炒制、酒劑使用的現(xiàn)狀，比較當歸制、黃芪制、酒制、炒制等炮制方法對黃藥子抗胃癌作用及肝毒性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥物和試劑 黃藥子(產(chǎn)地河南，批號200901)，黃芪(產(chǎn)地甘肅，批號210301)，當歸(產(chǎn)地甘肅，批號20091104)，經(jīng)安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校藥學系王寧教授鑒定;CCK-8試劑盒(HY-K0301，MedChemExpress公司);MKN-45細胞專用培養(yǎng)基(CM-0292，武漢普諾賽生命科技有限公司);胎牛血清(Biosharp BL201A)、胰蛋白酶(Biosharp BL512A)、磷酸緩沖鹽溶液PBS(Biosharp BL302A)(北京蘭杰柯科技有限公司)。

1.1.2儀器 BGL-50GB遠紅外干燥箱(上海本亭儀器有限公司);R-1020旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(河南省鞏義市宏華儀器設備有限公司);GN-36高速中藥粉碎機(杭州旭眾機械設備有限公司);全波長酶標儀(英國安圖斯Zenyth 200);HH-US-B水浴箱(上海赫田科學儀器有限公司);5810R型低溫離心機(日本HITACHI);2135型切片機(德國萊卡);Moticam5000顯微攝影成像系統(tǒng)(美國);DRP-9272電熱恒溫箱(上海森信實驗儀器有限公司);Thermo Scientific Evolution 360 Bio紫外分光光度儀(美國);KRD-LB3型石蠟包埋機(湖北省孝感康瑞德科技有限公司);KH-P2恒溫攤烤片機(湖北省孝感闊?？萍加邢薰?;XE805S電子分析天平(天津市德安特傳感技術有限公司)。

1.1.3細胞株 人胃癌細胞MKN-45(Procell CL-0292,武漢普諾賽生命科技有限公司)。

1.1.4動物 ICR小鼠，SPF級，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g(動物許可證號：SCXK(蘇)2012-0009)，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場。置動物飼養(yǎng)籠內(nèi)，于實驗前適應性飼養(yǎng)1周，室內(nèi)按自然晝夜節(jié)律明暗交替照明，保持室溫18℃～22℃，濕度60%～80%，標準小鼠飼料喂養(yǎng)。所有動物實驗符合動物倫理學要求。

1.2 方法

1.2.1黃藥子炮制品及各組提取物的制備 參考《中國藥典》2020年版[4]4部0213炮制通則中炮炙項下單炒(清炒)法、炙法項下酒炙法及一部黃連項下萸黃連炮制方法分別制備清炒黃藥子(FD)炮制品、酒炙黃藥子(WD)炮制品和當歸煎湯炙黃藥子(2∶1)(ASR2∶1DB)、黃芪煎湯炙黃藥子(1∶2)(AR1∶2DB)、黃芪煎湯炙黃藥子(1∶1)(AR1∶1DB)、黃芪煎湯炙黃藥子(2∶1)(AR2∶1DB)炮制品。

分別稱取黃藥子生品(RD)、FD、WD、ASR2∶1DB、AR1∶2DB、AR1∶1DB、AR2∶1DB各20g，使用95%乙醇為溶劑，采用傳統(tǒng)回流提取法分別得黃藥子生品及各炮制品醇提物，得率依次為15.21%、14.79%、12.36%、13.65%、13.87%、12.91% 和13.42%。4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2動物分組及給藥 ICR小鼠80只隨機分為空白對照(Ct)組、黃藥子生品(RD)組、清炒黃藥子(FD)組、酒炙黃藥子(WD)組、當歸煎湯炙黃藥子(2∶1)(ASR2∶1DB)組、黃芪煎湯炙黃藥子(1∶2)(AR1∶2DB)組、黃芪煎湯炙黃藥子(1∶1)(AR1∶1DB)組、黃芪煎湯炙黃藥子(2∶1)(AR2∶1DB)組，每組各10只，均雌雄各半，每只稱重并記錄。采用灌胃分別給予各組對應炮制藥物，1次/d，連續(xù)14d。按照臨床成人每日單次劑量等效換算為小鼠劑量，RD及其它各炮制組以生藥計均為1.7g·kg-1[5]，Ct組給予生理鹽水。給藥期間正常喂養(yǎng)，環(huán)境溫、濕度及光照等條件同前保持穩(wěn)定。

1.2.3取材及樣本制備 各組連續(xù)給藥14d后，于取材前一晚8點禁食不禁水，次日上午各組小鼠稱重，腹腔內(nèi)注射0.1%戊巴比妥鈉麻醉(用量0.001ml/g按體重計算),迅速打開腹腔，腹主動脈采血，采血后處死小鼠，隨即取各組肝臟。

1)血液處理。經(jīng)室溫靜置2h，離心(4℃，3500r/min，15min)，取上清液，除菌處理后-80 ℃冷凍貯存。

2)肝臟處理。冰冷生理鹽水洗凈,濾紙吸干表面液體，稱重。

3)肝組織病理固定。取適量肝臟組織切成0.5～1cm3大小，常規(guī)固定于4%多聚甲醛溶液中，HE染色，石蠟制片。

1.2.4細胞培養(yǎng)及CCK-8法檢測細胞增殖 按照CCK-8試劑盒說明書方法操作：將人胃癌細胞MKN-45接種于培養(yǎng)皿中，放置細胞培養(yǎng)箱中37℃及5%CO2條件下于MKN-45細胞專用培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當細胞貼壁達85%時按1∶3傳代，取對數(shù)生長期細胞制成單細胞懸液，并調(diào)整密度為5×104個/mL，96孔板接種細胞懸液，每組6復孔，每孔接種量100μL，各組每孔分別加入對應血清10μL，于加入血清后即刻(0h)以及培養(yǎng)24、48、72h后，分別加入CCK-8試劑10μL，37℃及5%CO2孵育2h后，使用酶標儀測定各組吸光度(測定波長為450nm)，以0h所測得每組吸光度值作為基線，計算細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組藥物對人胃癌細胞MKN-45增殖的影響

各組炮制藥物均能夠?qū)θ宋赴┘毎鸐KN-45的增殖產(chǎn)生抑制作用，且逐漸有所增強，以AR1∶1DB、AR2∶1DB、ASR2∶1DB組作用明顯。與Ct組比較，24h、48h、72h時AR1∶1DB、ASR2∶1DB組均有差異(P<0.05)，AR2∶1DB組具有差異(P<0.001)；與RD組比較，24h、48h、72h時AR1∶1DB、ASR2∶1DB組均有差異(P<0.05)，AR2∶1DB組具有差異(P<0.001)；24h時AR1∶1DB、AR2∶1DB、ASR2∶1DB三組細胞數(shù)量變化顯著，與AR1∶1DB組比較AR2∶1DB組有差異(P<0.05)，與ASR2∶1DB組比較AR2∶1DB組有差異(P<0.05)；48h與72h比較此三組細胞數(shù)量變化相對較小，48h時與AR1∶1DB組和ASR2∶1DB組比較AR2∶1DB組均有差異(P<0.05)；72h時AR2∶1DB組和AR1∶1DB組相比有差異(P<0.05)，和ASR2∶1DB組相比有差異(P<0.05)。見表1。

表1 各組24、48和72h人胃癌細胞MKN-45數(shù)量

2.2 各組小鼠肝臟組織病理形態(tài)學

Ct組肝小葉結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝細胞排列整齊，各組織學結(jié)構(gòu)正常。AR2∶1DB組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝血竇清晰，肝索排列較整齊，肝細胞核清晰可見，與Ct組相比無明顯差異。ASR2∶1DB組肝小葉結(jié)構(gòu)較為完整，肝細胞輕度水腫，細胞間隙內(nèi)見有少量膽汁淤積，中央靜脈內(nèi)輕度淤血。AR1∶1DB組肝小葉結(jié)構(gòu)尚存，內(nèi)有少量淤血，肝細胞中度水腫，細胞腫脹，胞質(zhì)疏松內(nèi)有較多顆粒，壞死不明顯。AR1∶2DB組肝小葉正常結(jié)構(gòu)消失，中央靜脈內(nèi)見少量淤血，肝細胞輕度脂肪樣變性，呈氣球樣變，門管區(qū)周圍肝細胞見少量局灶性壞死。FD組肝小葉正常結(jié)構(gòu)消失，肝細胞排列紊亂，呈明顯水腫，以氣球樣變性，間隙內(nèi)有少量淤血，門管區(qū)周圍肝細胞呈多灶性壞死伴有肝細胞再生，有少量淋巴細胞浸潤。WD組肝小葉正常結(jié)構(gòu)消失，肝細胞排列紊亂，呈重度水腫，胞質(zhì)疏松呈空網(wǎng)狀，門管區(qū)周圍肝細胞見明顯片狀壞死灶伴有肝細胞再生，有少量淋巴細胞浸潤。RD組肝小葉正常結(jié)構(gòu)消失，肝細胞排列紊亂，呈明顯水腫，以氣球樣變性，門管區(qū)周圍肝細胞可見多個片狀壞死灶伴有大量炎性細胞浸潤。見圖1。

注：A.Ct組;B.AR2∶1DB組;C.ASR2∶1DB組;D.AR1∶1DB組；E.AR1∶2DB組；F.FD組；G.WD組；H.RD組

3 討論

傳統(tǒng)中藥黃藥子藥用價值較高，現(xiàn)代臨床常用來治療胃癌等消化道腫瘤，但其毒性較大，臨床報道多集中于肝損害方面。中藥配伍減毒歷史悠久，炮制則更是增強藥效之傳統(tǒng)中醫(yī)藥獨特技術。本實驗通過結(jié)合黃藥子炮制與探索不同藥物與之配伍的方法以考察使黃藥子增效減毒的有效措施，進一步提升其應用的安全性和有效性。本實驗結(jié)果表明黃藥子生品在抑制胃癌細胞增殖的同時也造成了肝臟損害，表現(xiàn)出明顯的肝毒性，而其它各炮制品的減毒增效作用表現(xiàn)則各不相同，具體如下：1)清炒法、酒炙法和黃芪煎湯炙黃藥子(1∶2)炮制法均有不同程度的改善肝臟組織病理改變作用，但在抑制胃癌細胞增殖方面效果均并不理想，即此3組可對黃藥子有一定減毒作用，但未有增效。2)黃芪煎湯炙黃藥子(1∶1)、黃芪煎湯炙黃藥子(2∶1)和當歸煎湯炙黃藥子(2∶1)炮制法：此3組在增強黃藥子的抗胃癌作用同時也保護了肝臟，降低其肝毒性，減毒增效作用顯著。其中以黃芪煎湯炙黃藥子(2∶1)法作用最強，黃芪煎湯炙黃藥子(1∶1)法和當歸煎湯炙黃藥子(2∶1)法則作用相當。

黃芪作為常用傳統(tǒng)中藥,具有固表止汗，生津養(yǎng)血，行滯通痹，托毒排膿，斂瘡生肌等功效,用于氣虛乏力，中氣下陷，血虛萎黃，癰疽難潰，久潰不斂等癥狀[4]，見于諸多以抗腫瘤為目的的中藥復方[6]。但是有關黃芪配伍炮制黃藥子以減毒增效的實驗研究還未有報道，因此本實驗設置黃芪煎湯炙法炮制黃藥子的考察組且分為1∶1、2∶1、1∶2 3種配伍比例，旨在考察黃芪對黃藥子的炮制增效減毒作用表現(xiàn)。結(jié)果表明此炮制法增強了黃藥子抗胃癌作用同時減少了其對肝臟的損害，且藥效隨著黃芪在藥對中所占的比重增大而增強，以2∶1組最為突出。究其可能原因，有研究報道顯示黃藥子能抑制胃癌細胞增殖和誘導凋亡[7]，而黃芪中的多糖類成分不僅通過調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄影響細胞生長周期從而抑制胃癌細胞增殖，而且可促進免疫細胞增生、提升機體免疫能力，激活腫瘤細胞免疫應答，調(diào)動免疫系統(tǒng)發(fā)揮抑制腫瘤的作用[2，8]。因此，黃芪可能與黃藥子經(jīng)炮制后產(chǎn)生協(xié)同作用從而使其抗胃癌效應增強。此外，黃藥子對機體肝臟的損害程度與劑量呈線性關系，其毒性產(chǎn)生的機制可能與谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性受抑制以及氧化應激所致自由基損傷有關[9]。黃芪性味甘，歸肺、脾經(jīng)，甘緩減毒，其抗氧化有效成分黃芪多糖可抑制細胞氧化損傷、刺激抗體產(chǎn)生、清除自由基，還可通過啟動谷胱甘肽過氧化物酶等解毒酶系以保護肝細胞[8]而起到減毒作用。黃芪的這種炮制增效減毒作用與其用量的多少成正比，其內(nèi)在物質(zhì)基礎和深入機制有待于進一步研究。

近年來當歸配伍黃藥子進行減毒研究的報道較多，顯示當歸與黃藥子比例為2∶1時減毒效果最為理想[3,9-10]，故本實驗將其納入作為驗證對比。現(xiàn)有研究認為當歸配伍黃藥子可使其主要毒性成分黃獨乙素和兒茶素的質(zhì)量分數(shù)下降，能夠拮抗肝細胞內(nèi)grp78基因表達上調(diào)并逆轉(zhuǎn)黃藥子對肝臟生物氧化酶和藥物代謝酶活性的抑制[11-12]，這可能是當歸對黃藥子起減毒增效作用的機制。本實驗明確當歸煎湯炙黃藥子(2∶1)炮制法具有良好減毒增效作用，但并未優(yōu)于黃芪煎湯炙黃藥子(2∶1)炮制法，關于此兩種方法的效用差別其炮制物質(zhì)基礎及內(nèi)在機制仍需后續(xù)深入研究確定。

本實驗同時考察了臨床常用的清炒炮制法與酒炙炮制法對黃藥子藥效及毒性的影響，結(jié)果顯示此二法僅有部分減毒效果而增效作用不明顯。推測對黃藥子炒制加熱或酒制的過程可能并未從根本上改變其主要化學活性成分和作用，尚需更多相關實驗指標檢測加以驗證。

本實驗研究不同炮制方法對黃藥子抗胃癌作用及其肝毒性的影響，并首次嘗試將黃藥子與黃芪配伍使用，證實了黃芪煎湯炙法和當歸煎湯炙法均可對黃藥子起到減毒增效作用，且黃芪煎湯炙黃藥子(2∶1)炮制法效果最佳，一定程度上為中藥減毒配伍研究提供了新的思路。

利益沖突：所有作者均申明不存在利益沖突。