鄭培峰，姜小蕾，翟彥霖，郭紹霞，李 偉

（1吉林農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，長春 130118；2吉林省農(nóng)業(yè)科學院資源與環(huán)境研究所/玉米國家工程實驗室，長春 130033；3青島農(nóng)業(yè)大學園林與林學院，山東青島 266109）

0 引言

近年來，隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥的過度使用，農(nóng)田土壤污染日益嚴重。長期噴施農(nóng)藥會在田間形成殘留，將直接影響農(nóng)業(yè)綠色生產(chǎn)和人類安全。除草劑是農(nóng)藥的常見類型之一，作為防治田間雜草的重要手段，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用；有研究表明某些類型的除草劑具有高殘留效應(yīng)，會導(dǎo)致土壤環(huán)境受到威脅，因此，減小除草劑對植物的影響，消除除草劑殘留污染一直受到學者廣泛關(guān)注[1]。

莠去津是世界上使用最廣泛的除草劑之一，對雜草防治具有十分好的效果，在國內(nèi)也得到廣泛使用，并且其使用量逐年遞增[2]。莠去津的作用機理主要是通過影響植物三磷酸腺苷和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的產(chǎn)生進而干擾光系統(tǒng)II，最終降低CO2固定效率，同時也限制葉綠葉綠體電子傳遞系統(tǒng)導(dǎo)致超氧離子自由基快速積累，造成細胞膜損傷，誘發(fā)植物死亡[3]。作為一種優(yōu)秀的除草劑類型，其缺點也較為顯著，相關(guān)研究表明，莠去津在清除雜草后，會在土壤中長期殘留，對后續(xù)植物的生長形成威脅[4]。此外，莠去津會對人體產(chǎn)生嚴重危害，影響人體內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等各個系統(tǒng)，產(chǎn)生各種疾病，誘發(fā)癌癥[5]。因此，如何降低莠去津殘留，恢復(fù)土壤健康成為了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域亟需解決的難題。

生物修復(fù)技術(shù)被認為是目前最具發(fā)展?jié)摿Φ耐寥佬迯?fù)技術(shù)，利用植物-微生物協(xié)同修復(fù)的辦法，充分發(fā)揮植物與微生物的優(yōu)勢，提高對污染土壤的修復(fù)作用[6]。研究已發(fā)現(xiàn)，覆蓋作物能夠修復(fù)土壤結(jié)構(gòu)，改善土壤理化性質(zhì)，降低農(nóng)藥殘留。結(jié)縷草作為眾多覆蓋植物種類中的一種，具有重要利用價值。但是有關(guān)結(jié)縷草修復(fù)農(nóng)藥殘留土壤的機理尚未明確，關(guān)鍵在于結(jié)縷草受除草劑莠去津威脅較大，難以存活。而位于植物根系的根際促生菌可能會對結(jié)縷草的生長起到促進作用。

存在于植物根系周圍的根際促生菌是一類能夠為植物提供幫助并能夠定殖于植物根際的細菌[7]。PGPR對植物生長具有非常好的效果，適量的接種后可提高植物對土壤中的營養(yǎng)成分的吸收效率、促進植物生長[8]，降低植物中的葡萄糖感應(yīng)和脫落酸水平，增強植物的光合作用[9]，提高植物有機物積累量[10]。在對土壤結(jié)構(gòu)的改善方面，PGPR同樣具有一定的效果。某些PGPR菌劑，如解磷解鉀菌，它可以分泌有機酸，分解土壤中難溶性礦物質(zhì)，增加土壤酶活，促進土壤中磷、鉀及一些難溶性礦質(zhì)元素的釋放、改善土壤營養(yǎng)狀況以及土壤微生態(tài)結(jié)構(gòu)等[11]。有研究表明，即使在逆境環(huán)境下，使用PGPR等土壤微生物，仍可以增強植物生命力，提高植物抗逆能力[11]。因此，運用根際微生物提高結(jié)縷草生命力以應(yīng)對莠去津毒害是非常值得研究的問題。本研究希望通過探究結(jié)縷草接種PGPR后對不同莠去津濃度的生理生化反應(yīng)，確定出接菌后結(jié)縷草可承受莠去津毒害的最大范圍，為結(jié)縷草消除土壤莠去津殘留機理研究提供前期技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物為結(jié)縷草（購自北京百斯特草業(yè)有限公司），供試PGPR菌為熒光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens,Ps2-6)，由青島農(nóng)業(yè)大學菌根生物技術(shù)研究所分離、鑒定和保存，采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和無機鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種備用；供試藥劑為中保27%煙·硝·莠去津可分散油懸浮劑（購自山東金農(nóng)華藥業(yè)有限公司）；栽培基質(zhì)為經(jīng)過200目篩后，由121℃高溫高壓蒸汽滅菌2 h后的原土，土壤pH 6.26，有機質(zhì)含量5.3 g/kg，全氮含量1.2 g/kg，全磷含量0.4 g/kg，全鉀含量5.1 g/kg，堿解氮含量56.1 g/kg，有效磷含量56.1 mg/kg，速效鉀含量50.2 g/kg。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2018年8—10月在青島農(nóng)業(yè)大學溫室大棚內(nèi)進行，采用盆栽試驗，設(shè)置4個莠去津濃度0、3、15、75 mg/kg，分別接種PGPR，以不接種為對照(CK)，共8個處理，隨機排列，每個處理重復(fù)5次。試驗前，將事先配置好的莠去津混合液按對應(yīng)處理濃度均勻混入土壤中，使之保持0、3、15、75 mg/kg莠去津濃度，7天后播種結(jié)縷草，待結(jié)縷草出苗兩周后，各處理分別接種30 mL PGPR菌液，分3次注入，每次10 mL，間隔3天，對照組則注入等量滅菌接種物。結(jié)縷草種子用10% H2O2浸泡消毒10 min后置于濾紙晾干。每盆稱取1.0 g的結(jié)縷草種子均勻的播種至上口徑16 cm，下口徑12 cm，高20 cm塑料盆內(nèi)（75%酒精擦拭消毒，每盆4 kg基質(zhì)），出苗前，每周3～4次水，均勻且充足，在培養(yǎng)期間注意溫度、光照和通氣狀況，種子萌發(fā)后，每2天澆1次水，保證結(jié)縷草的生長需求的前提下嚴禁積水。定期觀察并記錄其生長情況，幼苗生長60天后，測量結(jié)縷草相關(guān)指標。

1.3 指標測定

1.3.1 防御性酶活性及相關(guān)物質(zhì)含量測定 過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚氧化法測定；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250法測定；游離脯氨酸(pro)含量采用酸性茚三酮比色法測定；丙二醛(MDA)含量采用比色法測定；相對電導(dǎo)率采用電解質(zhì)滲透法測定；上述指標均采用王學奎[12]描述方法測定。

1.3.2 結(jié)縷草光合參數(shù)及葉綠素熒光參數(shù)測定 選擇晴朗少云的天氣，在9:30—11:30，使用便攜式光合儀CIRAS-3測定葉片凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導(dǎo)度(Gs)等參數(shù)。使用Pocket PEA熒光儀測定葉片葉綠素熒光參數(shù)，葉片暗適應(yīng)20 min后，測定暗適應(yīng)后光系統(tǒng)II(PSII)的最大光化學效率(Fv/Fm)和PSⅡ潛在活性(Fv/Fo)。

1.3.3 生長指標及葉綠素含量測定 株高：自莖基部至頂芽分生處長度；鮮重：將地上部植株和地下部根系分開并清洗干凈，分別用分析天平測量；干重：將測定完鮮重的植株和根系分別裝入檔案袋，將烘箱調(diào)到105℃殺青30 min，再調(diào)到80℃烘至恒重，用分析天平測量；葉綠素 a(Chl a)、b(Chl b)、總?cè)~綠素 Chl(a+b)、葉綠素a/b(Chl a/b)和類胡蘿卜素(Car)含量采用乙醇丙酮混合液法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進行處理和繪圖，采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 PGPR對莠去津污染土壤下結(jié)縷草生長的影響

同一接菌處理下，隨莠去津濃度的增加，結(jié)縷草株高、地上部鮮重、干重，地下部鮮重、干重均呈現(xiàn)降低趨勢，表明莠去津?qū)Y(jié)縷草生長造成顯著影響，同一莠去津濃度，接種PGPR顯著提高株高，中、低莠去津濃度，接種處理顯著提高地上部鮮重、干重，高莠去津濃度，接種處理出現(xiàn)下降；3 mg/kg下，與CK相比，接種PGPR的結(jié)縷草株高、地上部鮮重、干重分別增加71.43%、47.69%和78.13%（表1），綜上，接種PGPR可以顯著提高結(jié)縷草生物量的積累。

表1 PGPR對莠去津污染土壤下結(jié)縷草生長的影響

2.2 PGPR對莠去津污染土壤下結(jié)縷草光合特征的影響

2.2.1 PGPR對莠去津污染土壤下結(jié)縷草色素含量及熒光參數(shù)的影響 同一接種處理下，隨莠去津濃度增加，結(jié)縷草Chl a、Chl b含量及Chl(a+b)含量基本呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，Chl a/b、Fv/Fm和Fv/Fo呈現(xiàn)下降趨勢，Car變化不顯著，表明莠去津?qū)θ~綠素含量及熒光參數(shù)影響顯著。同一莠去津濃度下，接種PGPR處理，在低濃度均顯著增加結(jié)縷草Chl a、Chl b、Chl(a+b)、Car含量和Fv/Fm值和Fv/Fo值，中濃度僅提高Chl a、Chl b、Chl(a+b)和Car含量，但高濃度下各指標均降低；在3 mg/kg莠去津水平下，與CK相比，接種PGPR處理的結(jié)縷草葉片Chl a、Chl b、Chl(a+b)、Car含量、Fv/Fm值和Fv/Fo值分別增加45.8%、39.5%、44.7%、22.2%、9.9%和41.04%；15 mg/kg莠去津水平下接種處理的結(jié)縷草葉片Chl a、Chl b、Chl(a+b)和Car含量分別增加82.2%、85.0%、82.3%、60.0%（表2，圖1）。由以上結(jié)果可知，接種PGPR在莠去津低濃度時，可促進結(jié)縷草光合色素合成，提高葉片色素含量，增加Fv/Fm和Fv/Fo，中濃度下，只提高葉片色素含量，對Fv/Fm和Fv/Fo作用效果不顯著，而高濃度，接菌處理的結(jié)縷草色素含量卻出現(xiàn)降低，F(xiàn)v/Fm和Fv/Fo與中濃度表現(xiàn)相一致。說明僅在莠去津低濃度時，接菌處理可同時提高結(jié)縷草葉片色素含量及Fv/Fm和Fv/Fo值。

圖1 PGPR對莠去津污染土壤下結(jié)縷草葉綠素熒光參數(shù)的影響

表2 PGPR對莠去津污染土壤下結(jié)縷草色素含量的影響

2.2.2 PGPR對莠去津污染土壤下結(jié)縷草光合參數(shù)的影響 同一接菌處理下，隨莠去津濃度的增加，結(jié)縷草葉片Pn呈現(xiàn)下降趨勢，Ci呈現(xiàn)上升趨勢，對照處理中，隨莠去津濃度的增加，結(jié)縷草葉片Tr、Gs呈現(xiàn)下降趨勢，接菌處理Tr、Gs變化不顯著；中，低濃度莠去津處理，接種PGPR處理增大Pn，降低Gs、Tr、Ci，高濃度莠去津處理則相反。3 mg/kg下，與CK相比，接種PGPR的結(jié)縷草葉片Pn增加184.83%，Tr降低9.6%，Gs和Ci作用不顯著，15、75 mg/kg下，與CK相比，接種PGPR的結(jié)縷草葉片Pn、Gs、Tr、Ci變化不顯著（圖2）。可見，接種PGPR可以提高結(jié)縷草葉片Pn，但限于莠去津低濃度范圍，對于中、高濃度表現(xiàn)效果不顯著。

圖2 PGPR對莠去津污染土壤下結(jié)縷草Pn、Tr、Gs和Ci的影響

2.3 PGPR對莠去津污染土壤下結(jié)縷草抗逆生理指標的影響

2.3.1 PGPR對莠去津污染土壤下結(jié)縷草MDA含量和相對電導(dǎo)率的影響 同一接菌處理下，隨莠去津濃度的增加，結(jié)縷草葉片和根系MDA含量和相對電導(dǎo)率基本呈現(xiàn)升高趨勢，中，低濃度莠去津處理，接種PGPR顯著降低MDA含量和相對電導(dǎo)率，高濃度莠去津處理效果相反。3 mg/kg下，與CK相比，接種PGPR的結(jié)縷草葉片和根系MDA含量和相對電導(dǎo)率分別降低27.4%和2%、13.4%和36.0%，15、75 mg/kg變化不顯著（表3）綜上，接種PGPR可顯著降低結(jié)縷草MDA含量和相對電導(dǎo)率。

表3 PGPR對莠去津污染土壤下結(jié)縷草MDA含量和相對電導(dǎo)率的影響

2.3.2 PGPR對莠去津污染土壤下結(jié)縷草部分防御性酶和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響 同一接菌處理下，隨莠去津濃度的增加，結(jié)縷草葉片POD活性、可溶性蛋白含量及脯氨酸含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢；中低濃度莠去津處理，接種PGPR顯著提高POD活性、增加可溶性蛋白和脯氨酸含量，高濃度莠去津處理，接種PGPR顯著增加脯氨酸含量。3 mg/kg下，與CK相比，接種Ps2-6的結(jié)縷草葉片POD活性分別增強196.7%，可溶性蛋白和脯氨酸含量分別增加93.9%和137.1%，15 mg/kg接種PGPR的結(jié)縷草葉片可溶性蛋白和脯氨酸含量分別增加347.3%和169.6%，75 mg/kg變化不顯著（表4）。

表4 PGPR對莠去津污染土壤下結(jié)縷草葉片部分防御性酶和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

2.4 PGPR對莠去津污染土壤下結(jié)縷草生長及生理特性的相關(guān)性分析

方差分析結(jié)果如表5所示，結(jié)果表明，PGPR、莠去津及兩者交互作用均對結(jié)縷草株高、地上部鮮重、地上部干重、地下部鮮重及地下部干重影響極顯著(P＜0.01)。PGPR對結(jié)縷草葉片光合特征指標中Chl a、Chl b、Chl(a+b)、Fv/Fo、Pn和Tr影響極顯著(P＜0.01)，對Tr影響顯著(P＜0.05)；莠去津?qū)Y(jié)縷草葉片Chl a、Fv/Fm、Fv/Fo、Pn、Tr、Gs和Ci影響極顯著(P＜0.01)，對Chl(a+b)影響顯著(P＜0.05)，PGPR與莠去津交互作用對結(jié)縷草葉片F(xiàn)v/Fo、Pn、Tr和Gs影響極顯著(P＜0.01)，對 Chl a、Chl(a+b)、Car影響顯著(P＜0.05)。PGPR對結(jié)縷草葉片抗逆生理指標中脯氨酸含量影響極顯著(P＜0.01)；莠去津?qū)Y(jié)縷草葉片抗逆生理指標中葉片相對電導(dǎo)率和根系相對電導(dǎo)率影響極顯著(P＜0.01)，對葉片MDA含量和根系MDA含量影響顯著(P＜0.05)；二者交互作用對對結(jié)縷草葉片抗逆生理指標中葉片相對電導(dǎo)率和根系相對電導(dǎo)率影響顯著(P＜0.05)。

表5 PGPR對莠去津污染土壤下結(jié)縷草生長及生理特性的相關(guān)性分析

3 討論

隨著農(nóng)藥大面積施用，莠去津作為重要田間除草劑，帶來的土壤污染范圍也日益增加，莠去津脅迫下，植物的生長受到抑制，株高等生物量顯著降低[13]，有研究發(fā)現(xiàn)接種PGPR可修復(fù)受污染的土壤，降低土壤殘留重金屬離子，改善土壤理化性質(zhì)，提高植物生命力[14-15]，本試驗發(fā)現(xiàn)，接種PGPR后，與對照相比，結(jié)縷草株高、地上部和地下部生物量具有不同程度的增加，這表明接種PGPR對結(jié)縷草生長具有積極影響。杜寒春等[16]的研究也已證實，PGPR可在植物根際定殖，依附于植物根表面或生活在植物組織內(nèi)，促進植物相關(guān)激素產(chǎn)生，加速植物生長。

作為植物光合作用的關(guān)鍵色素，葉綠素承擔著吸收光量子固定光化學能的作用，一直是逆境研究的重點，研究表明，植物在除草劑的脅迫下，色素含量隨濃度的增加呈現(xiàn)顯著下降趨勢，多數(shù)植物葉片葉綠素合成速率降低，分解速率加快，從而導(dǎo)致植物出現(xiàn)黃化萎蔫癥狀[17]。張敏等[18]研究發(fā)現(xiàn)，接種PGPR可緩解脅迫帶來的不良影響，顯著提高植物色素含量。本試驗結(jié)果表明，隨著莠去津濃度升高，結(jié)縷草Chla/b逐漸降低，Chla和Chlb含量同步降低，說明結(jié)縷草受莠去津脅迫后，減緩了Chlb的分解速率，降低Chla/b，增強對弱光的利用效率。張倩等[19]研究發(fā)現(xiàn)植物對除草劑具有一定的耐受性，低濃度下，植物受到影響較小，而高濃度下植物生長則受到抑制。本試驗中，結(jié)縷草在低濃度莠去津脅迫下，葉綠素含量升高，而高濃度下則降低，與之結(jié)果相似，這可能是由于植物在低濃度受到莠去津的刺激，加快葉綠素合成導(dǎo)致，而高濃度下，植物自身生理代謝紊亂，葉綠素合成途徑受到阻礙，酶活性比例失調(diào)，或葉綠素快速分解，進而使結(jié)縷草葉綠素含量降低，李文彬等[20]在研究菲和芘脅迫下AMF和PGPR對高羊茅生理生態(tài)的響應(yīng)中也得出相似的結(jié)論。圖2數(shù)據(jù)顯示，當葉綠素含量降低后，會進一步阻礙光合色素和光合電子傳遞，導(dǎo)致結(jié)縷草葉片氣孔阻力增加，CO2進入氣孔受阻，但可能是由于莠去津影響三磷酸腺苷和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的產(chǎn)生，干擾PSII降低CO2的固定效率，最終導(dǎo)致Ci上升，葉片Pn和Tr下降，光合作用降低，影響植物生長。接種PGPR可提高結(jié)縷草葉綠素含量，緩解莠去津帶來的危害，增強光合能力和生物量，這可能與PGPR增強植物根系對礦質(zhì)元素的吸收和轉(zhuǎn)化能力有關(guān)[21]，其他相關(guān)原因需進一步深入研究。

葉綠素熒光參數(shù)體現(xiàn)在光合作用過程中光系統(tǒng)對光能的吸收、傳遞、耗散和分配等方面[22]，F(xiàn)v/Fm和Fv/Fo是反應(yīng)植物光抑制的重要指標。試驗結(jié)果表明，莠去津脅迫下，不同處理間結(jié)縷草Fv/Fm和Fv/Fo均降低，出現(xiàn)光抑制現(xiàn)象，低濃度莠去津脅迫下，接種PGPR處理Fv/Fm值和Fv/Fo值較高，F(xiàn)v/Fo值顯著高于對照組，F(xiàn)v/Fm與對照相比無顯著性差異，高濃度下Fv/Fm值和Fv/Fo值與對照相比均無顯著差異。這表明接種PGPR處理可增強植物葉片在光合過程中的傳遞，但可能由于莠去津脅迫，影響三磷酸腺苷和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的產(chǎn)生，進而干擾PSII，導(dǎo)致接種處理作用并不顯著。

相關(guān)研究表明，植物遭受脅迫后，體內(nèi)活性氧自由基數(shù)量發(fā)生變化，導(dǎo)致膜脂過氧化加劇并伴隨著膜脂透性增大，MDA含量升高，植物細胞膜系統(tǒng)損傷[23]；并且由于植物細胞膜透性變大導(dǎo)致細胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，電導(dǎo)率顯著增大[24]。本試驗結(jié)果與之相同，低濃度莠去津脅迫下，接種PGPR可降低結(jié)縷草葉片和根部的MDA含量及相對電導(dǎo)率值，但中、高濃度下，相較于不接菌處理沒有顯著差異，表明接種PGPR在一定程度上能緩解莠去津?qū)Y(jié)縷草葉片細胞過氧化程度，提高結(jié)縷草的抗毒性。但隨著莠去津濃度增加，接菌對結(jié)縷草抗毒效果逐漸降低，表明結(jié)縷草對莠去津的抗性存在一定的耐受閾值，馬兵兵等[25]的研究結(jié)論也表明植物對于莠去津脅迫存在耐受范圍。接種PGPR可擴大結(jié)縷草的耐受閾值，這可能是由于接種PGPR后，菌群進行趨化運動，在根表面形成生物膜，增強了植物抗氧化能力，具體相關(guān)原因還需進一步驗證。

當外界環(huán)境發(fā)生變化時，植物生長發(fā)育受到刺激，產(chǎn)生較多的含氧自由基、過氧化物等物質(zhì)，引起膜脂過氧化，致使膜受到損傷，植物通常會自主調(diào)節(jié)細胞滲透勢[26]，增加體內(nèi)POD等防御性酶含量以減輕脅迫帶來的傷害[27]。研究表明，植物遭受脅迫時，脯氨酸和可溶性蛋白含量顯著增加[28]，植物通過滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累來降低細胞的滲透勢，從而保護細胞內(nèi)酶活性，來維持細胞的正常功能。本試驗發(fā)現(xiàn)不同濃度莠去津脅迫下，接種PGPR的結(jié)縷草脯氨酸含量和可溶性蛋白含量均高于對照，以3 mg/kg濃度下作用最為顯著，并且在此濃度下，接種PGPR的結(jié)縷草POD含量顯著高于對照，表明接種PGPR可提高莠去津脅迫下結(jié)縷草滲透調(diào)節(jié)能力，提高防御性酶含量，緩解毒害造成的損傷。

研究結(jié)果初步明確了接種PGPR可提高結(jié)縷草的生命力和抗逆性，在一定程度上緩解莠去津帶來的毒害，但主要作用在低濃度范圍，中、高濃度范圍效果較差。此外本試驗是基于室內(nèi)盆栽研究，考慮因數(shù)較為單一，針對于大規(guī)模田間應(yīng)用尚缺乏系統(tǒng)研究。為進一步明確PGPR對促進植物生長的具體機理，探明實際田間環(huán)境中PGPR的應(yīng)用價值，在未來的研究工作中將會針對結(jié)縷草在莠去津脅迫下的調(diào)控基因表達開展系統(tǒng)研究，于田間開展規(guī)模性試驗，為PGPR在農(nóng)藥殘留地應(yīng)用提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

試驗初步確定接種PGPR有效緩解莠去津?qū)χ参飩Φ臐舛确秶?～3 mg/kg，對高濃度莠去津毒害無顯著效果。通過接種PGPR，提高了結(jié)縷草葉片色素含量和抗氧化能力，增強葉片光合效能，減弱莠去津脅迫導(dǎo)致的膜脂過氧化損傷，促進植物健康生長。