齊 越，于 晶，蒼 晶，田 宇，彭瞰看，王多佳，王政委，任治鵬，梁 伊，王曉楠，孟 婧

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030； 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030)

RNA分子在RNA代謝過(guò)程中會(huì)經(jīng)歷一系列修飾[1]，其自身的不穩(wěn)定性容易引起RNA代謝紊亂[2]，進(jìn)而會(huì)在不同程度上影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)逆境脅迫的抵抗能力[3-4]。

DEAD-box RNA解旋酶屬于解旋酶家族的SF2家族，作為最大的解旋酶家族，DEAD-box RNA解旋酶參與轉(zhuǎn)錄、翻譯、mRNA前體剪接、核糖體生物發(fā)生、mRNA核-質(zhì)輸出以及RNA無(wú)義衰變等RNA代謝過(guò)程，調(diào)控植株的生長(zhǎng)發(fā)育與抗逆性[5-25]。部分DEAD-box RNA解旋酶缺失可能抑制植物生長(zhǎng)發(fā)育，甚至導(dǎo)致植株死亡。不同非生物脅迫會(huì)引起不同DEAD-box解旋酶基因的表達(dá)量發(fā)生變化，從而提高植株的脅迫耐受能力[5]。擬南芥中，DEAD-box家族基因AtRH3、AtRH7、AtRH9、AtRH25、AtHELP、LOS4和RCF1均響應(yīng)低溫脅迫[6-8]，其中，AtRH3和AtRH7完全缺失會(huì)導(dǎo)致植株死亡[7-8]。水稻中，DEAD-box家族基因TCD33可提高水稻耐寒能力，缺失突變體tcd33表現(xiàn)出子葉白化表型，說(shuō)明TCD33是葉綠素合成的必需基因[9]；另外，OsRH42也可提高水稻的抗寒能力[10]。甘藍(lán)中，DEAD-box家族基因BrRH22除響應(yīng)低溫脅迫外，還響應(yīng)干旱脅迫和鹽脅迫[11]。除此之外，前人還發(fā)現(xiàn)，多個(gè)物種的DEAD-box基因家族成員均響應(yīng)逆境脅迫，如龍眼DlDDX、小立碗蘚eIF4A1、番茄SlDEAD39、擬南芥AtRH17和大豆P68均響應(yīng)鹽脅迫[12-16]；水稻OsRH58、小立碗蘚eIF4A1和擬南芥AtRH8均響應(yīng)干旱脅迫[17-19]。但目前關(guān)于小麥DEAD-box基因家族成員參與植物非生物脅迫抵抗的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

為了解小麥DEAD-box基因的功能，本研究對(duì)小麥DEAD-box基因家族成員進(jìn)行全基因組鑒定，并對(duì)本課題組前期在轉(zhuǎn)錄組與蛋白磷酸化數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選獲得的7個(gè)差異表達(dá)的小麥DEAD-box基因(未發(fā)表)進(jìn)行表達(dá)模式分析，以期為小麥DEAD-box基因的功能研究奠定 基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 小麥DEAD-box基因家族成員的鑒定及其特征分析

從Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫(kù)(http://plants.ensembl.org/index.html)下載小麥全基因組序列文件及其基因注釋文件，從UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/uniprot/? query=reviewed:yes)下載已確認(rèn)的60個(gè)水稻DEAD-box基因，并以此為參照(基因提取比例為1∶5，并去除重復(fù)基因)從小麥全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索小麥DEAD-boxRNA解旋酶家族基因。在Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.xfam.org/)中進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，人工篩選掉預(yù)測(cè)錯(cuò)誤的DEAD-box基因模型，確認(rèn)小麥DEAD-box家族基因成員。

用ExPASy網(wǎng)站的Compute pI/MW tool軟件(https://web.expasy.org/ compute_pi/)分析小麥DEAD-box基因家族蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)。用Softberry網(wǎng)站的ProtComp 9.0軟件(http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl& group=programs&subgroup=proloc)對(duì)小麥DEAD-box基因家族蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.2 TaDEAD-box蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及其保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)分析

用MEGAX(https://www.megasoftware.net/)軟件中的Clustal W對(duì)小麥、擬南芥和水稻DEAD-box基因家族蛋白序列進(jìn)行序列比對(duì)，用最大似然法(maximum Likelihood，ML)和最優(yōu)進(jìn)化模型LG+G構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap值設(shè)置為1 000。用MEME軟件(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)分析小麥DEAD-box基因家族蛋白保守基序，位點(diǎn)分布方式為Zero or One Occurrence per Sequence(zoops)，檢索基序數(shù)量為9。用Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)小麥DEAD-box基因家族進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析，E-value≤1.0。用GSDS 2.0軟件(http://gsds.gao-lab.org/)對(duì)小麥DEAD-box基因家族進(jìn)行基因內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)分析。

1.3 DEAD-box基因家族的共線性分析

從Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)(https://data.jgi.doe.gov/refine-download/phytozome)下載水稻和擬南芥的全基因組序列文件及其基因注釋文件。用Circos軟件從小麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中提取物理位置信息，將所有小麥DEAD-box基因定位到染色體上。使用小麥與水稻、擬南芥全基因組文件相互對(duì)照提取，每個(gè)基因提取數(shù)≤30。用多重共線性掃描工具M(jìn)CScanX對(duì)基因重復(fù)事件進(jìn)行分析，參數(shù)為默認(rèn)值。使用KaKs_Calculator 2.0計(jì)算每個(gè)重復(fù)DEAD-box基因的非同義替換(ka)和同義替換(ks)，構(gòu)建小麥種內(nèi)共線性圖譜和小麥與水稻、擬南芥的種間共線性圖譜。

1.4 小麥DEAD-box基因家族在低溫下的表達(dá)模式分析

對(duì)本課題組前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，Dn1分蘗節(jié)含有大量與低溫脅迫相關(guān)的DEAD-box RNA解旋酶基因，對(duì)其進(jìn)行篩選整合，獲得7個(gè)低溫脅迫下表達(dá)量變化較為明顯的DEAD-box基因(TaRH7、TaRH30、TaRH20、TaRH10-1、TaRH10-2、TaRH35和TaRH5)(未發(fā)表)，本研究對(duì)這7個(gè)DEAD-box基因進(jìn)行表達(dá)模式分析。供試材料為強(qiáng)抗寒冬小麥品種Dn1和Dn2。

Dn1和Dn2種子于2020年9月12日播種于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田(行長(zhǎng)4 m，行距0.2 m，播種深度5 cm)，田間常規(guī)管理。在大田自然降溫連續(xù)10 d平均最低溫度分別為5、0、-10和 -25 ℃時(shí)，剪取分蘗節(jié)和葉片，置于-80 ℃冰箱保存。

表1 組織特異表達(dá)檢測(cè)所需的引物Table 1 Primers for tissue specific expression detection

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥DEAD-box基因家族鑒定結(jié)果、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位

根據(jù)60個(gè)水稻DEAD-box基因的蛋白序列，在Ensembl Plants小麥全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中共鑒定到134個(gè)小麥DEAD-box基因(表2)。理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，小麥DEAD-box家族基因編碼的蛋白序列長(zhǎng)度為408～1 276 aa，等電點(diǎn)為 4.99～10.17。109個(gè)小麥DEAD-box蛋白等電點(diǎn)大于7，為弱堿性蛋白；25個(gè)小麥DEAD-box蛋白等電點(diǎn)小于7，為弱酸性蛋白。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，78個(gè)小麥DEAD-box蛋白定位于細(xì)胞核中，19個(gè)定位于細(xì)胞外基質(zhì)中，9個(gè)定位于原生質(zhì)膜中，21個(gè)定位于細(xì)胞質(zhì)中，6個(gè)定位于線粒體中，1個(gè)定位于葉綠體中。

表2 小麥中鑒定出的DEAD-box家族基因Table 2 DEAD-box family genes identified in wheat

(續(xù)表2 Continued table 2)

2.2 小麥、水稻和擬南芥DEAD-box家族蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹分析

利用MEGAX軟件對(duì)小麥、水稻和擬南芥DEAD-box基因家族進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域分區(qū)可將DEAD-box基因分為12組。其中，L組中DEAD-box基因最多，共有60個(gè)DEAD-box基因，包含30個(gè)小麥DEAD-box基因、16個(gè)水稻DEAD-box基因和14個(gè)擬南芥DEAD-box基因。F組、G組和H組中DEAD-box基因較少，均有5個(gè)DEAD-box基因，包含3個(gè)小麥DEAD-box基因、1個(gè)水稻DEAD-box基因和1個(gè)擬南芥DEAD-box基因。各組中小麥DEAD-box基因數(shù)量均最多，可能與其基因組較大有關(guān)，各組中水稻和擬南芥的DEAD-box基因數(shù)量相近。

紅色、藍(lán)色和綠色字體分別表示冬小麥、擬南芥和水稻DEAD-box家族基因。Red,blue and green fonts represent the DEAD-box family genes of winter wheat,Arabidopsis and rice,respectively.圖1 小麥、水稻和擬南芥DEAD-box基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of DEAD-box genes in wheat,rice and Arabidopsis

小麥、水稻和擬南芥三個(gè)物種中DEAD-box基因保守性較高。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，同物種的部分同源DEAD-box基因均位于同一組，如TaRH7、TaRH13、TaRH14等。同一組中小麥與水稻DEAD-box基因家族成員聚類關(guān)系較近，而與擬南芥較遠(yuǎn)，原因可能是水稻和小麥均為禾本科單子葉植物。

2.3 小麥DEAD-box基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

為深入了解小麥DEAD-box基因家族的進(jìn)化過(guò)程，構(gòu)建小麥DEAD-box蛋白進(jìn)化樹，根據(jù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分區(qū)可將鑒定到的134個(gè)DEAD-box蛋白劃分為11組(圖2a)。核心基序分析發(fā)現(xiàn)，大部分小麥DEAD-box家族基因均具有排列相似的9個(gè)核心基序，部分DEAD-box家族基因只有7或8個(gè)基序，如TaEif4A3缺乏motif I和motif IV，TaRH38缺乏motif Ib和motif VI，TaRH39缺乏motif IV，TaRH50缺乏motif VI。不同組中部分DEAD-box蛋白DEAD結(jié)構(gòu)域(一般由motif Q、motif I、motif Ia、motif Ib、motif II和motif III組成)的核心基序排列順序存在差異；而Helicase C結(jié)構(gòu)域(一般由motif IV、motif V和motif VI組成)中的核心基序排列順序均相同(圖2b和圖3)?；蚪Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，小麥DEAD-box基因家族成員的內(nèi)含子分布不均勻，數(shù)量為1～15個(gè)。保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，小麥DEAD-box基因家族蛋白均含有DEAD與Helicase C保守結(jié)構(gòu)域，其中DEAD結(jié)構(gòu)域含有的內(nèi)含子數(shù)為0～6個(gè)，Helicase C結(jié)構(gòu)域含有的內(nèi)含子數(shù)為0～3個(gè)。同一組大部分小麥DEAD-box基因均具有相似的結(jié)構(gòu)，可能存在串聯(lián)重復(fù)基因。

A：小麥DEAD-box進(jìn)化樹。通過(guò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析將小麥DEAD-box蛋白分成11組，不同顏色代表不同組。B：小麥DEAD-box核心基序分布分析。C：小麥DEAD-box結(jié)構(gòu)域與基因結(jié)構(gòu)圖。A:Phylogenetic tree of wheat DEAD-box proteins.The TaDEAD-box proteins were divided into 11 regions by topology analysis,and different colors represent different groups.B:Distribution analysis of core motif of wheat DEAD-box.C:Dead-box domain and gene structure of wheat.圖2 小麥DEAD-box進(jìn)化樹、核心基序、結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Phylogenetic tree,core motifs,domain and gene structure analysis of the DEAD-box gene family

圖3 小麥TaDEAD-box蛋白家族核心基序示意圖Fig.3 Schematic diagram of the core motifs of the wheat DEAD-box gene family

2.4 小麥DEAD-box基因染色體分布與共線性分析

從基因在染色體上的分布來(lái)看，小麥各染色體上均有DEAD-box基因分布，但分布不均勻。

其中5A染色體上分布數(shù)量最多，含有13個(gè)DEAD-box基因；7D染色體上分布數(shù)量最少，僅有1個(gè)DEAD-box基因(圖4)。

從共線性分析結(jié)果來(lái)看，分布于同一基因組不同染色體上的小麥DEAD-box基因普遍存在共線性，說(shuō)明其大多數(shù)基因?yàn)橥慈旧w上的等位基因，在進(jìn)化上具有高度保守性。而值得注意的是，5A染色體上的TaRH29-1基因與4D染色體上的TaRH29-3基因之間存在共線性關(guān)系；5A染色體上的TaRH50-1、TaRH50-2和TaRH50-3基因與4B染色體上的TaRH29-2基因之間存在共線性關(guān)系；6A染色體上的TaRH8-3基因與2A、2B和2D染色體上的TaRH13-1、TaRH13-2和TaRH13-3基因之間存在共線性關(guān)系；2D染色體上的TaRH13-2基因與6A、6B和6D上的TaRH8-1、TaRH8-2和TaRH8-3基因之間存在共線性關(guān)系(圖4)。這些結(jié)果表明，小麥中DEAD-box基因可能是由基因復(fù)制產(chǎn)生的，節(jié)段性復(fù)制事件對(duì)小麥DEAD-box蛋白的進(jìn)化起著重要的推動(dòng)作用。

圖4 小麥DEAD-box基因在染色體上的分布Fig.4 Distribution of wheat DEAD-box gene on chromosomes

種間共線性分析發(fā)現(xiàn)，小麥與水稻的DEAD-box基因共線性連線數(shù)量遠(yuǎn)多于小麥與擬南芥的共線性連線數(shù)量(圖5)。小麥和擬南芥基因組中，僅有6個(gè)小麥DEAD-box基因存在共線性關(guān)系，分別位于2A、2B、2D、4A、4B、4D和6B染色體上，與擬南芥2號(hào)、3號(hào)和5號(hào)染色體上的3個(gè)基因存在共線性關(guān)系。小麥和水稻基因組中，除水稻的11號(hào)染色體外，其他染色體上共有38個(gè)水稻DEAD-box基因與小麥基因組中的83個(gè)小麥DEAD-box基因存在共線性關(guān)系。其中，水稻1號(hào)染色體的7個(gè)DEAD-box基因與小麥3A、3B和3D染色體上15個(gè)DEAD-box基因發(fā)生有序配對(duì)。這說(shuō)明水稻1號(hào)染色體和小麥3號(hào)染色體在DEAD-box基因進(jìn)化的線性關(guān)系上存在高度的保守性和一致性。值得注意的是，有3個(gè)水稻DEAD-box基因與小麥不同基因組上的DEAD-box基因發(fā)生了共線性配對(duì)，如水稻2號(hào)染色體上的OsEif4A3與小麥的6B、7A和7B染色體上的TaEif4A3C、TaEif4A3D、TaEif4A3B發(fā)生共線性配對(duì)；水稻2號(hào)染色體上的OsRH8和4號(hào)染色體上的OsRH6均與小麥1號(hào)染色體上的TaRH12-2(1A)和TaRH12-3(1B)以及6號(hào)染色體上的TaRH8-1(6A)、TaRH8-2(6B)和TaRH8-3(6D)發(fā)生共線性配對(duì)，推測(cè)這些基因所在的染色體可能在進(jìn)化上發(fā)生過(guò)異位突變。

圖5 小麥、水稻和擬南芥DEAD-box基因的共線性關(guān)系Fig.5 Collinearity of DEAD-box genes among wheat,rice and Arabidopsis

2.5 低溫脅迫下差異表達(dá)的小麥DEAD-box基因的表達(dá)模式

Dn1分蘗節(jié)中基因的表達(dá)量分析結(jié)果(圖6)顯示，隨著溫度的降低，TaRH7的表達(dá)量呈先降后升的變化趨勢(shì)，在-25 ℃時(shí)達(dá)到最大值，顯著高于5 ℃和0 ℃時(shí)的表達(dá)量，但與 -10 ℃時(shí)的表達(dá)量無(wú)顯著差異。TaRH30的表達(dá)量呈升-降-升的變化趨勢(shì)，在-25 ℃時(shí)達(dá)到最大值，顯著高于5 ℃和-10 ℃的表達(dá)量，但與0 ℃時(shí)的表達(dá)量無(wú)顯著差異。TaRH20、TaRH10-1、TaRH10-2、TaRH35和TaRH5的表達(dá)量均呈先升后降的變化趨勢(shì)，TaRH20與TaRH5的表達(dá)量在0 ℃時(shí)達(dá)到最大值，均顯著高于-10 ℃和-25 ℃時(shí)的表達(dá)量，但與5 ℃時(shí)的表達(dá)量無(wú)顯著差異；TaRH10-1、TaRH10-2和TaRH35的表達(dá)量均在-10 ℃時(shí)達(dá)到最大值，其中TaRH10-1和TaRH35顯著高于5 ℃、0 ℃和-25 ℃的表達(dá)量，TaRH10-2顯著高于5 ℃時(shí)的表達(dá)量。7個(gè)小麥DEAD-box基因中，TaRH10-1和TaRH35對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)較為明顯，在-10 ℃時(shí)表達(dá)量最高，約為5 ℃時(shí)表達(dá)量的5倍。

Dn1葉片中基因的表達(dá)量分析結(jié)果(圖6)顯示，隨著溫度的降低，TaRH7、TaRH10-1和TaRH35的表達(dá)量呈緩慢上升趨勢(shì)，-25 ℃時(shí)達(dá)到最大值，顯著高于5 ℃、0 ℃和-25 ℃的表達(dá)量；TaRH30、TaRH20、TaRH10-2和TaRH5的表達(dá)量呈先升后降的變化趨勢(shì)，在-10 ℃達(dá)到最大值，且TaRH20、TaRH10-2和TaRH5的表達(dá)量顯著高于5 ℃、0 ℃和-25 ℃的表達(dá)量，而TaRH30在各溫度間的表達(dá)量無(wú)顯著差異。7個(gè)小麥DEAD-box基因中，TaRH10-2對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)較為明顯，在-10 ℃時(shí)的表達(dá)量最高，約為5 ℃時(shí)表達(dá)量的85倍。

Dn2分蘗節(jié)中基因的表達(dá)量分析結(jié)果(圖6)顯示，隨著溫度的降低，TaRH7、TaRH30、TaRH20、TaRH10-2和TaRH5的表達(dá)量呈升-降-升的變化趨勢(shì)，其中，TaRH7、TaRH30和TaRH10-2的表達(dá)量在-25 ℃達(dá)到最大值，顯著高于5 ℃、0 ℃和-25 ℃的表達(dá)量；而TaRH20和TaRH5的表達(dá)量在0 ℃時(shí)達(dá)到最大值，均顯著高于5 ℃和-10 ℃的表達(dá)量。TaRH10-1的表達(dá)量呈先升后降的變化趨勢(shì)，在-10 ℃達(dá)到最大值，顯著高于5 ℃、0 ℃和-25 ℃的表達(dá)量。TaRH35的表達(dá)量呈降-升-降的變化趨勢(shì)，在-10 ℃達(dá)到最大值，顯著高于0 ℃和-25 ℃的表達(dá)量，但與5 ℃時(shí)的表達(dá)量無(wú)顯著差異。7個(gè)小麥DEAD-box基因中，TaRH7、TaRH30、TaRH10-1和TaRH10-2對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)較為明顯，TaRH7和TaRH30在-25 ℃時(shí)的表達(dá)量約為5 ℃表達(dá)量的10倍，TaRH10-1和TaRH10-2在-25 ℃時(shí)的表達(dá)量約為5 ℃時(shí)表達(dá)量的5倍。

Dn2葉片中基因的表達(dá)量分析結(jié)果(圖6)顯示，隨著溫度的降低，TaRH7、TaRH30、TaRH20和TaRH10-2的表達(dá)量呈升-降-升的變化趨勢(shì)，在-25 ℃時(shí)達(dá)到最大值，均顯著高于5 ℃、0 ℃和-25 ℃的表達(dá)量。TaRH5的表達(dá)量呈持續(xù)升高趨勢(shì)，均在-25 ℃時(shí)達(dá)到最大值，顯著高5 ℃、0 ℃和-10 ℃的表達(dá)量。TaRH10-1和TaRH35的表達(dá)量在各溫度間無(wú)顯著差異。7個(gè)小麥DEAD-box基因中，TaRH10-2對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)較為明顯，在-25 ℃時(shí)的表達(dá)量最高，約為5 ℃時(shí)表達(dá)量的125倍。

*、**、***和****分別表示基因間的表達(dá)量在 0.05、0.01、 0.001和0.0001水平上差異顯著。*,**,*** and **** indicate significant differences between genes at 0.05,0.01,0.001 and 0.0001 levels.圖6 低溫脅迫下Dn1和Dn2的葉片和分蘗節(jié)中DEAD-box基因的表達(dá)模式分析Fig.6 Expression patterns of DEAD-box in leaves and tillering nodes of Dn1 and Dn2 under cold stress

3 討 論

3.1 DEAD-box解旋酶進(jìn)化關(guān)系分析

從種間進(jìn)化樹分析看，小麥與水稻DEAD-box解旋酶的親緣性高于擬南芥，且種間共線性分析發(fā)現(xiàn)，小麥與水稻DEAD-box基因存在共線性的數(shù)量遠(yuǎn)多于小麥與擬南芥DEAD-box基因存在共線性的數(shù)量。原因可能是單子葉與雙子葉植物在DEAD-box解旋酶進(jìn)化過(guò)程中存在進(jìn)化差異。種間進(jìn)化樹同一組內(nèi)均存在三物種的DEAD-box解旋酶，說(shuō)明DEAD-box解旋酶在單子葉與雙子葉分化之前就已經(jīng)存在[20]。從種內(nèi)進(jìn)化樹分析看，TaRH9-1、TaRH9-2和TaRH2基因在進(jìn)化分支上相近，TaRH47B和TaRH3-4基因在進(jìn)化分支上相近，推測(cè)它們具有相似的分子 功能。

3.2 小麥DEAD-box解旋酶結(jié)構(gòu)分析與功能 預(yù)測(cè)

DEAD-box RNA解旋酶幾乎參與所有RNA代謝活動(dòng)[21]，根據(jù)其參與RNA代謝的種類和行使功能的空間定位可以大致判斷其分子功能。另外，DEAD-box RNA解旋酶在進(jìn)化中保持高度的保守性[1]。DEAD-box RNA解旋酶的功能依賴于其高度保守的核心基序組成與排列，在不同物種間DEAD-box RNA解旋酶的功能具有較高的相似性，在同源物種間該相似性更為明顯。

從結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，本研究中所有小麥DEAD-box蛋白均有其特征性結(jié)構(gòu)域DEAD和Helicase C，部分DEAD-box解旋酶含有特殊結(jié)構(gòu)域，如TaEIF4A2C和TaRH35含有C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域，TaRH41含有HIT鋅指結(jié)構(gòu)域。而鋅指結(jié)構(gòu)域能夠提高解旋酶RNA結(jié)合活性[22]，并提高植株非生物脅迫抗性[23]。推測(cè)這3個(gè)DEAD-box蛋白也參與逆境脅迫。本研究還發(fā)現(xiàn)，TaRH3與TaRH7均含有GUCT結(jié)構(gòu)域。而小立碗蘚中含有GUCT結(jié)構(gòu)域的DEAD-box解旋酶可調(diào)控孢子體和配子體發(fā)育[24]，此外，擬南芥中TaRH7基因缺失會(huì)導(dǎo)致擬南芥配子體發(fā)育畸形，抑制種子萌發(fā)[8]。由此推測(cè)，小麥中TaRH3與TaRH7基因也可能具有相似功能。

從核心基序分析發(fā)現(xiàn)，本研究中大多數(shù)小麥DEAD-box解旋酶主要由motif Q、motif I、motif Ia、motif Ib、motif II、motif III、motif IV、motif V、motif VI九個(gè)核心基序組成，部分DEAD-box解旋酶存在部分核心基序缺失的現(xiàn)象。如TaEIF4A3缺乏motif I和motif IV，TaRH38缺乏motif Ib和motif VI，TaRH39缺乏motif IV，TaRH50缺乏motif VI。DEAD結(jié)構(gòu)域中的motif Q和motif I、motif II可能參與ATP結(jié)合和水解；motif III可能與ATP水解和解旋酶活性的偶聯(lián)有關(guān)；motif V可能通過(guò)糖-磷酸基骨架與底物結(jié)合，并與NTP相互作用；motif VI可能與ATP磷酸鹽的結(jié)合有關(guān)，而這種基序功能的喪失與某些DEAD-box蛋白的ATP水解功能受損有關(guān)；motif Ia、motif Ib、motif IV可能參與核酸結(jié)合誘導(dǎo)的ATP水解[25-26]。由此猜測(cè)，部分DEAD-box解旋酶缺失的基序可能引起相應(yīng)的分子功能缺失，或由其他基序彌補(bǔ)其分子功能。

3.3 小麥DEAD-box RNA解旋酶參與冬小麥抵抗低溫脅迫

對(duì)冬小麥分蘗節(jié)和葉片的7個(gè)DEAD-box基因進(jìn)行qRT-PCR定量分析，發(fā)現(xiàn)不同品種和不同組織中DEAD-box基因的表達(dá)模式隨溫度的變化差異較大，其中葉片中DEAD-box基因?qū)Φ蜏氐捻憫?yīng)比分蘗節(jié)更為強(qiáng)烈，如Dn1葉片中TaRH10-2基因在-10 ℃時(shí)的表達(dá)量約為5 ℃時(shí)表達(dá)量的85倍，Dn2葉片中TaRH10-2基因在-25 ℃時(shí)的表達(dá)量約為5 ℃時(shí)表達(dá)量的125倍，遠(yuǎn)高于分蘗節(jié)中TaRH10-2基因的表達(dá)量變化幅度，這可能是由于葉片組織在地上部，會(huì)受到低溫和風(fēng)干缺水的雙重影響[11,17-19]，而分蘗節(jié)在地下，受土壤層的保護(hù)，在一定程度上地下溫度會(huì)略高于地上溫度，受風(fēng)干失水的影響較小，因此，葉片對(duì)低溫脅迫的敏感性比分蘗節(jié)更強(qiáng)。不同品種中DEAD-box基因家族成員對(duì)冷脅迫的響應(yīng)速度不同。如Dn1中DEAD-box基因家族表達(dá)量峰值普遍在-10 ℃，而Dn2的DEAD-box基因家族表達(dá)量峰值普遍在-25 ℃，響應(yīng)冷脅迫基因激活時(shí)間的差異可能會(huì)對(duì)不同冬小麥品種抗寒能力與植株生理長(zhǎng)勢(shì)產(chǎn)生影響。

總之，鑒于小麥DEAD-box基因的多樣性和重要功能，對(duì)小麥DEAD-box基因家族進(jìn)行系統(tǒng)的功能研究十分必要。本研究為小麥DEAD-box基因功能的解析奠定了基礎(chǔ)，對(duì)進(jìn)一步了解多倍體植物DEAD-box基因的特點(diǎn)，挖掘優(yōu)異抗低溫基因資源，培育作物抗低溫新品種，具有重要的理論和實(shí)踐意義。