洪晨忱，姚峰

0 引言

據(jù)國際癌癥研究機構統(tǒng)計，2020年女性乳腺癌已超越肺癌成為全球最常見的癌癥，約有230萬新發(fā)病例，占所有癌癥新發(fā)病例的11.7%。在2020年度的癌癥死亡主要原因中女性乳腺癌僅次于肺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胃癌排名第五位[1]。腫瘤浸潤性淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocytes,TILs）是一種浸潤腫瘤組織的淋巴細胞群體，乳腺癌中的TILs主要包含T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞（natural killer cell,NK）等免疫型細胞，TILs按分布位置可以分為腫瘤內(nèi)TILs（intratumoral tumor infiltrating lymphocytes,iTILs）和間質(zhì)TILs（stromal tumor infiltrating lymphocytes,sTILs）。多項研究表明，相比iTILs，sTILs數(shù)量更多，更易于觀察測量，且重復性和穩(wěn)定性更好，更有研究意義，因此國際免疫生物標志物協(xié)作組推薦以 sTILs作為試驗研究和臨床應用的主要指標[2]。體外研究證實了從乳腺癌組織中分離出的TILs對腫瘤具有殺傷作用[3-5]，CD8（+）和CD4（+）T細胞在識別獨特的腫瘤抗原中也發(fā)揮著作用[2-5]。目前需要進一步明確TILs與乳腺癌的預后及免疫治療的關系。

研究表明，TILs 更常見于三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）和HER2+乳腺癌[6]，且高水平TILs與TNBC和HER-2過表達型乳腺癌的良好預后相關[7]，但TILs與Luminal型乳腺癌之間的預后關系尚存在爭議[3,6,8]。因此，本文擬綜述TILs在不同分子分型乳腺癌中的基礎研究進展和臨床應用現(xiàn)狀，評估TILs對乳腺癌預后判斷及臨床免疫治療的價值。

1 乳腺癌中TILs的特征及檢測進展

T淋巴細胞是TILs中占比最高的淋巴細胞，高達75%。目前研究表明，TILs是影響乳腺癌預后的關鍵因素之一，而CD8（+）T細胞是TILs影響乳腺癌預后的關鍵因素[2]。主要原因在于CD8（+）TILs包含組織駐留記憶T細胞（tissue-resident memory T,TRM）亞群，TRM細胞在外周免疫監(jiān)測和病毒免疫中發(fā)揮重要作用[9]，且TRM細胞水平較高的晚期乳腺癌患者對免疫治療的反應率也更高[4]。另有研究表明，TILs中的B細胞也對乳腺癌的臨床結(jié)局有一定影響[10]，這很可能與TILs中的B細胞水平及其空間分布有關，TILs中的B細胞分布越分散，則預后越好；分布越局限，則預后越差[11]。NK細胞由于數(shù)量極少，對預后的影響幾乎可以忽略不計[5]。

檢測TILs通常采用的方法是將組織切片進行蘇木精-伊紅（HE）染色，再通過不同淋巴細胞的典型特征或免疫組織化學（immunohistochemistry,IHC）進一步區(qū)分[12]?，F(xiàn)階段多重免疫組織化學（multiplex immunohistochemistry,mIHC）也被應用于TILs檢測，實現(xiàn)在單一組織切片上同時檢測多個抗體，進而對不同TILs亞群進行識別與定位[13]。此外，組織芯片或組織微陣列技術（tissue microarray,TMA）、基于多光子顯微技術（multiphoton microscopy,MPM）的腫瘤浸潤淋巴細胞評分法（tumor-infiltration lymphocyte score,TILs-score）等新技術也在逐步發(fā)展、成熟過程中，新技術借助計算機輔助完成對TILs的檢測，可以有效減少染色和其他人為操作對結(jié)果的影響[14]。

2 TILs對于不同分子分型乳腺癌預后的影響

根據(jù)雌激素受體（estrogen receptor,ER）、孕激素受體（progesterone receptor,PR）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor,HER-2）的表達情況，可將乳腺癌分為四種分子亞型：Luminal A型、Luminal B型、HER-2過表達型和Basal-like型，其中Luminal B型又可依據(jù)HER-2狀態(tài)分為Luminal B（HER2+）型和Luminal B（HER2-）型[15]。其中TNBC和HER2+乳腺癌中TILs浸潤水平更高[6]。

Kolberg-Liedtke等[16]在前瞻性WSG PLANB試驗中比較了2 517例HER2-的中等風險早期乳腺癌（early breast cancer,EBC）患者TILs水平與無病生存期（disease-free survival，DFS）的關系，結(jié)果顯示在TNBC中高TILs水平患者的DFS顯著高于中等TILs水平的患者，雖然低TILs水平的患者DFS也高于中等TILs患者，但僅有臨界意義；Luminal-HER2-的患者TILs水平與DFS無關聯(lián)。Denkert等[7]研究了3 771例接受新輔助化療的原發(fā)性乳腺癌患者TILs水平與DFS和總生存期（overall survival,OS）之間的關系，結(jié)果提示TILs水平與TNBC患者的DFS和OS、HER2+患者的DFS正相關，與HER2+患者的OS以及Luminal-HER2-乳腺癌的DFS無關聯(lián)，但與Luminal-HER2-乳腺癌的OS負相關，即低TILs水平與Luminal-HER2-乳腺癌預后改善有關。Criscitiello等[17]對987例早期ER+且HER2-乳腺癌的單機構病例隊列進行了回顧性分析，TILs設為連續(xù)變量，主要結(jié)果是遠端無病生存期（distant disease-free survival,DDFS），在單因素Cox回歸分析中，TILs表達與DDFS無關；在接受輔助化療（adjuvant chemotherapy）的患者中，高TILs與更好的DDFS相關。

以上研究顯示，TILs水平對不同分子亞型乳腺癌預后的影響不同。對于TNBC及HER-2過表達型乳腺癌，高TILs預示著良好預后。對于Luminal型乳腺癌，TILs水平與Luminal-HER2+的預后正相關，與Luminal-HER2-的DFS無關但與OS負相關，即低TILs水平與Luminal-HER2-乳腺癌良好預后相關。

此外，Denkert等[7]對6個新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy,NAC）隨機試驗中接受治療的乳腺癌患者的TILs綜合評估顯示：在所有乳腺癌亞型中TILs水平與病理完全緩解率（pathologic complete response,pCR）都顯著正相關，即NAC前穿刺活檢標本中TILs水平越高，化療后pCR率越高，這說明TILs可增加乳腺癌NAC的反應。Wang等[18]對13 100例患者的TILs與化療pCR率及生存結(jié)局的關系進行Meta分析表明，高TILs水平與較長的DFS和OS顯著相關，TILs水平的增加預示著化療的pCR率和生存率的提高。在TNBC中，高水平TILs對pCR率的改善更為明顯[19]?；赥ILs對于乳腺癌預后判斷的重要價值，中國臨床腫瘤學會（CSCO）2022年乳腺癌診療指南建議，對于未經(jīng)新輔助治療的乳腺浸潤性癌患者，病理學報告應新增對TILs的評估。推薦報告腫瘤區(qū)域間質(zhì)部分TILs（%），即單個核細胞浸潤的面積占間質(zhì)面積的百分比，且僅評估單核細胞（淋巴細胞和漿細胞），暫不建議對粒細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞進行定量評估[20]。

3 TILs用于乳腺癌的免疫治療

癌癥的免疫治療是指通過激活人體本身的免疫系統(tǒng)，使機體依靠自身免疫機制殺滅癌細胞。程序性死亡配體1（programmed cell death-ligand 1,PD-L1）是一種腫瘤細胞表面的跨膜蛋白，程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1,PD-1）是一種由活化的T淋巴細胞表達的抑制性蛋白，PD-L1通過與PD-1結(jié)合來下調(diào)抗癌免疫反應，從而減少癌細胞凋亡并增加免疫逃逸。靶向PD-1/PD-L1的免疫療法，即免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors,ICIs），主要通過阻斷 PD-1與PD-L1的結(jié)合，誘導癌細胞凋亡并破壞免疫逃逸系統(tǒng)，達到殺傷腫瘤的目的[21]。TONIC試驗[22]和KEYNOTE-355試驗[23]驗證了抗PD-1或抗PD-L1的單抗對于TNBC治療的有效性，3期IMPassion130試驗[24]則表明，在轉(zhuǎn)移或局部晚期TNBC患者的一線治療中加入抗PD-L1的阿替利珠單抗（atezolizumab）和標準化療（白蛋白紫杉醇），可使PD-L1陽性腫瘤患者的總生存期延長7個月。這些研究顯示了ICIs在TNBC治療領域的巨大前景。隨著抗PD-1的帕博利珠單抗（pembrolizumab）、抗PD-Ll的阿替利珠單抗等ICIs陸續(xù)出現(xiàn)，免疫治療正在改變TNBC的治療格局，迄今為止在許多國家阿替利珠單抗已被批準用于晚期TNBC的治療，2021年帕博利珠單抗也在美國獲批用于TNBC的治療[25]。

TILs與PD-L1的檢測及ICIs療效的評估密切相關，IMPassion130試驗證明TILs水平可以預測PD-L1陽性腫瘤患者的ICIs療效[24]。在2021年美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡 (National Comprehensive Cancer Network,NCCN）第4版乳腺癌指南中建議，對擬使用阿特珠單抗聯(lián)合白蛋白紫杉醇的TNBC患者進行TILs上PD-L1表達的檢測，并將PD-L1陽性表達的閾值界定為≥1%[26]。近期研究表明許多腫瘤對ICIs無反應與缺乏TILs浸潤有關。通過刺激TILs浸潤將這些免疫“冷”腫瘤轉(zhuǎn)化為“熱”腫瘤，可以使癌細胞對ICIs產(chǎn)生反應的概率增加。而通過誘導炎性反應細胞凋亡來增加自身抗原的釋放和局部免疫反應可以有效增加TILs浸潤，是一種尚在被探索的方式[27]。

TILs應用于乳腺癌的免疫治療還存在另外一條途徑，即細胞免疫療法（cellular immunotherapy,CI），是一種基于將免疫細胞提取、修飾和再注入患者體內(nèi)的全新治療方式，有望揭開癌癥治療的新篇章[28]。目前尚在研究階段，還未應用于臨床。過繼細胞療法（adoptive cell therapy,ACT）和樹突狀細胞（dendritic cell,DC）免疫療法是乳腺癌的兩種主要CI類型，TILs是ACT的主要工程細胞之一[29]。實驗證明從乳腺癌樣本中提取并擴增的TILs在體外對自體腫瘤細胞有顯著殺傷效果[30]。目前乳腺癌CI的重點在于尋找和驗證可靠的腫瘤特異性靶點，需綜合考慮靶點的抗原性、有效性和安全性，規(guī)避脫靶效應和細胞因子風暴可能帶來的嚴重不良反應，以實現(xiàn)精準殺傷癌細胞[29]。

4 總結(jié)與展望

對于TNBC及HER-2過表達型乳腺癌，高TILs預示著良好預后；對于Luminal型乳腺癌，高TILs水平與Luminal-HER2+的良好預后相關，低TILs水平與Luminal-HER2-乳腺癌良好預后相關，目前還沒有明確的生物學解釋來闡明產(chǎn)生這種差別的原因。TILs可增加乳腺癌細胞對NAC的反應，值得強調(diào)的是，在所有乳腺癌亞型中TILs水平與pCR率都顯著正相關?；赥ILs對于乳腺癌預后判斷的重要價值，中國臨床腫瘤學會（CSCO）2022年乳腺癌診療指南建議，對于未經(jīng)新輔助治療的乳腺浸潤性癌患者，病理學報告應新增對于TILs的評估。而通過調(diào)整乳腺癌的TILs浸潤水平從而改善預后，加強癌細胞對NAC的反應，可以成為一種新的研究思路。此外，TILs在內(nèi)分泌治療隊列中的預后價值也是相當值得探索的。

TILs最常見的檢測方式為H&E染色，再通過不同淋巴細胞的典型特征或IHC、mIHC來進一步區(qū)分，mIHC作為基于IHC發(fā)展的新技術，可以實現(xiàn)單一組織切片上同時檢測多個抗體，進而實現(xiàn)不同TILs亞群的識別與定位。TMA、基于MPM的TILs評分法等新技術也在逐步發(fā)展、成熟過程中，借助計算機輔助完成對TILs的檢測可以有效減少染色和其他人為操作對結(jié)果的影響。

阿替利珠單抗的應用是TNBC精準治療的重要里程碑，TILs與PD-L1的檢測及ICIs療效的評估密切相關。通過增加TILs浸潤從而增加ICIs療效尚在實驗室驗證階段，患者對治療的耐受性和并發(fā)的自身免疫性疾病是主要考慮的問題。細胞免疫療法是免疫治療的新途徑，TILs是ACT的主要工程細胞之一，尋找和驗證可靠的腫瘤特異性靶點是目前ACT的重點所在，以期精準殺傷癌細胞的同時最大程度降低對正常細胞的傷害，給患者帶來更大受益。