李銳婷，李麗云，孫文強(qiáng)，丁江生

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；3.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111)

疼痛是最常見的臨床癥狀之一，全球近三分之一的人口深受疼痛困擾，特別是慢性疼痛，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和工作效率。草烏甲素為毛茛科烏頭屬植物龍頭烏頭(AconitumLongtounenseT.L.Ming)提取分離出來的二萜雙酯生物堿，又叫滇西嘟拉堿甲(bulleyaconitine A)。草烏甲素是我國20世紀(jì)80年代自主研發(fā)的新型第三類鎮(zhèn)痛藥物，不具有耐受性和成癮性，鎮(zhèn)痛作用分別是嗎啡的65倍和阿司匹林的7 000倍，臨床上已廣泛用于治療關(guān)節(jié)痛和神經(jīng)病理性疼痛、癌癥晚期疼痛等[1-2]。目前，草烏甲素已上市的劑型有注射劑、片劑和膠囊。草烏甲素因藥效強(qiáng)，毒性大，對黏膜、肌肉等組織具有較強(qiáng)的刺激性，注射給藥時(shí)局部會(huì)產(chǎn)生劇烈疼痛，使用不方便，口服時(shí)首過效應(yīng)明顯，生物利用度低，胃腸道反應(yīng)較明顯[3]。

微針(microneedle)是指直徑小于幾十微米、長度為25～2000 μm 的針狀結(jié)構(gòu)[4]，通過刺穿皮膚角質(zhì)層進(jìn)行透皮給藥，基本不產(chǎn)生皮膚損傷和疼痛感。可溶性微針(dissolving microneedle，DMN)是微針中的一類，由水溶性高分子材料制備而成，具有給藥效率高、安全性好、生物相容性好等優(yōu)勢[5]，現(xiàn)已廣泛用于多種藥物的經(jīng)皮給藥研究。本文選取草烏甲素為模型藥物，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選微針的處方及制備工藝，以期獲得具有鎮(zhèn)痛作用的草烏甲素可溶性微針，并對微針的表觀、機(jī)械強(qiáng)度、體外釋放、穩(wěn)定性等進(jìn)行研究。

1 儀器與材料

1.1 材料 草烏甲素(昆明制藥集團(tuán)有限公司，批號：20140518)；透明質(zhì)酸(HA，華熙福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司，批號：1906173)；聚乙烯基吡咯烷酮(PVP K30，博愛新開源醫(yī)療科技集團(tuán)股份有限公司，批號：C200210012)；聚乙烯醇1788型(PVA，美國阿拉丁，批號：G1509033)；次甲基藍(lán)(上海試劑一廠，批號：20161018)；乙醇為分析醇，乙腈為色譜純，水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

1.2 主要設(shè)備及儀器 低速離心機(jī)(TD5A-WS，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；真空干燥箱(BPZ-6210LC，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；電子天平[1225020258，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；電子天平(EX 125 ZH，奧豪斯儀器有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9145A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；高效液相色譜儀(Agilent 1260，美國Agilent公司)；可調(diào)移液器(16018203，德國賽多利斯)；數(shù)顯推拉力計(jì)(HF-50，溫州市海寶儀器有限公司)；測搖式測試臺(HCS-500，溫州市海寶儀器有限公司)；透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀(TK-12D，上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司)；微針模具(ST-05，新加坡Micropoint Technologies)；體視顯微鏡(M205C，德國徠卡公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD小鼠，體重200～240 g，雄性，北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK (京) 2019-0008，合格證號：1103221911011030。

2 方法與結(jié)果

2.1 微針的制備

2.1.1 基質(zhì)填充方法篩選 采用模具分層澆筑法制備可溶性微針，主要分為兩步，第一步：將含藥物的基質(zhì)填充至模具針尖部分，除去模具表面多余的針尖基質(zhì)，干燥1 h；第二步：填充背襯基質(zhì)，干燥固化即得微針。本試驗(yàn)開展了離心法和真空法填充基質(zhì)的對比研究。

采用離心法填充基質(zhì)時(shí)，在3 000～4 000 r·min-1條件下離心10～20 min下，基質(zhì)溶液能充分進(jìn)入模具針尖部分，干燥后制得的微針陣列針形完整，且無大量氣泡產(chǎn)生；采用真空法填充基質(zhì)時(shí)，抽真空至10 Pa，當(dāng)基質(zhì)濃度較高時(shí)，抽真空會(huì)使基質(zhì)產(chǎn)生大量氣泡，致使基質(zhì)溶液不能完全進(jìn)入模具針尖部分，制得的樣品針尖不完整。

因此，制備可溶性微針時(shí)采用離心法(3 500 r·min-1，10 min)對基質(zhì)溶液進(jìn)行填充。

2.1.2 基質(zhì)的篩選

2.1.2.1 單一基質(zhì)的篩選 根據(jù)材料的力學(xué)特性，將基質(zhì)材料分為韌性材料和脆性材料。通常，韌性材料具有較佳的韌性、可塑性，制備的可溶性微針不易碎裂，但機(jī)械強(qiáng)度不足，無法刺入皮膚給藥；脆性材料具有較強(qiáng)的硬度，不易發(fā)生形變，制備微針的機(jī)械強(qiáng)度佳，但給藥時(shí)易碎裂。本研究對多種常用制備可溶性微針的基質(zhì)如PVA、PVP K30、HA、CMC-Na、HPMC等進(jìn)行篩選，判斷其力學(xué)特性，并對其制備微針的情況進(jìn)行研究。

單一基質(zhì)的篩選結(jié)果如表1所示，脆性材料中HA(分子量為7 kDa)、PVP K30、PVP K90制備可溶性微針的成型性、機(jī)械強(qiáng)度較佳；韌性材料中PVA、HPMC制備可溶性微針的成型性、韌性較佳。胡霞[6]研究表明，PVP K90 在高濃度(160 mg·mL-1)時(shí)具有一定的細(xì)胞毒性，而本研究中PVP K90制備微針的濃度為200～300 mg·mL-1，因此選擇PVP K30、HA(低分子量)作為針尖基質(zhì)與韌性材料PVA、HPMC進(jìn)行復(fù)合基質(zhì)的篩選。

表1 多種材料制備可溶性微針的情況

2.1.2.2 復(fù)合基質(zhì)的篩選 為得到機(jī)械強(qiáng)度良好、韌性較佳的可溶性微針，本研究將篩選出的脆性材料和韌性材料相結(jié)合，篩選制備可溶性微針的最佳復(fù)合基質(zhì)，結(jié)果如表2所示。

表2 復(fù)合基質(zhì)的制備微針的情況

結(jié)果表明，將PVP K30和HA(7 kDa分子量)混合配成濃度為0.3 g·mL-1的溶液作為針尖基質(zhì)，濃度為15%PVA作為背襯基質(zhì)時(shí)制備的微針機(jī)械強(qiáng)度良好、韌性較佳。

2.1.2.3 基質(zhì)比例及濃度篩選 根據(jù)復(fù)合基質(zhì)的篩選結(jié)果，對針尖基質(zhì)HA和PVP K30的比例進(jìn)行研究。對HA∶PVP K30的重量比例1∶9、2∶8、4∶6、6∶4進(jìn)行考察，根據(jù)微針貼片的完整度、機(jī)械強(qiáng)度選擇HA∶PVP K30為2∶8、4∶6、6∶4作為正交試驗(yàn)中針尖基質(zhì)比例的三水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。在分析過程中，多組間的數(shù)據(jù)比較處理采用One-way ANOVA方法進(jìn)行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.1.3 溶劑種類及濃度的篩選 不同的溶劑對微針的成型性、機(jī)械強(qiáng)度、藥物分布等有不同的影響。因草烏甲素不溶于水，易溶于乙醇、乙醚、稀鹽酸等。為避免制備過程中殘留的溶劑在給藥過程中損害人體健康，本研究選擇毒性較小的乙醇作為溶劑，且乙醇能有效抑制微針中藥物向背襯層擴(kuò)散[7]。分別考察了35%、45%、60%、75%的乙醇溶液對微針成型性的影響，結(jié)果表明，微針的成型性、機(jī)械強(qiáng)度隨乙醇濃度的升高而降低，因此選擇溶劑乙醇濃度35%、45%、60%作為正交試驗(yàn)的三水平。

2.1.4 干燥溫度的篩選 微針貼片制備過程中，干燥溫度會(huì)影響微針的成型性、機(jī)械強(qiáng)度、制備周期等。溫度過高時(shí)，干燥過程中容易產(chǎn)生氣泡，且制備的微針貼片較脆、易碎；溫度低容易造成干燥時(shí)間長、延長了制備周期。本試驗(yàn)對干燥溫度25、35、45、55 ℃進(jìn)行考察，結(jié)果表明隨干燥溫度的升高微針的完整度、機(jī)械強(qiáng)度會(huì)降低，但25 ℃時(shí)所需干燥時(shí)間過長。因此選擇35、45、55 ℃作為正交試驗(yàn)中干燥溫度的三水平。

2.1.5 正交試驗(yàn) 根據(jù)篩選結(jié)果，采用L9(34)正交試驗(yàn)，對針尖基質(zhì)HA∶PVP K30比例(A)、干燥溫度(B)、溶劑濃度(C)進(jìn)行考察，以微針表征、機(jī)械強(qiáng)度、易脫模程度、干燥時(shí)間等綜合評分為標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)(見表3)，自制評分標(biāo)準(zhǔn)見表4，正交結(jié)果見表5，方差分析見表6。

表3 L9 (34)正交設(shè)計(jì)

表4 可溶性微針的評分標(biāo)準(zhǔn)

表5 制備空白微針的正交試驗(yàn)安排與結(jié)果

表6 微針綜合評分方差分析結(jié)果

極差分析顯示，各因素中針尖基質(zhì)比例(A)對微針的綜合評分影響最大，因素影響順序?yàn)锳>C>B。方差分析顯示，因素A對微針的綜合評分具有顯著性影響(P<0.05)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得出，制備可溶性微針的最佳工藝處方為 A2B1C2，即針尖基質(zhì)HA∶PVP K30=4∶6，干燥溫度35 ℃，溶劑濃度為45%。

2.1.6 草烏甲素可溶性微針的制備 根據(jù)篩選的最佳處方，將草烏甲素原料藥與針尖基質(zhì)(HA∶PVP K30=4∶6)溶解混合，制成載藥量為150、100、70 μg的草烏甲素可溶性微針。

2.2 微針的質(zhì)量評價(jià)

A.測量微針貼片的大??；B.微針貼片；C.顯微鏡下的微針照片圖1 草烏甲素可溶性微針的表觀

2.2.2 微針機(jī)械強(qiáng)度

2.2.2.1 穿刺試驗(yàn) 將鋁箔平鋪，草烏甲素可溶性微針針尖向下放置，在一定壓力下按壓，觀察微針穿刺鋁箔的孔隙率和穿刺后微針的形態(tài)，鋁箔紙厚約24 μm。取脫毛處理后的離體豬皮膚，用含次甲基藍(lán)的微針穿刺豬皮，醫(yī)用膠布固定，處理5 min后除去微針貼片，觀察皮膚表面及微針的形態(tài)。

穿刺結(jié)果如圖2所示，草烏甲素可溶性微針可刺穿鋁箔，在鋁箔上留下完整的穿刺孔道，穿刺后微針基本保持完整，針尖部分出現(xiàn)略微彎曲情況；離體豬皮上，微針形成了與微針陣列相一致的點(diǎn)狀分布，表明微針機(jī)械強(qiáng)度良好，可順利穿刺皮膚。

A.微針貼片穿刺鋁箔的正面；B.微針貼片穿刺鋁箔的背面；C.含次甲基藍(lán)的微針貼片刺穿豬皮圖2 可溶性微針貼片刺穿鋁箔、豬皮的情況

2.2.2.2 壓力-位移研究 本實(shí)驗(yàn)室自行組裝對微針機(jī)械強(qiáng)度進(jìn)行測試的儀器，將數(shù)顯推拉力計(jì)(HF-50)固定在側(cè)搖式測試臺(HCS-500)上，通過手搖測試臺實(shí)現(xiàn)拉力計(jì)的上下運(yùn)動(dòng)，根據(jù)微針在不同壓力下的位移情況考察微針的機(jī)械強(qiáng)度。測試時(shí)選用直徑為5 mm的探頭，勻速下降，壓力與位移的曲線圖如圖3所示，當(dāng)位移達(dá)550 μm時(shí)，每針承受的力達(dá)0.222 N，壓力移除時(shí)大部分微針針型完整，表明機(jī)械強(qiáng)度良好。

圖3 操作示意圖及位移-壓力曲線圖

2.2.3 微針的體外溶解釋放情況 將含量為70 μg草烏甲素可溶性微針溶解于10 mL 35%的乙醇中，分別在0.5、1、2、4、5、6、8 min取樣0.8 mL并立即補(bǔ)充相同體積的新鮮溶液。樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，HPLC法測定藥物釋放量，HPLC法測定草烏甲素的色譜條件根據(jù)《中國藥典》[8]規(guī)定進(jìn)行。結(jié)果表明，草烏甲素可溶性微針在35%的乙醇溶液中8 min時(shí)釋放量達(dá)98.83%，釋放曲線如圖4所示。

圖4 草烏甲素可溶性微針在體外的溶解釋放情況

2.3 微針體外透皮釋放情況 取健康SD小鼠，脫頸椎處死，小心去除腹部的毛，剝離皮膚，用手術(shù)刀刮去皮下組織，并用異丙醇多次擦拭去除剩余的皮下脂肪和筋膜，用生理鹽水反復(fù)清洗，濾紙吸干水分，-20 ℃的冰箱中保存。

取直立式雙室Franz擴(kuò)散池(擴(kuò)散面積為1.766 cm2，接收池容積為7 mL)進(jìn)行微針(載藥量為70 μg)體外透皮釋放研究，考察不同比例的生理鹽水-無水乙醇接收液中草烏甲素可溶性微針中藥物體外透皮情況。微針貼片貼在處理過的皮膚上，拇指持續(xù)按壓2 min，醫(yī)用膠帶固定后，將皮膚夾在擴(kuò)散池的供體室和接收池之間，用角質(zhì)層側(cè)與接收溶液接觸，排盡皮膚下的空氣，蓋上固定蓋，用夾子固定好避免漏液，磁力攪拌速度設(shè)定為500 r·min-1，(37.0±0.5)℃恒溫水浴。通過取樣針在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)(0.5、1、2、4、8、12、24、36、48 h)取樣0.8 mL并立即補(bǔ)充相同體積的新鮮接收液。樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，HPLC法測定藥物滲透量。根據(jù)下列公式1計(jì)算單位面積累積滲透量，考察不同接收液中載藥微針的釋放情況，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取5份樣品藥物釋放量的平均值，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同接收液中草烏甲素體外透皮的單位面積累積滲透量情況(n=5)

(公式1)

Qn為第 n 個(gè)取樣點(diǎn)草烏甲素的單位面積累積滲透量(μg·cm-2)，Cn為第 n 個(gè)取樣點(diǎn)草烏甲素的濃度(μg·mL-1)，Ci為第i個(gè)取樣點(diǎn)樣品中草烏甲素的濃度(μg·mL-1)，S為擴(kuò)散池截面積(cm2)，V0為接受室體積(mL)，V為取樣體積(mL)。

結(jié)果表明，草烏甲素可溶性微針的體外透皮釋放在24 h內(nèi)藥物的釋放量達(dá)到較高水平，然后慢慢趨于平穩(wěn)。草烏甲素可溶性微針在接收液40%生理鹽水+60%無水乙醇中釋放量最高，24 h時(shí)釋放率達(dá)84.67%，單位面積累積滲透量為33.56 μg·cm-2；48 h時(shí)釋放率達(dá)96.41%，單位面積累積滲透量為38.22 μg·cm-2。

對草烏甲素可溶性微針體外釋放量最高的曲線進(jìn)行3種釋放模型擬合，結(jié)果如表7所示，從數(shù)據(jù)可以看出，一級方程的R2值為0.997 2 ，為3種擬合方程中最高的，由此可見草烏甲素可溶性微針的體外透皮釋放符合一級方程的釋放規(guī)律。

表7 接收液4的釋放曲線在3種模型的曲線擬合

3 討論

基質(zhì)材料對微針的制備至關(guān)重要，其力學(xué)特性會(huì)影響微針的成型性、機(jī)械強(qiáng)度等。單一基質(zhì)的篩選中發(fā)現(xiàn)，同一物質(zhì)，分子量不同，材料的力學(xué)特性不同，如透明質(zhì)酸鈉(HA)基質(zhì)，當(dāng)分子量大于10 000時(shí)，材料為韌性材料，可塑性強(qiáng)；當(dāng)分子量小于10 000時(shí)，材料為脆性材料，制備的微針機(jī)械強(qiáng)度佳。

經(jīng)穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，微針在高溫環(huán)境中儲存對會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)。高溫環(huán)境中，密封儲存的草烏甲素可溶性微針會(huì)由透明狀態(tài)變?yōu)槲ⅫS色，且部分藥物會(huì)向背襯層擴(kuò)散，載藥量越高，擴(kuò)散越明顯。載藥量為150、100 μg的微針會(huì)在背襯層形成藥物聚集的白色斑點(diǎn)，載藥量為70 μg的微針在背襯層不會(huì)形成明顯的藥物聚集斑點(diǎn)。常溫環(huán)境下，密封儲存的草烏甲素可溶性微針的表征、機(jī)械強(qiáng)度基本保持不變，少量藥物會(huì)向背襯層擴(kuò)散，但不會(huì)在背襯部分形成藥物聚集的斑點(diǎn)。因此，草烏甲素可溶性微針儲存時(shí)應(yīng)避免處于高溫狀態(tài)，以免造成藥物向背襯層的流失。

微針體外透皮釋放研究中，不同的接收液中微針的體外透皮釋放情況不同。理論上接收液中無水乙醇含量越高，透皮釋放量越多，但結(jié)果卻與之有一定差異，這可能由于離體鼠皮部位的不同、角質(zhì)層厚度不同、離體皮膚的處理差異、微針貼片間載藥量存在差異等因素造成。

本研究以大分子藥物草烏甲素作為模型，采用分層澆筑法制備草烏甲素可溶性微針，因藥物處于針尖部分，因此可精確控制載藥量。正交法優(yōu)選制備微針的最佳工藝，制成的微針表征良好、針形完整，機(jī)械強(qiáng)度良好、韌性較佳，能成功刺穿鋁箔，刺入皮膚以實(shí)現(xiàn)藥物的有效滲透。草烏甲素可溶性微針作為草烏甲素的給藥新劑型，能安全、有效、快速、方便地進(jìn)行經(jīng)皮給藥，本研究能為其后續(xù)開發(fā)利用提供一定依據(jù)。