李 偉，汪禮軍，唐 鵬，黃耀凱，劉 劍

骨肉瘤是臨床上常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，多發(fā)于兒童和青少年，年發(fā)病率為百萬分之三[1]。骨肉瘤病人的5年生存率為60%～70%，當(dāng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)可降至20%～30%[2]。盡管在過去幾十年里，骨肉瘤的治療取得了很大的進(jìn)展，如廣泛腫瘤切除術(shù)、新輔助放化療等，但是病人5年生存率和無病生存率仍然較低[3]。因此尋找新的診斷及預(yù)后標(biāo)志物勢(shì)在必行。微小RNA(miRNAs)是一類高度保守的非編碼RNA，其長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸。miRNAs可與靶mRNA的3′-UTR互補(bǔ)結(jié)合，抑制基因轉(zhuǎn)錄。miRNAs在人類多種腫瘤中有異常表達(dá)，并參與細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡等生理學(xué)過程，發(fā)揮促癌或抑癌作用[4]。miR-1225-5p在骨肉瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)明顯下調(diào)。miR-1225-5p可通過靶向SOX9基因抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，提示miR-1225-5p在骨肉瘤中起到抑癌作用[5]。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-1225-5p在甲狀腺癌[6]、胰腺癌[7]和喉癌[8]等癌癥中同樣起到抑癌作用。血清miR-1225-5p對(duì)骨肉瘤病人診斷及預(yù)后的評(píng)估有何意義，既往少有報(bào)道。本研究采用RT-PCR檢測(cè)了104例骨肉瘤病人血清中miR-1225-5p的表達(dá)水平，旨在探討血清miR-1225-5p在骨肉瘤診斷及預(yù)后中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年6月至2017年6月 本院收治的104例骨肉瘤病人(骨肉瘤組)、45例 骨膜炎病人(骨膜炎組)和50名健康體檢者(對(duì)照組)為研究對(duì)象。骨肉瘤組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理組織學(xué)檢查確診為骨肉瘤；(2)術(shù)前未接受放化療或免疫治療；(3)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)資料不全；(2)失訪；(3)合并其他腫瘤疾病。3組性別和年齡均具有可比性。骨肉瘤病人于術(shù)前及術(shù)后3個(gè)月時(shí)采血，骨膜炎病人于診斷當(dāng)日采血，對(duì)照組于體檢當(dāng)日采血。采集骨肉瘤病人如下資料：性別、年齡、腫瘤部位、Enneking分期、病理分級(jí)、腫瘤直徑、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等。對(duì)骨肉瘤病人隨訪24～61個(gè)月，總生存期(overall survival，OS)定義為診斷當(dāng)日至末次隨訪或死亡。無病生存期(disease-free survival，DFS)定義為自隨訪之日起，疾病復(fù)發(fā)或由于疾病進(jìn)展導(dǎo)致病人死亡的時(shí)間[9]。本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)過倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 RT-PCR檢測(cè)血清miR-1225-5p表達(dá)水平 將外周血在 4 ℃、2 000 r/min條件下離心15 min，獲得血清。用miRcute miRNA分離試劑盒(上?？道噬锟萍加邢薰?提取總RNA。用紫外分光光度計(jì)(上海豫明儀器有限責(zé)任公司)檢測(cè)RNA濃度和純度。用TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。本研究引物均由蘇州泓迅生物科技股份有限公司設(shè)計(jì)并提供。miR-1225-5p引物：上游：5′-AGA TCG CCG TGT AAG CTA GCC TTG CGT GGA GAG CTG TAC-3′；下游：5′-GGG AGA GGG GCT TAG CTA GCA TCC GGG GAT ACC TTG GAG-3′。內(nèi)參U6 RNA引物：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′；下游：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。采用2-△△Ct法計(jì)算miR-1225-5p相對(duì)表達(dá)量[10]。以中位數(shù)為截?cái)嘀?，將骨肉瘤病人分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)；繪制ROC曲線分析miR-1225-5p診斷骨肉瘤的價(jià)值；Kaplan-Meier分析和Log-Rank檢驗(yàn)分析生存情況；采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響病人預(yù)后的因素。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤病人血清miR-1225-5p表達(dá)水平及其與臨床特征的關(guān)系 miR-1225-5p的擴(kuò)增曲線平滑，基線期、對(duì)數(shù)期、平臺(tái)期明顯，擴(kuò)增效果滿意(見圖1A)。溶解曲線呈單一峰，溶解溫度在80～90 ℃之間，說明無引物二聚體或者其他非特異性擴(kuò)增片段的產(chǎn)生，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的特異度比較高(見圖1B)。骨肉瘤組、骨膜炎組和對(duì)照組的血清miR-1225-5p相對(duì)表達(dá)量分別為(0.42±0.08)(0.58±0.11)(0.62±0.09)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=102.74，P<0.01)，兩兩比較發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組血清miR-1225-5p相對(duì)表達(dá)量均低于骨膜炎組和對(duì)照組(P<0.01)，骨膜炎組低于對(duì)照組(P<0.05)。術(shù)后3個(gè)月，骨肉瘤病人血清miR-1225-5p相對(duì)表達(dá)量從術(shù)前的(0.42±0.08)升高至(0.59±0.10)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.54，P<0.01)。骨肉瘤病人血清miR-1225-5p表達(dá)水平與Enneking分期、腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.01和P<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑和WHO骨肉瘤分類無關(guān)(P>0.05)(見表1)。

表1 骨肉瘤病人血清miR-1225-5p表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系

2.2 血清miR-1225-5p診斷骨肉瘤的價(jià)值分析 ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清miR-1225-5p診斷骨肉瘤的曲線下面積為0.785(95%CI：0.625～0.934)。當(dāng)血清miR-1225-5p相對(duì)表達(dá)量為0.46時(shí)約登指數(shù)最大，此時(shí)靈敏度和特異度分別為89.35%和71.30%(見圖2)。

2.3 血清miR-1225-5p與骨肉瘤病人臨床預(yù)后的關(guān)系分析 用Kaplan-Meier分析和Log-Rank檢驗(yàn)分析骨肉瘤病人的生存情況，結(jié)果顯示高表達(dá)組OS和DFS均高于低表達(dá)組(P<0.05和P<0.01)(見圖3、4)。COX多因素分析結(jié)果顯示，血清miR-1225-5p是影響骨肉瘤病人OS和DFS的獨(dú)立因素(P<0.05和P<0.01)(見表2)。

表2 COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響骨肉瘤病人預(yù)后的因素

3 討論

骨肉瘤是臨床上兒童、青少年最常見的惡性骨腫瘤，高發(fā)于15～19歲人群。骨肉瘤極易發(fā)生局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此病人死亡率較高[11]。骨肉瘤病人的5年生存率較低，因此亟需尋找新的生物學(xué)標(biāo)志物指導(dǎo)骨肉瘤的診治。miRNAs在骨肉瘤的診治中有重要作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，與骨膜炎病人和健康人相比，骨肉瘤病人血清miR-1225-5p表達(dá)水平明顯降低，手術(shù)治療3個(gè)月后表達(dá)水平明顯升高。另外本研究證實(shí)，miR-1225-5p在骨肉瘤的診斷及預(yù)后判斷中具有重要意義。

miR-1225-5p位于16p13.3染色體上，在甲狀腺癌、胰腺癌和喉癌等癌癥中起到抑癌作用。WANG等[6]發(fā)現(xiàn)，miR-1225-5p可以靶向去乙?；窼irtuin-3基因，通過Wnt/β-catenin通路抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和分化。ZHONG等[7]發(fā)現(xiàn)，miR-1225-5p可以通過Janus 激酶 1促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡、抑制增殖。在喉癌的研究中，SUN等[8]發(fā)現(xiàn)miR-1225-5p靶向CDC14B抑制癌細(xì)胞增殖，并使細(xì)胞周期G1/S期阻滯。TOKUHISA等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miR-1225-5p與胃癌侵襲性有關(guān)，血清外泌體對(duì)預(yù)測(cè)胃癌根治性切除術(shù)后腹膜復(fù)發(fā)有重要意義。

miR-1225-5p在骨肉瘤中作用的報(bào)道較少，并缺乏體內(nèi)研究。ZHANG等[5]發(fā)現(xiàn)，SOX9是miR-1225-5p的靶基因，沉默miR-1225-5p后骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力受到抑制。說明miR-1225-5p在骨肉瘤發(fā)生和發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。本研究采用ROC曲線分析了血清miR-1225-5p診斷骨肉瘤的價(jià)值，結(jié)果顯示miR-1225-5p診斷骨肉瘤的曲線下面積為0.785，靈敏度和特異度分別為89.35%和71.30%。我們還發(fā)現(xiàn)，血清miR-1225-5p表達(dá)水平與Enneking分期、腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，說明miR-1225-5p與骨肉瘤病情進(jìn)展有關(guān)。

miR-1225-5p與癌癥病人預(yù)后的關(guān)系既往已有報(bào)道。ZHENG等[14]發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中miR-1225-5p表達(dá)水平明顯下降，miR-1225-5p低表達(dá)組病人的總體生存率明顯低于高表達(dá)組。骨肉瘤病人的生存預(yù)后與性別、年齡、Enneking分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等因素有關(guān)[15-17]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，Enneking分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響骨肉瘤病人預(yù)后的獨(dú)立因素。我們發(fā)現(xiàn)，miR-1225-5p高表達(dá)組骨肉瘤病人的OS和DFS均高于低表達(dá)組，這是因?yàn)閙iR-1225-5p抑制了骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[5]。

本研究的局限性為：(1)樣本量相對(duì)較??；(2)未進(jìn)行miR-1225-5p的機(jī)制研究，未來需要通過細(xì)胞和動(dòng)物研究進(jìn)一步明確miR-1225-5p在骨肉瘤中的作用；(3)僅檢測(cè)了血清中miR-1225-5p的表達(dá)水平，未檢測(cè)癌組織中的表達(dá)情況。

綜上所述，本研究表明骨肉瘤病人血清中miR-1225-5p表達(dá)水平明顯低于骨膜炎病人和健康人。接受手術(shù)治療的骨肉瘤病人血清miR-1225-5p水平顯著升高。miR-1225-5p在骨肉瘤的診斷中有重要意義。此外，低血清miR-1225-5p表達(dá)水平與骨肉瘤病人的不良預(yù)后有關(guān)。