杜超，侯開波，張寧，關(guān)小川，劉星池，于月新

(中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，沈陽 110016)

近年來，不孕癥患者的數(shù)量逐年增加，根據(jù)WHO數(shù)據(jù)顯示，約15%有生育需求的夫婦受到不孕癥的困擾，其中男性因素約占不孕不育因素的50%[1]。過去很長一段時(shí)間內(nèi)，人們對(duì)男性生殖力的評(píng)估仍然依賴于傳統(tǒng)的精液分析，但仍有約15%的不育男性精液常規(guī)結(jié)果為正常[2]，這說明單純分析精子數(shù)量和活力并不能全面評(píng)估男性生育力。隨著研究的深入，精子DNA碎片指數(shù)(DFI)逐漸受到關(guān)注，有研究認(rèn)為，DFI對(duì)精子受精能力、胚胎形成和發(fā)育以及妊娠結(jié)局有著重要影響[3-4]；但也有研究認(rèn)為DFI對(duì)于男性生育力評(píng)估和輔助生殖結(jié)局預(yù)測的價(jià)值有限[5-6]。因此，本研究在嚴(yán)格控制女方因素的影響后，用精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析(SCSA)法檢測精子DFI，觀察不同DFI患者的妊娠結(jié)局，探討精子DFI對(duì)體外受精-胚胎移植(IVF-ET)妊娠結(jié)局的影響。

一、資料與方法

1.研究對(duì)象及分組：收集2016年1月至2020年12月于北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院行IVF-ET治療的不孕不育夫婦為研究對(duì)象，共納入1 079個(gè)取卵周期(1 441個(gè)移植周期)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)夫妻雙方染色體檢查均正常；(2)男方于助孕前3個(gè)月內(nèi)行DFI檢查；(3)女方促排卵方案為長方案或改良長方案。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)男方存在嚴(yán)重的少精子癥；(2)女方存在子宮畸形、宮腔粘連、內(nèi)膜過薄等不利胚胎著床因素；(3)女方存在嚴(yán)重的甲亢、甲減、糖尿病等內(nèi)分泌疾?。?4)女方存在多囊卵巢綜合征(PCOS)或卵巢功能減退等；(5)未隨訪至最終妊娠結(jié)局者。

根據(jù)DFI值將患者分為3組：A組：DFI≤15%(精子DNA完整性好)，共845個(gè)周期；B組：15%

2.精子DFI檢測：DFI的有效檢測方法主要有SCSA、單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)試驗(yàn)和精子染色質(zhì)擴(kuò)散(SCD)試驗(yàn)等[7]。本研究采用敏感性和特異性良好，并且具有高度可比性的SCSA方法進(jìn)行DFI檢測[8]。使用美國BD公司的流式細(xì)胞儀，檢測試劑盒為精子核完整性染色試劑盒(浙江星博生物)，嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。

3.促排卵及IVF：促排卵方案采用標(biāo)準(zhǔn)長方案或改良長方案，期間超聲監(jiān)測卵泡發(fā)育情況，待卵泡發(fā)育成熟后肌肉注射HCG(珠海麗珠)，36 h后B超引導(dǎo)下取卵。將男性精液采用上游法和密度梯度離心法進(jìn)行優(yōu)化處理后行IVF，受精16～18 h后觀察受精情況，常規(guī)胚胎培養(yǎng)。胚胎培養(yǎng)第3天(D3)觀察胚胎質(zhì)量。D3胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照卵裂期胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[9]：D2細(xì)胞數(shù)為2～4，D3細(xì)胞數(shù)為7～9，細(xì)胞大小相對(duì)均勻、形態(tài)相對(duì)規(guī)則、碎片<25%為優(yōu)質(zhì)胚胎。視胚胎發(fā)育情況決定是否行囊胚培養(yǎng)，囊胚評(píng)分參照Gardner評(píng)分[10]：滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評(píng)分均為A或B的囊胚為優(yōu)質(zhì)囊胚，有任一者評(píng)分為C的囊胚為非優(yōu)質(zhì)囊胚，兩者評(píng)分均為C的囊胚為不可利用囊胚。

4.胚胎移植及妊娠判斷：根據(jù)患者情況選擇新鮮胚胎移植或凍融胚胎移植，移植后行黃體支持。胚胎移植14 d后隨訪患者血HCG值，移植28 d后行超聲檢查，如宮腔內(nèi)監(jiān)測到孕囊及胎心，定義為臨床妊娠并記錄著床胚胎數(shù)，隨訪至妊娠結(jié)束。

5.觀察指標(biāo)及判斷標(biāo)準(zhǔn)：正常受精率=正常受精卵數(shù)/受精卵總數(shù)×100%；D3優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常受精數(shù)×100%；囊胚形成率=囊胚形成數(shù)/囊胚培養(yǎng)數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)囊胚率=優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)/囊胚培養(yǎng)數(shù)×100%；種植率=著床胚胎數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/所有移植周期數(shù)×100%；活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期/所有移植周期數(shù)×100%。

二、結(jié)果

1.不同DFI組患者的基本資料比較：3組患者除C組男、女方年齡顯著高于A組(P<0.05)外，其余指標(biāo)如女方體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)FSH(bFSH)、抗苗勒管激素(AMH)、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)(AFC)等均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 不同DFI組患者基本資料比較

2.取卵周期中不同年齡各DFI組患者受精及胚胎發(fā)育情況比較：為盡力消除男、女方年齡對(duì)妊娠結(jié)局的干擾，將3組患者按照女方年齡分為<35歲和≥35歲進(jìn)行分層分析。<35歲患者中，B、C組的優(yōu)質(zhì)囊胚率顯著低于A組(P<0.05)，3組間的正常受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎率無顯著性差異(P>0.05)，囊胚形成率隨DFI升高有降低趨勢(shì)，但尚無顯著性差異(P>0.05)?！?5歲患者中，C組患者正常受精率顯著低于A、B組(P<0.05)，3組患者優(yōu)質(zhì)胚胎率無顯著性差異(P>0.05)，囊胚形成率和優(yōu)質(zhì)囊胚率隨DFI升高有下降趨勢(shì)，但尚無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 取卵周期中不同年齡各DFI組胚胎發(fā)育及受精情況比較(%)

3.移植周期中不同DFI組胚胎移植情況及不同年齡各DFI組妊娠結(jié)局比較：1 079個(gè)取卵周期共進(jìn)行了1 441次胚胎移植(A組1 114個(gè)周期，B組281個(gè)周期和C組46個(gè)周期)。為了更加準(zhǔn)確地分析不同DFI組患者胚胎移植后的妊娠結(jié)局，對(duì)患者移植周期的女方年齡、平均移植胚胎數(shù)和移植日子宮內(nèi)膜厚度進(jìn)行比較，3組間均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。不同年齡各DFI組妊娠結(jié)局比較，A組患者種植率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率均有高于其余兩組的趨勢(shì)，但尚無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表3 移植周期中不同DFI組患者胚胎移植情況比較

表4 不同年齡各DFI組妊娠結(jié)局比較(%)

三、討論

近年來，男性因素在輔助生殖中的作用越來越受到人們的重視。精子非整倍體、表觀遺傳學(xué)特征、精蛋白及組蛋白等因素都可能影響胚胎質(zhì)量甚至妊娠結(jié)局[11]，精子DFI被認(rèn)為是一種評(píng)估男性生育力的有力指標(biāo)[12]。但精子DFI檢測方法眾多，加之研究人群和方法不盡相同，針對(duì)DFI的具體影響仍然存在爭論。本研究將患者按照不同DFI進(jìn)行分組，比較各組間妊娠結(jié)局的差異，探討DFI對(duì)于輔助生殖結(jié)局的影響。

研究結(jié)果顯示，當(dāng)女方年齡≥35歲時(shí)，DFI增加會(huì)顯著降低患者的正常受精率，提示在高齡患者中，DFI過高可能影響精子的受精能力。有研究表明，精子DFI與精子活力和形態(tài)存在一定相關(guān)性，這可能是導(dǎo)致其受精能力降低的主要原因[13]。3組的優(yōu)質(zhì)胚胎率并無顯著性差異(P>0.05)。隨著精子DFI升高，囊胚形成率和優(yōu)質(zhì)囊胚率有下降趨勢(shì)，但尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，這可能與樣本量相對(duì)不足有關(guān)，有待后續(xù)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量的研究。對(duì)于年齡<35歲的患者，精子DFI的升高并不會(huì)降低患者的正常受精率，但行囊胚培養(yǎng)時(shí)，DFI≤15%組患者的優(yōu)質(zhì)囊胚率顯著高于15%

本研究對(duì)患者移植周期的妊娠結(jié)局進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，不同年齡段的女性各DFI組的種植率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率并無顯著性差異(P>0.05)，提示在移植周期中，DFI的增加對(duì)患者最終妊娠結(jié)局無明顯影響。既往研究認(rèn)為，配偶精子DFI數(shù)值高的女性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)率顯著高于其配偶精子DFI數(shù)值較低者(P<0.05)[17]。但近年來也有研究得出不同結(jié)論[18-19]，Brahem等[20]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過密度梯度洗滌和上游處理后的精子DFI會(huì)顯著降低；王青欣等[21]則認(rèn)為處理后的精子在DFI和活力方面均得到明顯改善，因此洗滌前的精子DFI檢測價(jià)值有限。另外，女性卵泡的修復(fù)作用不容忽視，卵母細(xì)胞能夠在整個(gè)卵子發(fā)生過程中修復(fù)DNA損傷，并提供基因產(chǎn)物，負(fù)責(zé)修復(fù)受精后兩個(gè)親本基因組的DNA損傷[22-23]。因此，在多種復(fù)雜因素的作用下，精子DFI對(duì)最終妊娠結(jié)局的直接影響較為有限。

綜上所述，本研究通過比較不同DFI患者IVF的妊娠結(jié)局發(fā)現(xiàn)，雖然DFI對(duì)患者IVF-ET妊娠結(jié)局存在一定的影響，但其對(duì)臨床妊娠率和活產(chǎn)率等的影響較為有限。目前關(guān)于精子DFI 對(duì)IVF-ET妊娠結(jié)局的影響仍難有定論，需要多中心、更大樣本量的前瞻性研究加以探討。