劉銘赫，李巧玲，李林姣，程君生，李俊平，張 媛，彭小薇，王 楠

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 國(guó)家/OIE布魯氏菌病參考實(shí)驗(yàn)室，北京 102600)

噬菌體展示技術(shù)于1985年由George Smith首次提出[1]，1990年McCafferty成功將該技術(shù)應(yīng)用在重組抗體的生產(chǎn)中[2]。自此，基于噬菌體展示的單克隆抗體技術(shù)逐步廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥的多個(gè)領(lǐng)域，如單克隆抗體靶向藥物、免疫檢測(cè)等，該技術(shù)通過(guò)一個(gè)噬菌體顆粒將抗體的表型與基因型聯(lián)系在一起，可以相對(duì)簡(jiǎn)單快速地分離針對(duì)特定靶抗原的理想抗體分子。相較于其它單克隆抗體的制備技術(shù)，噬菌體展示技術(shù)篩選單克隆抗體的周期短、操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用范圍廣、制備數(shù)量多。

1 噬菌體展示技術(shù)

1.1 噬菌體展示技術(shù)的原理 噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白質(zhì)、多肽的編碼基因或目的基因通過(guò)基因工程技術(shù)插入到編碼噬菌體外殼蛋白的基因序列的適當(dāng)位置。在閱讀框正確且不影響噬菌體正常功能的情況下，使外源蛋白質(zhì)或多肽與噬菌體外殼蛋白融合形成融合蛋白，并隨子代噬菌體的重新組裝表達(dá)在噬菌體表面。融合蛋白保有獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，能與靶分子進(jìn)行識(shí)別和結(jié)合。噬菌體展示技術(shù)的最大特點(diǎn)就是通過(guò)噬菌體將目的蛋白與基因的克隆偶聯(lián)在一起，也在篩選過(guò)程中將重組蛋白質(zhì)的篩選與基因的篩選合二為一。

1.2 噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展 1985年，George Smith將外源蛋白片段成功地展示在噬菌體表面，并將這一方法稱(chēng)為噬菌體展示技術(shù)[1]。1989年，Lerner將噬菌體展示技術(shù)與抗體工程相結(jié)合，將鼠源抗體的抗原結(jié)合片段(Fab)的DNA序列克隆進(jìn)了噬菌體的衣殼蛋白基因中，在噬菌體表面展示了該抗體的Fab區(qū)域[3]。1990年，McCafferty和Winter通過(guò)在噬菌體表面展示免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變區(qū)基因的單鏈抗體(ScFV)的方法，篩選出了一株高特異性的噬菌體抗體[2]。在接下來(lái)的兩年里，Lerner和Winter又成功地利用噬菌體展示技術(shù)展示了人類(lèi)抗體片段[4-5]。Adalimumab是第一個(gè)依靠噬菌體展示技術(shù)研發(fā)的單克隆抗體，于2002年被美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[6]。2018年，Winter和Smith教授因在“多肽及抗體的噬菌體展示(The phage display of peptides and antibodies)”技術(shù)方面的開(kāi)創(chuàng)性工作與應(yīng)用獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)[7]。

1.3 噬菌體展示系統(tǒng)的分類(lèi)

1.3.1 絲狀噬菌體展示系統(tǒng) 絲狀噬菌體主要指具有感染革蘭氏陰性菌能力的M13、Fd和F1噬菌體，其中M13噬菌體在噬菌體展示技術(shù)中應(yīng)用最廣泛[8]。M13噬菌體為一個(gè)絲狀長(zhǎng)管結(jié)構(gòu)，一個(gè)環(huán)狀單鏈DNA基因組編碼5個(gè)外殼蛋白(pIII、pVIII、pVI、pVII和pIX)以及6個(gè)組裝和復(fù)制蛋白[9]。大多數(shù)噬菌體展示系統(tǒng)基于外殼蛋白pIII蛋白與pVIII蛋白。pVIII是M13噬菌體上主要的外殼蛋白，可與6～7個(gè)氨基酸大小的外源蛋白融合表達(dá)。而pIII的拷貝數(shù)較低但可作為表達(dá)復(fù)雜結(jié)構(gòu)的較大蛋白載體。由于絲狀噬菌體的增殖為非裂解增殖，在增殖期間不會(huì)裂解宿主菌，因此該噬菌體在實(shí)驗(yàn)淘選過(guò)程中簡(jiǎn)化了噬菌體純化的步驟，減少了實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間。但由于絲狀噬菌體的所有成分均需宿主細(xì)胞內(nèi)膜分泌轉(zhuǎn)運(yùn)，會(huì)對(duì)表達(dá)蛋白的長(zhǎng)度、序列和折疊特性有所影響[10]。

1.3.2 T4噬菌體展示系統(tǒng) T4噬菌體是肌病毒科(Myoviridae)的一種烈性噬菌體。T4噬菌體的結(jié)構(gòu)相較于絲狀噬菌體更為復(fù)雜，其由頭部、尾部和尾部纖維組成。T4噬菌體的頭部由一個(gè)細(xì)長(zhǎng)二十面體衣殼包裹著雙鏈DNA組成[11]。頭部與尾部之間通過(guò)頸部相連，尾部的蛋白質(zhì)外殼為中空的長(zhǎng)管，外面包有可收縮的尾鞘，尾部還有六根長(zhǎng)尾纖維(LTF)和六根短尾纖維(STF)分別連接到六角形底座上并折疊在底板下方[12]。T4噬菌體常用于融合展示外源蛋白的主要有高度外衣殼蛋白HOC、小外衣殼蛋白SOC、衣殼蛋白gp23、頂端蛋白gp24、門(mén)戶(hù)蛋白gp20。其中HOC和SOC兩種蛋白具有很強(qiáng)的抗原性，且這兩種蛋白發(fā)生改變也對(duì)T4噬菌體的感染性以及活性沒(méi)有太大影響，因此這兩種蛋白最常被用于融合展示外源蛋白。T4噬菌體展示系統(tǒng)的一大優(yōu)勢(shì)就是其可以在SOC和HOC兩個(gè)位點(diǎn)上展示雙重外源抗原，從而篩選出雙特異性抗體[13]。

1.3.3 T7噬菌體展示系統(tǒng) T7噬菌體是短尾病毒科(Podoviridae)的一種烈性噬菌體。T7噬菌體的頭部由一個(gè)二十面體的頭部包裹著雙鏈DNA基因組組成。頭部和尾部之間有一個(gè)環(huán)狀連接器，尾部為帶有六根纖維的短圓柱形。T7噬菌體由主要衣殼蛋白gp10A、次級(jí)衣殼蛋白gp10B、連接蛋白gp8、尾部蛋白gp11和gp12以及尾纖蛋白gp17六種主要蛋白質(zhì)組成[14]。在T7噬菌體展示系統(tǒng)中，用于展示多肽和蛋白的衣殼蛋白主要是gp10A和gp10B。該展示系統(tǒng)可以很好地適應(yīng)多肽或蛋白質(zhì)序列的變化，以高拷貝數(shù)展示多肽或蛋白質(zhì)，但隨著插入序列大小的增加，拷貝數(shù)有逐漸降低的趨勢(shì)。此外，T7噬菌體的比起絲狀噬菌體的增殖速度更快，可節(jié)省克隆和篩選的時(shí)間[15]。

1.3.4 λ噬菌體展示系統(tǒng) λ噬菌體是長(zhǎng)尾病毒科(Siphoviridae)的一種溫和噬菌體。λ噬菌體是雙鏈DNA噬菌體，有一個(gè)二十面體的頭部和一個(gè)可彎曲的尾部。λ噬菌體中的GPD蛋白和PV尾蛋白常被用來(lái)展示多肽或蛋白[16]。與PV蛋白相比，GPD蛋白上的拷貝數(shù)更多，可展示更復(fù)雜的大蛋白，且在其上展示蛋白對(duì)噬菌體增殖的干擾更小，因此通常使用GPD蛋白的N-端或C-端作為展示位點(diǎn)。此外，一些在絲狀噬菌體展示系統(tǒng)中很難通過(guò)膜分泌的多肽也可以在λ噬菌體表面展示。但λ噬菌體具有裂解性，增殖過(guò)程中滴度較低，較難增殖。此外，λ噬菌體的基因組大，使遺傳操作變得更加復(fù)雜困難[10]。

2 噬菌體展示技術(shù)制備單克隆抗體

使用噬菌體展示技術(shù)制備單克隆抗體的基本步驟包括：①創(chuàng)建包含抗體DNA序列的噬菌體文庫(kù)，并評(píng)估文庫(kù)的克隆多樣性；②通過(guò)淘選，篩去非特異結(jié)合的噬菌體，篩選出目標(biāo)噬菌體；③由于外源多肽和蛋白質(zhì)表達(dá)在噬菌體表面，其編碼基因可通過(guò)分泌型噬菌體的單鏈DNA測(cè)序推導(dǎo)出來(lái)。

2.1 噬菌體展示抗體庫(kù)的建立 噬菌體展示抗體庫(kù)可根據(jù)抗體基因序列的來(lái)源分為免疫文庫(kù)、天然文庫(kù)、半合成文庫(kù)及合成文庫(kù)。免疫文庫(kù)是利用病原感染者或疫苗接種者體內(nèi)產(chǎn)生的IgG-mRNA構(gòu)建而來(lái)。從同一免疫文庫(kù)中可分離出針對(duì)不同表位、具有不同特異性的抗體，且分離出的抗體特異性強(qiáng)，更易于識(shí)別某些靶點(diǎn)或抗原[17]。除此之外，免疫文庫(kù)還可用于分離針對(duì)低免疫原性區(qū)域的抗體[18]。天然文庫(kù)通常是利用未免疫者體內(nèi)IgM-mRNA構(gòu)建而成的，該文庫(kù)可用于分離針對(duì)所有類(lèi)型抗原的抗體[19]，從天然文庫(kù)中分離出的抗體親和力主要取決于文庫(kù)的多樣性。在新型病原體突然出現(xiàn)或耐藥菌株緊急爆發(fā)的情況下，構(gòu)建天然文庫(kù)可以滿(mǎn)足在短時(shí)間內(nèi)分離出單克隆抗體的需求[20]。合成抗體庫(kù)及半合成抗體庫(kù)分別是由合成序列、合成序列及天然序列的混合物構(gòu)成的。抗體識(shí)別抗原的特異性主要基于抗體重鏈和輕鏈基因的CDR區(qū)。在所有CDR區(qū)域中，CDRH3在組成和長(zhǎng)度上更加多樣化[21]，故其在抗原結(jié)合位點(diǎn)和抗原識(shí)別中起著重要作用。在合成文庫(kù)中，CDR區(qū)域被隨機(jī)插入到完全合成的框架序列中[22]。在半合成文庫(kù)中，則是在重鏈的CDR3中進(jìn)行有限數(shù)量的隨機(jī)化[23]。合成與半合成的文庫(kù)一般是用來(lái)淘選針對(duì)自身抗原的抗體，且由于合成文庫(kù)具有較高的多樣性，還可用于分離針對(duì)其他抗原靶標(biāo)的高親和力抗體。

2.2 噬菌體的淘選 創(chuàng)建文庫(kù)后，就可使用固定或標(biāo)記抗原進(jìn)行抗原特異性噬菌體抗體的富集[24]，這一步被稱(chēng)為噬菌體淘選。淘選首先需將抗原固定在固相載體上，加入噬菌體顆粒后，使得表達(dá)特異性抗體的噬菌體與抗原結(jié)合?？乖肿右话闶峭ㄟ^(guò)親水或疏水的非共價(jià)作用力被動(dòng)吸附在活化表面上的，這一作用力可以保證抗原分子在整個(gè)淘選過(guò)程中被牢牢吸附。而一些分子量低的抗原需要借助載體蛋白的連接吸附在活化表面上。在固定過(guò)程中，抗原結(jié)構(gòu)可能會(huì)出現(xiàn)一定程度的改變，從而導(dǎo)致針對(duì)被動(dòng)吸附抗原所分離的抗體不能識(shí)別溶液中游離抗原的情況[18]。另一種常見(jiàn)的固定方法是先將靶抗原與生物素偶聯(lián)，再通過(guò)與已固定在活化表面的鏈霉親和素的相互作用將抗原固定在表面上[25]。除此之外，還可以將表達(dá)表面抗原的整個(gè)細(xì)胞作為淘洗過(guò)程中的抗原，Mutuberria就使用固定的哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行淘選[26]，Palmer則是應(yīng)用活細(xì)胞原位淘選靶抗原[27]。

加入噬菌體文庫(kù)與抗原進(jìn)行孵育后，需要使用洗滌緩沖液洗掉未結(jié)合的噬菌體，一般會(huì)使用處于生理pH下、含有吐溫-20的非離子洗滌劑。洗滌的嚴(yán)格性與噬菌體同抗原的孵化時(shí)間、洗滌劑的濃度、洗滌緩沖液的pH值以及目標(biāo)抗原的濃度等條件相關(guān)[28]。嚴(yán)格的洗滌條件更有利于展示高親和力抗體的噬菌體富集，但多輪次淘選過(guò)程會(huì)使一些親和力較低的噬菌體被去除，從而導(dǎo)致淘選后的克隆多樣性差。在淘選過(guò)程中需獲得的不僅是親和力高的抗體，有時(shí)更需要分離出與特定表位結(jié)合或具有所需特定功能的抗體。故在最初幾輪淘選中，洗滌條件不應(yīng)設(shè)置的過(guò)于嚴(yán)格，而是應(yīng)隨著淘選循環(huán)的進(jìn)行不斷提升。

洗去未結(jié)合的噬菌體后，需要洗脫與抗原結(jié)合的高親和力噬菌體。最常用的是例如甘氨酸、檸檬酸等酸性或堿性緩沖液[29]。但需注意要把洗脫噬菌體的pH值中和到8左右，以避免噬菌體降解或失去感染性。高親和力的噬菌體也可通過(guò)與過(guò)量游離的抗原進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)達(dá)到洗脫的目的[30]，但若用于競(jìng)爭(zhēng)的游離抗原濃度或親和力不夠高，則可能會(huì)出現(xiàn)洗脫偏向風(fēng)險(xiǎn)。Rothe使用CysDisplay技術(shù)洗脫高親和力噬菌體，該技術(shù)是通過(guò)二硫鍵將抗體片段連接到PIII上，再通過(guò)添加二硫蘇糖醇以減少二硫鍵，從而將噬菌體從固定的抗原中釋放出來(lái)[31]。

經(jīng)過(guò)幾輪淘選后，在分離出的噬菌體池中進(jìn)行ELISA檢測(cè)，以確定在池中是否有針對(duì)特定抗原的噬菌體的富集。通過(guò)ELISA確定的陽(yáng)性克隆可通過(guò)測(cè)序直接識(shí)別抗體基因，也可繼續(xù)進(jìn)行下游基因工程改造。隨著下一代測(cè)序(NGS)技術(shù)、生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，利用高通量篩選抗體的方法也不斷涌現(xiàn)。Lyndon使用了一種名為PhageXpress的方法，通過(guò)利用電流體力學(xué)方法快速選擇單鏈抗體序列，并通過(guò)對(duì)包含噬菌體文庫(kù)顆粒的溶液進(jìn)行操縱來(lái)增強(qiáng)其與靶標(biāo)的結(jié)合[32]。

3 噬菌體展示技術(shù)制備單克隆抗體的優(yōu)缺點(diǎn)

相比起傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)，以及后續(xù)逐漸發(fā)展的嵌合抗體、人源化抗體，噬菌體展示技術(shù)制備單克隆抗體具有幾個(gè)明顯的優(yōu)勢(shì)。首先是其極大的提高了抗體庫(kù)容量，使其能進(jìn)行高通量的篩選，從雜交瘤技術(shù)只能篩選幾千個(gè)克隆提升到了106個(gè)克隆。其次噬菌體展示技術(shù)的操作相比起來(lái)較為簡(jiǎn)便，且效率較高，可以大規(guī)模工業(yè)化的生產(chǎn)單克隆抗體。同時(shí)，噬菌體展示技術(shù)可以直接得到抗體基因，便于進(jìn)一步構(gòu)建各種基因工程抗體，還可用于一些難于制備的抗體，如針對(duì)弱免疫原、毒性抗原的抗體。除此之外，重組噬菌體的純化步驟簡(jiǎn)單，不需昂貴的試劑與設(shè)備，在一般的實(shí)驗(yàn)室條件下就可以完成。

噬菌體展示技術(shù)也存在一些不足。其一是目前所建的抗體庫(kù)容量有限，構(gòu)建大片段的肽庫(kù)很困難，且噬菌體展示文庫(kù)一旦建成，就很難再進(jìn)行有效的體外突變和重組，進(jìn)而限制了文庫(kù)中分子遺傳的多樣性，所以現(xiàn)在提高抗體庫(kù)的庫(kù)容及多樣性是該技術(shù)亟待解決的問(wèn)題。其二，不是所有的多肽與蛋白質(zhì)都能成功地展示在噬菌體表面，可能由于其疏水性強(qiáng)或影響外膜蛋白的折疊等原因無(wú)法展示。此外，需持續(xù)優(yōu)化篩選方法以獲得高親和力的抗體，且克服淘選中容易出現(xiàn)的陽(yáng)性克隆丟失及出現(xiàn)假陽(yáng)性克隆也是迫切需要解決的問(wèn)題。

4 噬菌體展示技術(shù)制備單克隆抗體及應(yīng)用

利用噬菌體展示技術(shù)開(kāi)發(fā)針對(duì)傳染病病原的單克隆抗體的過(guò)程是十分快速的。Schofield使用甲型肝炎病毒HM-175株的完整衣殼蛋白，從黑猩猩骨髓的cDNA文庫(kù)中進(jìn)行篩選，制備出了四株對(duì)甲型肝炎病毒衣殼的單克隆抗體[33]。而Lillo等從針對(duì)鼠疫耶爾森菌A1122株的單鏈抗體庫(kù)中獲取了一株對(duì)鼠疫桿菌F1抗原具有強(qiáng)中和、抗感染作用的單克隆抗體[34]。而將針對(duì)同一病原不同亞型的免疫文庫(kù)進(jìn)行多樣化組合形成組合庫(kù)，還可以分離出針對(duì)多種亞型所具有的共同保守表位的單克隆抗體[35]。通過(guò)該方法，Kashyap從5名H5N1感染康復(fù)者所共同構(gòu)建的抗體庫(kù)中獲取了近300種針對(duì)H5N1病毒的單克隆抗體，其中有幾株具有廣泛的中和活性[36]。近年來(lái)，新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)在全世界范圍內(nèi)廣泛流行，對(duì)全世界公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。利用噬菌體展示技術(shù)制備單克隆抗體是獲得針對(duì)SARS-CoV2單抗的一種快速有效的方法。目前，全球范圍內(nèi)有許多研究小組正在采用噬菌體展示技術(shù)篩選針對(duì)該病的單克隆抗體，以用于疫苗的開(kāi)發(fā)與評(píng)估[37]。Kim通過(guò)噬菌體展示技術(shù)開(kāi)發(fā)了針對(duì)核衣殼蛋白的抗體，并將其應(yīng)用于COVID-19的診斷[38]。Wrapp使用經(jīng)冠狀病毒刺突蛋白免疫的美洲駝構(gòu)建了噬菌體肽庫(kù)，并從中淘選出了對(duì)SARS-CoV2具有中和能力的VH-72抗體[39]。Huo使用SARS-CoV2的受體結(jié)合域(RBD)作為噬菌體淘選的抗原，從一個(gè)天然的駱駝單域抗體庫(kù)中分離出單克隆抗體H11-D4，并通過(guò)改進(jìn)H11-D4的親和力成熟，得到了高親和力的突變體H11-H4[40]。Pan使用來(lái)源于8名COVID-19康復(fù)期患者的外周血單核細(xì)胞(PBMCs)構(gòu)建了兩個(gè)噬菌體免疫文庫(kù)，并從中獲取了具有高中和能力的單克隆抗體2B11[41]。

通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選單克隆抗體的過(guò)程省略了細(xì)胞融合過(guò)程中繁瑣的步驟，也避免了因?yàn)殡s交瘤細(xì)胞的不穩(wěn)定性而需要進(jìn)行反復(fù)亞克隆的過(guò)程。使得噬菌體展示成為了快速制備單克隆抗體的一個(gè)不二選擇。雖然從特定疾病的免疫抗體庫(kù)中分離出的單克隆抗體相較之下具有更好的特異性，但由于技術(shù)和成本的影響，目前大多針對(duì)傳染病的單克隆抗體仍然是通過(guò)天然抗體庫(kù)分離而來(lái)。從實(shí)用性看，天然文庫(kù)的無(wú)偏性更好，幾乎可以分離出針對(duì)所有靶分子的單克隆抗體。且可以重復(fù)利用于多種疾病的單克隆抗體的開(kāi)發(fā)，不必為每個(gè)新疾病都重新建立免疫抗體庫(kù)。盡管來(lái)源于天然文庫(kù)的單克隆抗體特異性稍差，但相較時(shí)間和成本，其還是成為了目前使用噬菌體展示技術(shù)篩選單克隆抗體的一個(gè)普遍選擇。

5 下一代測(cè)序技術(shù)與噬菌體展示技術(shù)的結(jié)合

下一代測(cè)序技術(shù)(Next-generation sequencing technology，NGS)又稱(chēng)為高通量測(cè)序技術(shù)(High-throughput sequencing)，可以一次同時(shí)對(duì)大量核酸分子進(jìn)行平行序列測(cè)定。通過(guò)NGS技術(shù)得到的大量測(cè)序數(shù)據(jù)非常適合于像抗體庫(kù)這樣擁有多樣化基因片段的復(fù)雜集合的全面分析。通常，應(yīng)用傳統(tǒng)噬菌體展示技術(shù)獲得噬菌體陽(yáng)性克隆，需要經(jīng)過(guò)三輪淘選后，通過(guò)ELISA方法先對(duì)數(shù)百至數(shù)千個(gè)克隆進(jìn)行鑒定，再使用Sanger測(cè)序確定ELISA陽(yáng)性克隆的序列。但由于噬菌體在大腸桿菌培養(yǎng)增殖過(guò)程中的傳播偏差[42]，使得一些克隆在一二輪的淘選過(guò)程中沒(méi)有被富集，導(dǎo)致在后續(xù)鑒定過(guò)程中因出現(xiàn)頻率較低而被忽略。而基于NGS技術(shù)的抗體克隆重建可以避免重復(fù)識(shí)別具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的高頻率克隆，并且可以識(shí)別和恢復(fù)許多在噬菌體淘選中低頻率存在的獨(dú)特克隆[43]。

Fischer首先在噬菌體展示技術(shù)篩選單克隆抗體的過(guò)程中使用了NGS技術(shù)[42]。他們使用Illumina平臺(tái)在一個(gè)多框架合成單鏈抗體庫(kù)中測(cè)序抗體的互補(bǔ)決定區(qū)H3 (CDRH3)，并采用NGS評(píng)估文庫(kù)質(zhì)量，跟蹤三輪篩選過(guò)程中重鏈種系和CDRH3長(zhǎng)度分布的變化。并使用同樣的方法對(duì)半合成單鏈抗體文庫(kù)的CDRH3區(qū)進(jìn)行測(cè)序，在噬菌體淘選輸出中獲取罕見(jiàn)的單鏈抗體克隆[44-45]。Lerner使用Roche’s 454對(duì)天然scFv文庫(kù)中噬菌體選擇輸出的VH區(qū)域進(jìn)行了測(cè)序[46]。而Stark同樣使用Roche’s 454對(duì)合成Fab/scFv文庫(kù)的VH和VL區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，并通過(guò)NGS技術(shù)評(píng)估了文庫(kù)多樣性[22]。Lopez利用MiSeq平臺(tái)在合成的Fab文庫(kù)中對(duì)輸出的CDRH2-CDRH3區(qū)域進(jìn)行測(cè)序并使用CDRH3信息分析氨基酸組成，監(jiān)測(cè)富集過(guò)程，通過(guò)片段組裝檢索稀有克隆[47]。Chung利用Illumina平臺(tái)分析了原始文庫(kù)和每輪淘選后的CDRH3序列，并通過(guò)兩步連接法PCR確定整個(gè)scFv基因[48]。Kris利用Ion Torrent測(cè)序平臺(tái)測(cè)序噬菌體Fab庫(kù)中所有多樣化的CDRs，將NGS測(cè)序得到的信息轉(zhuǎn)換為Fab克隆。并使用NGS輔助Fab重建方法從噬菌體淘選中獲得罕見(jiàn)的稀有克隆[49]。Nannini利用單分子實(shí)時(shí)(SMRT)測(cè)序與發(fā)夾接頭環(huán)相連接，以獲得全長(zhǎng)的scFv序列，使得在淘選后可以快速分離和檢測(cè)從噬菌體展示文庫(kù)中富集的scFv抗體，從而獲得在傳統(tǒng)淘選中被忽略的陽(yáng)性克隆[50]。

NGS技術(shù)能一次同時(shí)對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，覆蓋了天然、免疫以及合成庫(kù)的全部庫(kù)容，解決了傳統(tǒng)噬菌體文庫(kù)篩選中更易篩選到高頻率克隆，出現(xiàn)篩選偏差的問(wèn)題。使用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)篩選前后的噬菌體進(jìn)行測(cè)序，并通過(guò)對(duì)淘選前后的抗體序列富集情況的判斷，可以更加方便地獲取抗體基因序列。NGS技術(shù)的加入不僅使通過(guò)噬菌體展示獲得單克隆抗體的過(guò)程變得更加簡(jiǎn)單快速，還能獲得更多在傳統(tǒng)淘選的過(guò)程中被忽略的陽(yáng)性克隆。而隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷更新也將推動(dòng)著噬菌體展示技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。

6 展 望

通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選單克隆抗體的應(yīng)用在近幾年顯著增加。由于候選肽和抗體對(duì)靶標(biāo)的親和力對(duì)于單克隆抗體的發(fā)現(xiàn)至關(guān)重要，因此構(gòu)造高親和力、高多樣性的噬菌體展示文庫(kù)是亟需解決的問(wèn)題。對(duì)于這一點(diǎn)，例如免疫文庫(kù)等定制的噬菌體展示文庫(kù)，可能是下一步的主要研究方向。同時(shí)，更有效的選擇策略也能進(jìn)一步地推動(dòng)噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展。下一代測(cè)序技術(shù)因其對(duì)庫(kù)的多樣性的評(píng)估以及對(duì)低頻率克隆的拯救，加速了在噬菌體展示技術(shù)中發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)單克隆抗體的進(jìn)程。且隨著測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步，測(cè)序的深度和讀數(shù)長(zhǎng)度也在不斷提高：例如，PacBio Sequel系統(tǒng)產(chǎn)生的序列大約是以前的RS II系統(tǒng)的7倍，而納米孔系統(tǒng)提供了實(shí)時(shí)DNA測(cè)序與超長(zhǎng)讀數(shù)相結(jié)合的可能。隨著NGS技術(shù)不斷快速發(fā)展，其在噬菌體抗體展示庫(kù)中的應(yīng)用可能會(huì)愈發(fā)重要。