金明麗，潘志華，蔣 穎，趙 琪

(成都醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院 核工業(yè)四一六醫(yī)院放射科，四川 成都 610031)

肝纖維化是慢性肝臟疾病進展為不可逆性肝硬化、肝功能衰竭甚至肝細胞癌的必經(jīng)病理階段[1],常伴不同程度鐵沉積而加速病情進展。肝臟穿刺活檢是評估肝臟鐵含量的金標準，但存在取樣誤差及感染等風險；血清鐵、鐵蛋白等可在一定程度上反映鐵沉積，但無法直接定量肝臟鐵含量，且受全身代謝狀況影響[2]。MR T2 mapping是評估鐵含量的無創(chuàng)性方法之一，其參數(shù)T2弛豫時間(T2值)及T2弛豫率(R2值)廣泛用于定量評估腦、脾、肝及心臟鐵含量[3]。本研究觀察T2值評估不同纖維化分期大鼠肝臟鐵沉積的價值。

1 材料與方法

1.1 建立大鼠肝纖維化模型 60只2～3月齡SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量(202.0±3.2)g，購自西南醫(yī)科大學動物實驗中心[生產(chǎn)許可證SCXK(川)2013-17，使用許可證為SCXK(川)2013-181]，常規(guī)飼養(yǎng)。分別于其腹腔及后腿內(nèi)側皮下注射濃度40%的四氯化碳食用調(diào)和油懸濁液0.3 ml/100 g體質(zhì)量，每周每處注射2次，共注射12周，建立大鼠肝纖維化模型。本研究經(jīng)院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 儀器與方法 采用Philips MR Achieva 3.0T超導MR儀，配備16通道腕關節(jié)線圈。于造模第5～12周，每周選取1～6只體質(zhì)量偏輕、毛色較枯黃、精神萎靡的大鼠行上腹部掃描。于后腿內(nèi)側皮下注射2%戊巴比妥鈉0.2 ml/100 g體質(zhì)量麻醉大鼠，自膈頂至雙腎下緣水平進行T2 mapping掃描，采用多回波梯度-自旋回波(multi-echo gradient and spin echo, M-GRASE)序列，回波數(shù)4，TE117 ms，TE234 ms，TE351 ms，TE468 ms，TR 1 552 ms，層厚2.5 mm，層間距1 mm，矩陣240×240。

將圖像傳導至Philips后處理工作站(Extended MR WorkSpace 2.6.3.4)，系統(tǒng)自動重建T2 mapping圖像。由2名具有5年MR診斷經(jīng)驗的醫(yī)師于原始圖像(TE為17 ms，圖1A)顯示肝臟較大層面避開偽影、膽管、大血管、局灶性肝臟損傷部位等放置3個面積10 mm2的圓形ROI[4]，并將ROI復制到T2 mapping中的相同區(qū)域(圖1B)，測量其T2值；以2名醫(yī)師對3個ROI的測量結果的均值為最終結果。

1.3 病理檢查 掃描結束后處死大鼠，取肝臟組織送病理科行Masson、普魯士藍及HE染色。由2名具有8年病理診斷經(jīng)驗的主治醫(yī)師采用雙盲法評估肝纖維化S分期、鐵質(zhì)及脂肪病理分級。肝臟纖維化分期標準：S0期無纖維化；S1期匯管區(qū)擴大、纖維化；S2期匯管區(qū)周圍纖維化，纖維間隔形成，小葉結構存在；S3期纖維間隔伴小葉結構紊亂，無肝硬化；S4期即早期肝硬化。肝臟脂肪分級標準：0級<5%肝細胞受累；1級5%～33%肝細胞受累；2級34%～66%肝細胞受累；3級>66%肝細胞受累。肝臟鐵質(zhì)分級標準：0級無鐵顆粒；1級僅極少數(shù)肝細胞中可見鐵顆粒；2級指5%～10%肝細胞中可見鐵顆粒；3級為≥40%肝細胞可見鐵顆粒；4級為大多數(shù)肝細胞中見豐富鐵顆粒[5-7]。意見不一致時，提請上級醫(yī)師復核并裁定。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料不符合正態(tài)分布，以中位數(shù)(上下四分位數(shù))表示，采用Kruskal-WallisH檢驗進行比較，兩兩比較采用Nemenyi法。采用Spearman相關分析觀察大鼠鐵質(zhì)病理分級與T2值的相關性，以Kendall相關系數(shù)(tau-b)分析肝臟鐵質(zhì)病理分級與纖維化S分期間的相關性。繪制T2值診斷肝臟鐵質(zhì)病理分級的受試者工作特征(receiver operating characteristic， ROC)曲線，計算曲線下面積(area under the curve, AUC)。采用雙因素方差分析評估脂肪、鐵質(zhì)病理分級、肝纖維化分期對T2值的影響。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 病理結果 實驗過程中20只大鼠死亡，共40只大鼠納入研究；其中肝臟纖維化S0期6只、S1期6只、S2期8只、S3期10只、S4期10只(圖2)，鐵質(zhì)病理分級0級7只、 1級9只、2級12只、3級10只、4級2只(圖3)，脂肪病理分級0級5只、1級8只、2級12只、3級15只。因鐵質(zhì)病理分級4級樣本量較少，將3級與4級合并進行統(tǒng)計學分析。

2.2 相關性分析 肝纖維化分期與肝臟鐵質(zhì)病理分級呈正相關(tau-b=0.851，P<0.001)，鐵質(zhì)病理分級與T2值呈負相關(rs=-0.803，P<0.001)。

2.3 不同鐵質(zhì)病理分級T2值比較 鐵質(zhì)病理分級0級大鼠肝臟T2值為59.10(60.70,57.80)ms,1級為56.50(57.25,52.05)ms，2級為53.95(56.02, 49.75)ms，≥3級為45.85(48.88,34.93)ms，總體差異有統(tǒng)計學意義(H=26.367，P<0.001)；兩兩比較,鐵質(zhì)病理0級與1級、1級與2級肝臟T2值差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，其余各鐵質(zhì)病理分級間T2值差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

2.4 ROC曲線分析 T2值鑒別肝纖維化分期大鼠肝臟有無鐵沉積及鐵質(zhì)病理分級≥3級的AUC分別為0.97、0.94，見表1。

表1 T2值診斷肝纖維化大鼠鐵質(zhì)病理分級的效能(n=40)

2.5 雙因素方差分析 對肝臟T2值行正態(tài)轉(zhuǎn)換，進一步雙因素方差分析結果顯示，不同脂肪病理分級肝臟T2值差異無統(tǒng)計學意義(F=0.37，P>0.05)，而不同鐵質(zhì)病理分級間肝臟T2值差異有統(tǒng)計學意義(F=5.10，P<0.05)，不同肝纖維化分期肝臟T2值差異無統(tǒng)計學意義(F=0.14，P>0.05)；三者交互作用對肝臟T2值無明顯影響(F=1.43，P>0.05)。

3 討論

肝纖維化常見于病毒性肝炎、酒精性及非酒精性肝病、血色素沉著癥等急、慢性肝損傷，常伴不同程度鐵和脂肪沉積，加速芬頓反應，產(chǎn)生活性氧，嚴重破壞細胞和組織，導致肝纖維化進展為肝硬化，發(fā)生門靜脈高壓等并發(fā)癥，甚至肝細胞癌。準確評估鐵沉積對治療肝纖維化及評估預后十分重要[8]。既往研究[9]顯示，以四氯化碳灌胃建立肝纖維化小鼠模型過程中，隨造模時間延長，小鼠肝纖維化程度逐漸增加，并存在不同程度脂肪及鐵沉積，且鐵沉積隨纖維化程度加重而增加。江遠等[10]發(fā)現(xiàn)正常大鼠存在輕度肝鐵沉積；隨著肝纖維化加重，肝臟庫普弗細胞及活化肝星狀細胞鐵沉積增多，且存在不同程度脂肪沉積及炎癥細胞浸潤。本研究結果與上述研究相符。

MRI是量化肝鐵沉積的無創(chuàng)性檢查方法，有助于指導臨床治療肝纖維化。鐵為超順磁性物質(zhì)，影響組織的易感性，使B0場不均勻，增加蛋白質(zhì)結合水的磁化率，致組織T2和T2*弛豫時間縮短，組織信號強度減低， R2及R2*值增加。T2 mapping對靜磁場不均勻較不敏感，圖像信噪比高于T2*mapping。目前常用組織T2及R2值評估肝臟鐵含量。既往研究[11-12]證實，組織R2與肝臟鐵含量呈顯著相關；肝鐵正常及鐵過載患者中，R2值與肝臟穿刺活檢鐵含量呈線性相關(r=0.89)[13-14]，提示其診斷鐵過載的效能相近，且R2值評估肝臟鐵沉積的重復性及準確性較好。KRISTANEEPAILBOON等[15]應用1.5T及3.0T MR儀測量20名健康者及42例肝鐵沉積患者的T2及T2*值，發(fā)現(xiàn)肝臟T2值(3.0T)及T2*值(1.5T)均能較好評估肝臟鐵質(zhì)病理分級，提示其可作為穿刺活檢的替代方法。FRANCA等[16]應用3.0T MR多回波化學位移編碼序列圖像研究101例彌漫性肝病患者，發(fā)現(xiàn)肝臟R2*值隨鐵質(zhì)病理分級增高而增加,其鑒別0級與1～4級鐵質(zhì)病理分級的AUC為0.848[95%CI(0.776,0.919)]，鑒別0～2級與3～4級鐵質(zhì)病理分級的AUC為0.976[(95%CI(0.949,1.000)]，且R2*值評估鐵含量不受肝纖維化及脂肪沉積的影響。

本研究結果證實T2值與肝臟鐵質(zhì)病理分級呈負相關，T2值可用于評估肝纖維化大鼠肝臟鐵沉積，且不受肝脂肪病理分級、纖維化分期的影響，其鑒別肝纖維化大鼠肝臟有無鐵沉積、肝臟鐵質(zhì)病理分級≥3級的效能較好；0級與1級、1級與2級鐵質(zhì)病理分級大鼠肝臟T2值差異無統(tǒng)計學意義，分析可能原因，T2值通過弛豫時間反映組織內(nèi)鐵含量變化，而肝臟弛豫時間受鐵濃度、鐵顆粒分布及大小的影響，肝纖維化及脂肪沉積均可導致肝臟弛豫時間增加[17-18]，部分抵消鐵沉積T2弛豫時間的減少，且肝臟炎癥和纖維化會限制水分子擴散運動，降低T2值對鐵的敏感性。本研究早期肝纖維化大鼠鐵沉積較少且不均勻，存在嚴重脂肪沉積，導致0級與1級、1級與2級鐵質(zhì)病理分級T2值差異無統(tǒng)計學意義；隨纖維化進展，肝臟細胞水腫及脂肪變性減輕，肝臟鐵沉積增加，S3、S4期肝細胞鐵沉積明顯，肝臟T2弛豫時間明顯縮短。

綜上，T2值對定量評估肝纖維化大鼠模型肝臟鐵沉積具有一定價值，有助于鑒別有無鐵沉積及病理分級≥3級鐵沉積。但本研究樣本量小，且未能定量檢測大鼠肝臟鐵質(zhì)及脂肪含量，有待進一步完善。