楊崇雙，肖云華，梁清華，黃學(xué)全，何 闖，鄧良余，熊俊儒，劉平平

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，重慶 400038)

放射性125I粒子植入是局部連續(xù)低劑量放射治療(放療)腫瘤手段，具有安全、微創(chuàng)、可重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)[1-2]，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其殺傷腫瘤的主要機(jī)制；但125I粒子還可引起腫瘤細(xì)胞保護(hù)性自噬而降低抑瘤作用[3-4]，而氯喹(chloroquine, CQ)可抑制125I粒子誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[4-5]。125I粒子可抑制肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)細(xì)胞異位移植瘤血管生成[6]。本研究觀察CQ聯(lián)合125I粒子對(duì)裸鼠HCC Hep3B細(xì)胞移植瘤的效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 24只健康雄性BALB/c裸鼠[湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK(湘)-2019-0004]，4～6周齡，體質(zhì)量20～24 g。本研究獲陸軍軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(AMUWEC20200407)。

1.2 主要試劑與儀器 HCC細(xì)胞株Hep3B(美國ATCC)，放射性125I 粒子(北京智博高科技生物技術(shù))活度0.8 mCi，硫酸羥氯喹(上海上藥中西制藥)，LC3抗體及CD31抗體(美國CST)；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A, VEGF-A)、促血管生成素2(angiopoietin 2, Ang2)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒(北京正四柏生物科技)，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR)試劑盒(艾科瑞生物科技)，TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液及BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù))；聯(lián)影uCT510 CT掃描儀。

1.3 模型構(gòu)建 常規(guī)培養(yǎng)Hep3B細(xì)胞，并于裸鼠右側(cè)腹股溝皮下注射約1×107個(gè)細(xì)胞，2周后皮下移植瘤體積為200～250 mm3，即模型構(gòu)建成功。從中挑選移植瘤大小接近的20只，移植瘤平均體積為(226.43±14.61)mm3，隨機(jī)分為CQ組、125I粒子組(I-125組)、CQ聯(lián)合125I粒子組(CQ+I-125組)及正常對(duì)照(normal control, NC)組，每組5只。對(duì)CQ組每日腹腔注射CQ 50 mg/kg體質(zhì)量，連續(xù)注射14天；對(duì)I-125組于CT引導(dǎo)下將1枚125I 粒子植入移植瘤中(圖1)；對(duì)CQ+I-125組于CT引導(dǎo)下將1枚125I 粒子植入移植瘤中，并連續(xù)14天腹腔注射CQ 50 mg/kg體質(zhì)量；對(duì)NC組不作處理。分籠飼養(yǎng)I-125組及CQ+I-125組裸鼠。21天后處死裸鼠，取移植瘤稱重，并安全回收125I粒子。

1.4 檢測(cè)細(xì)胞凋亡 以4%多聚甲醛固定移植瘤組織，之后行石蠟包埋及切片；按照TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒說明書方法及步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后，于光鏡下觀察腫瘤細(xì)胞凋亡情況并拍照記錄。

1.5 檢測(cè)LC3、CD31表達(dá)及計(jì)算微血管密度(microvessel density, MVD) 對(duì)石蠟切片行二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，以0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液沸煮抗原修復(fù)、3%H2O2阻斷內(nèi)源酶活性、5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)溶液封閉，于4℃冰箱孵育一抗(CD31、LC3，1∶100)過夜；采用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)洗滌切片后孵育二抗，行二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine, DAB)染色、蘇木精復(fù)染，以中性樹膠封片。于光鏡下觀察并以Weidner法[7]計(jì)算移植瘤MVD：于低倍鏡下尋找微血管密集區(qū)后，轉(zhuǎn)換高倍鏡(×400)，隨機(jī)選取3處視野，記錄其高倍鏡下微血管數(shù)目，以3處平均值為MVD。

1.6 檢測(cè)VEGF-A及Ang2的mRNA表達(dá) 采用Trizol提取移植瘤組織總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA；以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR，按試劑盒說明書要求設(shè)置反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，引物由Genecopoeia公司設(shè)計(jì)合成；最后以2-ΔΔCT相對(duì)定量法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.7 檢測(cè)VEGF、Ang2蛋白表達(dá) 以RIPA裂解液提取移植瘤組織樣品蛋白，以BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，并將其調(diào)至相同濃度；在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔及實(shí)驗(yàn)孔，向其內(nèi)分別加入100 μl不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品蛋白及待測(cè)蛋白樣品，置于37℃孵育1.5 h后洗板，加入生物素化抗體工作液100 μl，置于37℃孵育1 h后，加入100 μl酶結(jié)合物工作液，再置于37℃孵育0.5 h；加入100 μl顯色劑，避光反應(yīng)15 min后加入100 μl終止液，以酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm處光密度(optical density, OD)，計(jì)算待測(cè)樣品蛋白濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad prism 6.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。以±s表示符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)行兩組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 移植瘤質(zhì)量 CQ組、I-125組、CQ+I-125組及NC組移植瘤質(zhì)量分別為(0.56±0.05)、(0.41±0.04)、(0.31±0.02)及(0.81±0.07)g。CQ組移植瘤質(zhì)量大于I-125組及CQ+I-125組(t=4.91，P<0.01；t=9.91，P<0.01)而小于NC組(t=6.08，P<0.01)；I-125組移植瘤質(zhì)量大于CQ+I-125組(t=5.49，P<0.01)而小于NC組(t=10.65，P<0.01)；CQ+I-125組移植瘤質(zhì)量小于NC組(t=14.93，P<0.01)，見圖2。

2.2 細(xì)胞凋亡和LC3表達(dá) 光鏡下CQ組、I-125組、CQ+I-125組及NC組移植瘤組織內(nèi)均存在凋亡細(xì)胞及LC3陽性表達(dá)；細(xì)胞凋亡數(shù)量從多到少依次為CQ+I-125組、I-125組、CQ組及NC組，LC3表達(dá)從高到低依次為I-125組、CQ+I-125組、CQ組及NC組，或I-125組、CQ+I-125組、NC組及CQ組(NC組與CQ組基本相同)，見圖3。

2.3 MVD 光鏡下CQ組、I-125組、CQ+I-125組及NC組移植瘤組織內(nèi)均存在CD31陽性表達(dá)，移植瘤MVD分別為(13.61±1.84)、(11.89±2.21)、(5.13±1.23)及(19.50±2.12)個(gè)/高倍視野。移植瘤MVD在CQ組與I-125組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.68，P=0.13)，在CQ組及I-125組均大于CQ+I-125組(t=12.45，P<0.01；t=7.85，P<0.01)而小于NC組(t=5.06，P<0.01；t=6.04，P<0.01)，在CQ+I-125組則小于NC組(t=15.07，P<0.01)，見圖4。

2.4 VEGF-A和Ang2的mRNA相對(duì)表達(dá)量 CQ組、I-125組、CQ+I-125組及NC組移植瘤VEGF-A的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.89±0.05、0.66±0.10、0.52±0.09及1，Ang2的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.83±0.07、0.66±0.08、0.46±0.06及1。移植瘤VEGF-A和Ang2的mRNA相對(duì)表達(dá)量在CQ組高于I-125組(t=3.70，P=0.02；t=2.92，P=0.04)及CQ+I-125組(t=5.85，P<0.01；t=6.91，P<0.01)而低于NC組(t=3.61，P=0.02；t=4.19，P<0.05)，在I-125組高于CQ+I-125組(t=2.64，P<0.05；t=3.20，P=0.03)而低于NC組(t=5.81，P<0.01；t=7.67，P<0.01)，在CQ+I-125組則低于NC組(t=8.10，P<0.01；t=11.87，P<0.01)。見圖5。

2.5 VEGF-A和Ang2蛋白表達(dá)量 CQ組、I-125組、CQ+I-125組及NC組VEGF-A蛋白表達(dá)量分別為 (1 092.00±80.60)、(895.70±79.87)、(672.5±75.49)及(1 370.00±60.89)pg/ml，Ang2蛋白表達(dá)量分別為(978.80±119.00)、(840.40±55.41)、(730.50±58.11)及(1 126.00±128.50)pg/ml。其中，CQ組移植瘤VEGF-A和Ang2蛋白表達(dá)量高于I-125組(t=3.47，P<0.05；t=2.58，P<0.05)及CQ+I-125組(t=7.60，P<0.01；t=4.55，P<0.01)，低于NC組(t=5.50，P<0.01；t=2.55，P<0.05)；I-125組移植瘤VEGF-A和Ang2蛋白表達(dá)量高于CQ+I-125組(t=4.06，P<0.01；t=3.35，P<0.01)，低于NC組(t=9.45，P<0.01；t=5.00，P<0.01)；CQ+I-125組移植瘤VEGF-A和Ang2蛋白表達(dá)量低于NC組(t=14.38，P<0.01；t=6.87，P<0.01)。見圖6。

3 討論

HCC是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均較高[8]；超過70%患者獲得確診時(shí)已處于中晚期[9]，錯(cuò)過手術(shù)治療最佳時(shí)期。放射性125I粒子植入有助于改善中晚期HCC患者生活質(zhì)量并延長(zhǎng)生存時(shí)間[10]，但由于放療抵抗，患者自單純125I粒子植入治療中獲益有限。

CQ為抗瘧藥，主要用于防治瘧疾及自身免疫性疾?。煌瑫r(shí)具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖及自噬等作用[11]，主要通過抑制放射及化學(xué)治療(放化療)誘導(dǎo)自噬而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性、提高其抑瘤作用[2,12]，常作為自噬抑制劑用于抗腫瘤研究。WANG等[3]發(fā)現(xiàn)，以125I聯(lián)合CQ治療食管癌，癌細(xì)胞死亡數(shù)量明顯多于單獨(dú)125I粒子治療，提示CQ有助于增強(qiáng)125I粒子的放療作用。本研究中，CQ+I-125組移植瘤重量明顯低于I-125組及CQ組，但凋亡細(xì)胞數(shù)量多于I-125組及CQ組，且標(biāo)志自噬發(fā)生的重要分子標(biāo)記物L(fēng)C3在I-125組和CQ+I-125組的表達(dá)明顯高于NC組，而I-125組則高于CQ+I-125組，與既往針對(duì)食管鱗癌的研究[4]結(jié)果基本一致，表明CQ可抑制125I粒子誘導(dǎo)自噬而增強(qiáng)其抑瘤作用。

腫瘤發(fā)生、發(fā)展除與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及自噬有關(guān)外，還與腫瘤新生血管密切相關(guān)；文獻(xiàn)[7]報(bào)道無明顯新生血管生成時(shí)，腫瘤最大體積為2～3 mm3。LI等[13]發(fā)現(xiàn)，CQ組肺癌裸鼠移植瘤模型的移植瘤體積、重量和MVD均明顯低于對(duì)照組。XIANG等[14]認(rèn)為125I粒子植入可明顯降低肺癌移植瘤組織中的MVD。研究[12]表明，多柔比星聯(lián)合CQ的抗血管生成作用高于單獨(dú)多柔比星；CQ及125I粒子均可降低移植瘤組織的MVD[13,15]。此外，腫瘤微血管生成還受腫瘤微環(huán)境中多種細(xì)胞因子調(diào)控。VEGF和Ang2是目前已知最主要的兩類促血管新生因子，且具有協(xié)同作用；抑制Ang2表達(dá)可明顯抑制腫瘤血管生成[16]。相比鄰近肝組織，HCC的VEGF-A及Ang2表達(dá)明顯升高，且與腫瘤惡性程度和患者預(yù)后密切相關(guān)[17-18]。LI等[13]認(rèn)為CQ可下調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Ang2，從而抑制血管生成。SCHAAF等[19]發(fā)現(xiàn)CQ還可抵消VEGF誘導(dǎo)的血管生成效應(yīng)。本研究亦發(fā)現(xiàn)CQ與125I粒子可協(xié)同作用，降低HCC移植瘤MVD及VEGF-A和Ang2的表達(dá)。

綜上，CQ聯(lián)合125I粒子可協(xié)同抑制裸鼠HCC移植瘤生長(zhǎng)，對(duì)其相關(guān)分子機(jī)制、聯(lián)合治療最佳劑量及給藥時(shí)間均有待進(jìn)一步觀察。