羅 霞，付小哲，林 強，劉禮輝，牛銀杰，梁紅茹，李寧求

(中國水產(chǎn)科學研究院 珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁用藥物創(chuàng)制重點實驗室，廣東省水產(chǎn)動物免疫技術(shù)重點實驗室，廣東 廣州 510380)

鱖魚(Sinipercachuatsi)是我國重要的名特優(yōu)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大以及養(yǎng)殖水環(huán)境的惡化，鱖魚的養(yǎng)殖病害日益嚴重。目前，傳染性脾腎壞死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)和彈狀病毒(Sinipercachuatsirhabdoviruses，SCRV)已成為威脅鱖魚養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要因素之一。免疫預防是防治病毒病暴發(fā)最有效的措施。國內(nèi)Dong等[1]建立了ISKNV敏感的鱖魚仔魚細胞系MFF-1，隨后研制出了鱖魚ISKNV滅活疫苗(新獸藥證書：(2019)新獸藥證字75號)，在實驗室和田間免疫保護率超過90%。本課題組研制了鱖魚ISKNV編碼蛋白疫苗和DNA疫苗，免疫保護率均超過60%[2-4]。Zhang等[5]發(fā)現(xiàn)，以殼聚糖作為佐劑，ISKNV滅活疫苗的保護率可達到58%。Chen等[6]構(gòu)建了SCRV G蛋白DNA疫苗，對鱖魚的保護率為77.5%。Zhang等[7]篩選到1株SCRV弱毒株MSRV-SS-7，將其制成弱毒疫苗，通過浸泡和注射均可對鱖魚提供100%的免疫保護率。上述疫苗對鱖魚病毒病的暴發(fā)起到了一定的預防作用，但存在的關(guān)鍵問題是只能預防單一病種。為解決此難題，實現(xiàn)一針防兩病的目的，本課題組在多年流行病學調(diào)查的基礎(chǔ)上[8]，初步研制出了安全、有效的鱖魚ISKNV和SCRV二聯(lián)滅活疫苗，該疫苗對ISKNV和SCRV感染可分別提供90%和80%以上的免疫保護率。

毒種質(zhì)量直接影響著疫苗的安全性和有效性，因此合格、適宜代次的毒種是疫苗生產(chǎn)所必需的。為了建立鱖魚ISKNV和SCRV二聯(lián)滅活疫苗毒種庫及種子批，本研究以篩選得到的ISKNV-QY0910株和SCRV-GM1503株為原始毒種(制苗及攻毒用毒株相同)，將其擴繁10代后，鑒定各代次毒種的毒力、增殖穩(wěn)定性、特異性、純粹性、免疫原性以及保存期等，以期為鱖魚ISKNV和SCRV二聯(lián)滅活疫苗的研制及種子批的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒種、細胞和試驗魚

鱖魚腦組織細胞系(Chinese perch brain cell line，CPB)[9]、SCRV-GM株和ISKNV-QY株，均由本實驗室保存；試驗用鱖魚，購自廣東省清遠市某養(yǎng)殖場，PCR檢測不攜帶ISKNV和SCRV等病毒，細菌分離鑒定無細菌感染；L15培養(yǎng)基，購自Gibco公司；DNA提取試劑盒，購自OMEGA試劑公司；TRIzol，購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自艾科瑞(AG)試劑公司；試驗所用引物，均由廣州艾基生物科技有限公司合成。

1.2 ISKNV和SCRV毒種的擴繁及滴度測定

采用異步接毒法，在原始種子的基礎(chǔ)上對ISKNV、SCRV分別擴繁10代(F1～F10)。將F1～F10代ISKNV按照感染復數(shù)(MOI)為1、SCRV按照MOI為0.01分別接種對數(shù)生長期的CPB細胞，28 ℃吸附1～2 h后，加含體積分數(shù)5%血清的L15培養(yǎng)液，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。以未接種病毒的CPB細胞為對照。每日觀察細胞病變(CPE)情況，當細胞病變達80%以上時，將CPB細胞置-80 ℃凍融2次收獲病毒液。

將F1～F10代病毒液用L15培養(yǎng)液依次作10倍系列稀釋，取10-5～10-12稀釋度的病毒液，按100 μL/孔的量接種長滿CPB細胞單層的96孔板中，最后一列作為對照，每個稀釋度設8個平行，28 ℃孵育1～2 h后，補加含體積分數(shù)5%血清的L15培養(yǎng)液，置于28 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每日觀察記錄細胞病變孔數(shù)，SCRV接種細胞觀察7～10 d，ISKNV接種細胞觀察10～15 d。用Reed-Muench法[10]計算半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)，即病毒滴度。

1.3 ISKNV和SCRV毒力的測定

選取體長12～15 cm的健康鱖魚160尾，分為8組，每組20尾，在25～28 ℃的循環(huán)水中暫養(yǎng)2周。停止喂飼24 h后攻毒，1，2和3組分別背部肌肉注射F1、F5和F10代SCRV-GM株病毒液(病毒含量為106.5TCID50/mL)0.1 mL/尾；4，5和6組分別背部肌肉注射F1、F5和F10代ISKNV-QY株病毒液(病毒含量為104TCID50/mL)0.1 mL/尾；第7組注射等量的PBS(PBS組)；第8組為空白對照組，不進行注射操作。攻毒后連續(xù)14 d統(tǒng)計死亡率，對病死鱖魚進行剖檢，并采用qPCR法檢測SCRV[11]、ISKNV[12]。

1.4 ISKNV、SCRV毒種的特異性檢測

1.4.1 ISKNV主衣殼蛋白基因序列分析 用DNA提取試劑盒提取F1、F5和F10病毒基因組，備用。根據(jù) GenBank 登錄的ISKNV主衣殼蛋白(major capsid protein，MCP)序列(GenBank登錄號AF371960.1)，用Primer 5軟件設計1對引物，用于擴增MCP基因全長(1 300 bp)，引物序列如下：ISKNV-MCP-F：5′-ATGTCTGCAATCTCAGGT-3′；ISKNV-MCP-R：5′-TTACAGGATAGGGAAG-CCTG-3′。MCP基因擴增PCR反應體系：Premix ExTaq12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL，加雙蒸水至25 μL。反應程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min,共30個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。試驗同時設置陽性對照(用實驗室保存的ISKNV基因組DNA作模板)和陰性對照(用水代替模板)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后送廣州艾基生物科技有限公司測序，將測序結(jié)果與GenBank中序列進行BLAST比對。

1.4.2 SCRV G蛋白基因序列分析 采用TRIzol法提取F1、F5和F10病毒總RNA，備用。根據(jù)GenBank登錄的鱖魚彈狀病毒G蛋白基因序列(GenBank登錄號：DQ399789.1)，用Primer 5軟件設計1對引物，用于擴增G基因全長(1 500 bp)，引物序列如下：SCRV-G-F：5′-ATGAAATCAAT-CATTGCACTTACGT-3′；SCRV-G-R：5′-TTAGG-GAACAAATTGATACTGCTGC-3′。G基因RT-PCR反應體系：2×RT-PCR預混液12.5 μL，上下游引物(20 μmol/L)各0.4 μL，RNA模板2 μL，加雙蒸水至25 μL。反應程序：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。試驗同時設置陽性對照(用實驗室保存的SCRV基因組RNA作模板)和陰性對照(用水代替模板)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后送廣州艾基生物科技有限公司測序，將測序結(jié)果與GenBank中序列進行BLAST比對。

1.5 ISKNV、SCRV毒種的純粹性檢測

1.5.1 細菌、霉菌和支原體檢測 按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》[13]附錄對F1、F5和F10代ISKNV、SCRV毒種進行細菌、霉菌、支原體檢測。

1.5.2 外源病毒檢測 (1) RANA檢測。采用PCR方法檢測ISKNV、SCRV毒種是否有鱖魚蛙病毒(RANA)污染。參照王慶等[14]設計的引物(RANA-F：5′-TATGTGCTCAACTCTTGGCTGGTC-3′；RANA-R：5′-CACGATGGGCTTGACTTCTCC-3′)進行PCR擴增。PCR反應體系：10×TaqPCR Master Mix 2.5 μL，NTP mix(2.5 mmol/L )0.4 μL，上下游引物(20 μmol/L)各0.4 μL，TaqDNA酶0.3 μL，ISKNV或SCRV基因模板2 μL，加雙蒸水至25 μL。PCR反應程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。試驗同時設置陽性對照(用實驗室保存的RANA基因組DNA作模板)和陰性對照(用水代替模板)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

(2)NNV 檢測。 采用RT-PCR方法檢測ISKNV、SCRV毒種是否有神經(jīng)壞死病毒(NNV) 污染。參照Liu等[15]設計的引物(NNV-R3：5′-CGAGTCAACACGGGTGGAGA-3′；NNV-F2：5′-GTGTCAGTCATGTGTCGCT-3′)進行RT-PCR擴增。RT-PCR反應體系：5×逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液10 μL，上下游引物(20 μmol/L)各1 μL，MgCl2(25 mmol/L)5 μL，dNTPs(10 mmol/L )1 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶(5 U/μL)1 μL，RNase抑制劑(20 U/μL)0.5 μL，DNA聚合酶(5 U/μL)1 μL，ISKNV或SCRV基因模板10 μL，加雙蒸水至50 μL。RT-PCR反應程序：42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。試驗同時設置陽性對照(實驗室保存的NNV基因組cDNA作模板)和陰性對照(用水代替模板)。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 ISKNV、SCRV毒種的免疫原性檢測

分別將F1、F5和F10代ISKNV(106TCID50/mL)、SCRV(106.5TCID50/mL)病毒液用甲醛滅活后制備滅活疫苗，備用。選取體長8～10 cm的健康鱖魚540尾，分成9組，每組60尾，25～28 ℃的循環(huán)水暫養(yǎng)2周，停止喂飼24 h后注射免疫。其中1～3組腹腔注射免疫各代次的SCRV滅活疫苗，4～6組腹腔注射免疫各代次的ISKNV滅活疫苗，7～8組腹腔注射PBS(對照組)，免疫組和對照組試驗魚的注射劑量均為0.1 mL/尾。第9組為空白對照組，不進行注射操作。免疫后21 d，各組均取50尾鱖魚進行攻毒，1，2，3和7組注射SCRV-GM株病毒液(106.5TCID50/mL)；4，5，6和8組注射ISKNV-QY株病毒液(104TCID50/mL)，方法、劑量同1.3節(jié)。攻毒后連續(xù)觀察14 d，待魚體穩(wěn)定后統(tǒng)計死亡率并計算免疫保護率(RPS)：RPS=(1-免疫組死亡率/對照組死亡率)×100%。對死亡魚進行剖檢，并采用qPCR法檢測SCRV[11]、ISKNV[12]。

1.7 ISKNV、SCRV毒種的保存期檢測

將1.2節(jié)收獲的ISKNV和SCRV濕毒保存于-80 ℃冰箱，每6個月取3支檢測病毒滴度。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISKNV、SCRV毒種對CPB細胞的致病性和滴度

2.1.1 對CPB細胞的致病性 F1～F10代ISKNV感染CPB細胞后產(chǎn)生的CPE形態(tài)及病變速度基本相同。F10代ISKNV感染后1～2 d，CPB細胞未見明顯變化，只有極少數(shù)細胞由纖維狀慢慢聚攏變圓(圖1-A)；感染后3～4 d部分細胞開始聚縮、腫大，少數(shù)細胞發(fā)生脫落(圖1-B)；感染后5 d，90%以上CPB細胞出現(xiàn)CPE，細胞脫落現(xiàn)象加劇，直至幾乎全部脫落，培養(yǎng)液變得渾濁(圖1-C)。

A～C.分別為感染后2，4，5 d的CPB細胞；D.對照CPB細胞A-C.CPB cells at 2,4 and 5 days post infection;D.Mock-infected CPB cells

F1～F10代SCRV感染CPB 細胞后產(chǎn)生的CPE形態(tài)及病變速度也基本相同。F10 SCRV感染后12 h少數(shù)CPB細胞開始脫落(圖2-A)；感染后24 h，CPB細胞出現(xiàn)拉絲現(xiàn)象，細胞脫落加劇(圖2-B)；感染后36 h 90%以上的CPB細胞脫落(圖2-C)。

A～C.分別為感染后12，24，36 h的CPB細胞；D.對照CPB細胞A-C.CPB cells at 12,24 and 36 hours post infection;D.Mock-infected CPB cells圖2 F10代SCRV感染CPB后細胞病變情況(×10)Fig.2 Cytopathic effects of CPB cells infected with SCRV(×10)

2.1.2 病毒滴度 由圖3可以看出，各代次病毒接種CPB細胞后，SCRV滴度穩(wěn)定在108.58～108.875TCID50/mL，ISKNV滴度穩(wěn)定在107.38～107.625TCID50/mL，各代次間無顯著差異。

圖3 ISKNV和SCRV不同代次毒種的滴度Fig.3 TCID50 of ISKNV and SCRV at different passages

2.2 F1、F5和F10代ISKNV和SCRV對鱖魚的致病力

F1、F5、F10代SCRV接種鱖魚均在攻毒1 d后開始死亡，持續(xù)到第5 天死亡率達90%以上(圖4)；解剖可見，病死鱖魚鰓絲和鰭條基部有出血點，肝臟和脾臟有出血點，腎臟腫大、出血；qPCR試驗可檢測到SCRV。F1、F5、F10代ISKNV接種鱖魚均在攻毒后第5天開始死亡，持續(xù)到第10天，死亡率達95%以上(圖4)；解剖可見，病死鱖魚體色變黑，脾、腎腫大，呈暗紅色；qPCR試驗可檢測到ISKNV。PBS注射組和空白對照組在整個試驗過程中均無病死魚。結(jié)果表明，10代以內(nèi)的SCRV和ISKNV 對鱖魚具有極強的致病力，致死率均可達90%以上。

圖4 感染SCRV和ISKNV后鱖魚的累積死亡率Fig.4 Cumulative mortality of mandarin fish challenged with SCRV and ISKNV

2.3 ISKNV和SCRV毒種的特異性

如圖5所示，F(xiàn)1、F5和F10代SCRV擴增得到了約1 500 bp的目的條帶，ISKNV擴增得到了約1 300 bp的目的條帶，均與預期結(jié)果一致。測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對，本試驗ISKNVMCP基因與GenBank 登錄的ISKNVMCP序列(登錄號：AF371960.1)一致，SCRVG基因與GenBank 登錄的SCRVG序列(登錄號：DQ399789.1)一致，同源性均為100%。

M.DL2000 DNA Marker；1～5.分別為SCRV G基因擴增的陽性對照和F1、F5、F10代病毒及陰性對照； 6～10.分別為ISKNV MCP基因擴增的陽性對照和F1、F5、F10代病毒及陰性對照M.DL2000 DNA Marker;1-5.G gene amplification of SCRV for positive control,F1,F5,F10 and negative control;6-10.MCP gene amplification of ISKNV for positive control,F1,F5,F10 and negative control圖5 F1、F5和F10代SCRV G基因和ISKNV MCP基因PCR擴增結(jié)果Fig.5 Amplification of G gene for SCRV and MCP gene for ISKNV with passages F1,F5 and F10

2.4 ISKNV和SCRV毒種的純粹性檢驗

經(jīng)檢驗，F(xiàn)1、F5和F10代ISKNV和SCRV毒種均無細菌、霉菌、支原體及外源病毒污染。如圖6所示，ISKNV毒種PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后置紫外燈下觀察，RANA檢測陽性對照出現(xiàn)475 bp的電泳條帶,NNV檢測陽性對照出現(xiàn)421～430 bp的電泳條帶，陰性對照和F1、F5、F10 ISKNV毒種均無擴增條帶，說明ISKNV毒種無RANA和NNV污染。SCRV毒種也未檢測到RANA和NNV污染(圖略)。

M.DL2000 DNA Marker；1～4.分別為F1、F5、F10代毒種的NNV檢測及陽性對照；5～8.分別為RANA檢測的陽性對照及F1、F5、F10代毒種;9.陰性對照M.DL 2000 DNA Marker;1-4.NNV detection for F1,F5,F10 and positive control;5-8.RANA detection for positive control,F1,F5 and F10;9.Negative control圖6 F1、F5和F10代ISKNV毒種的NNV和RANA PCR檢測Fig.6 PCR detection of NNV and RANA for ISKNV with passages F1,F5 and F10

2.5 ISKNV和SCRV毒種的免疫原性

SCRV攻毒后，對照組鱖魚第2天開始出現(xiàn)死亡，持續(xù)到第5天，死亡率達90%；免疫組第3天開始出現(xiàn)死亡，持續(xù)到第7天，用F1、F5和F10代SCRV疫苗免疫的死亡率分別為12%，10%和14%。病死魚的剖檢病癥同2.2節(jié)，qPCR試驗均檢測到SCRV。計算各組的RPS，結(jié)果(圖7)表明，10代以內(nèi)的SCRV 毒種制備的疫苗可為鱖魚提供良好的免疫保護力，RPS均在84%以上。

圖7 ISKNV和SCRV的F1、F5和F10代毒種制備疫苗的免疫保護率Fig.7 RSP of vaccines prepared with ISKNV and SCRV at passages F1,F5 and F10

ISKNV攻毒后，對照組第5天開始出現(xiàn)死亡，持續(xù)到第10天，死亡率達95%；免疫組死亡時間有所推遲，從第7天開始出現(xiàn)死亡，持續(xù)到第12天，用F1、F5和F10代ISKNV疫苗免疫組的死亡率分別為6%，6%和8%。病死魚剖檢癥狀同2.2節(jié)，qPCR試驗均檢測到ISKNV?？瞻讓φ战M在整個試驗過程中均無病死魚。計算各組的RPS，結(jié)果(圖7)表明，10代以內(nèi)的ISKNV 毒種制備的疫苗可為鱖魚提供良好的免疫保護力，RPS均在92%以上。

2.6 ISKNV和SCRV毒種保存期

由圖8可知，ISKNV和SCRV濕毒保存于-80 ℃，36個月內(nèi)F1、F5和F10代病毒滴度(TCID50)均無顯著變化，ISKNV高于107.25TCID50/mL，SCRV高于108.5TCID50/mL。因此，2種病毒的保存期暫定為36個月。

圖8 ISKNV和SCRV于-80 ℃條件下保存36個月內(nèi)的滴度變化Fig.8 Titer variation of ISKNV and SCRV stored at -80 ℃ within 36 months

3 討 論

近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；l(fā)展，多種疾病經(jīng)常并發(fā)或相繼發(fā)生[16-17]。聯(lián)合疫苗在降低成本的同時可以減輕對接種對象的應激反應，起到“一針防多病”的目的，在國內(nèi)外已經(jīng)得到廣泛的研究和推廣應用。在國外，多種魚用聯(lián)合疫苗,如殺鮭氣單胞菌、鰻弧菌二聯(lián)滅活疫苗和鯉彈狀病毒、傳染性胰臟壞死病毒二聯(lián)疫苗等已經(jīng)被商品化。在鱖魚的養(yǎng)殖業(yè)中，傳染性脾腎壞死病和彈狀病毒病造成的損失慘重，鑒于目前已報道研發(fā)的疫苗僅僅針對單種疾病的現(xiàn)狀，安全有效的二聯(lián)疫苗的研發(fā)、推廣勢在必行。疫苗生產(chǎn)過程中，毒種質(zhì)量嚴重影響疫苗的免疫效果和穩(wěn)定性。本研究結(jié)果證明，鱖魚傳染性脾腎壞死病、彈狀病毒病二聯(lián)滅活疫苗制苗和攻毒用毒種在10代以內(nèi)的增殖量、特異性、毒力、免疫原性、保存期、純粹性等均相對穩(wěn)定，為二聯(lián)疫苗生產(chǎn)和檢驗用毒種的選用奠定了基礎(chǔ)。

G蛋白是SCRV抗原決定簇的主要蛋白，具有4個結(jié)構(gòu)域，不同彈狀病毒G 蛋白差異性很大，但都具有保守的結(jié)構(gòu)組成[18-21]。本研究選取G蛋白基因作為SCRV鑒定的特異性基因，3個代次的病毒種均能擴增出與GenBank中登錄序列一致的G基因全長序列，同源性為100%，表明10代以內(nèi)SCRV的G基因序列穩(wěn)定，在細胞中傳代未導致該基因發(fā)生變異，具有良好的毒種特異性。MCP是虹彩病毒粒子中豐度最高的蛋白，在虹彩病毒科中高度保守，因此MCP的同源性差異被用來開展虹彩病毒分子進化方面的研究[22]。本研究選取MCP基因作為ISKNV鑒定的特異性基因，所擴增出的F1、F5和F10代ISKNV毒種的MCP基因全長序列與GenBank中登錄序列一致，同源性均為100%，表明10代以內(nèi)ISKNV的MCP基因序列穩(wěn)定，在細胞中傳代未導致該基因發(fā)生變異，具有良好的毒種特異性。

病毒在細胞中傳代可以造成DNA或RNA序列產(chǎn)生一定程度的變異，導致其毒力減弱以及毒力基因發(fā)生突變，傳代次數(shù)越多，與親代的變異就越大。Nakajima等[23]發(fā)現(xiàn)，真鯛虹彩病毒(red sea bream iridovirus，RSIV)感染BF-2細胞后，隨著病毒的連續(xù)傳代感染力迅速下降。Zhao等[24]對雞傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)的研究發(fā)現(xiàn)，1株QX型IBV分離株在SPF雞胚上連續(xù)傳118代后，在雞體內(nèi)的復制能力和致病性均顯著降低。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在10代內(nèi)ISKNV以病毒含量104TCID50/mL、SCRV以病毒含量106.5TCID50/mL，每尾0.1 mL經(jīng)背部肌肉注射健康鱖魚后，各代次毒種對鱖魚的致死率均可達到90%以上，證明毒種的毒力非常穩(wěn)定，可作為強毒株進行檢驗；對感染CPB細胞致病性試驗表明，病毒增殖及復制周期穩(wěn)定，F(xiàn)1～F10代SCRV病毒滴度在108.58～108.875TCID50/mL，ISKNV病毒滴度在107.38～107.625TCID50/mL，各代次間均無顯著差異，由此可見，10代內(nèi)的ISKNV和SCRV可作為種子批進行疫苗的生產(chǎn)。

疫苗的免疫原性決定著疫苗的免疫保護效果，本試驗10代內(nèi)的ISKNV和SCRV制備的滅活疫苗對鱖魚的免疫保護率分別達92%和84%以上，與已報道的鱖魚傳染性脾腎壞死病滅活疫苗和鱖魚彈狀病毒G蛋白DNA疫苗保護率相似。本研究還發(fā)現(xiàn)，與F1和F5代毒種相比，F(xiàn)10代毒種所制備的疫苗免疫保護率稍有下降，ISKNV為91.6%，SCRV為84.4%。劉萍等[25]對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的研究也發(fā)現(xiàn)，隨著體外傳代次數(shù)的增多，疫苗候選株JXM在豬體上過渡致弱，導致其免疫保護力降低。推測，隨著體外傳代次數(shù)的增加，病毒適應細胞生長的突變會逐漸累積，如果這些突變數(shù)量控制在一定范圍內(nèi)，則對病毒在宿主上的免疫原性無顯著影響，但是當這些突變增加到一定程度時則會影響病毒在宿主上的免疫原性。因此確定生產(chǎn)疫苗用毒種的工作代次至關(guān)重要。本試驗結(jié)果顯示，10代以內(nèi)的ISKNV、SCRV對鱖魚的免疫保護率分別可達92%和84%以上，可以起到良好的保護作用，說明10代以內(nèi)的ISKNV和SCRV所制備的滅活疫苗免疫原性相對穩(wěn)定，可以作為種子批用于疫苗生產(chǎn)，這與呂文利等[26]對不同代次乙腦病毒及王春華等[27]對狂犬病毒CTNCEC25株的研究結(jié)果相類似。

綜上所述，10代以內(nèi)的ISKNV和SCRV生物學特性穩(wěn)定，無細菌、霉菌、支原體及外源病毒RANA、NNV污染，符合制苗及檢驗用毒種的質(zhì)量要求，且-80 ℃條件下濕毒保存期可長達36個月。本研究為鱖魚傳染性脾腎壞死病和彈狀病毒病二聯(lián)滅活疫苗毒種庫及種子批的建立提供了理論基礎(chǔ)。