鄧 英,李 強,嚴立恒,張白玉,楊 胡,付 萍,孫珊珊,顏其貴

(四川農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 成都 611130)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)也稱綠膿桿菌，是一種重要且常見的條件性人獸共患致病菌。該菌是醫(yī)院內(nèi)獲得性感染的三大主要病原菌之一，如囊性纖維化肺(CF)[1]、艾滋病HIV[2]及燒傷[3]等患者都是感染的高危人群。感染一旦形成生物膜，更是難以根除[4]。該菌一般不會引起健康機體發(fā)病，而是在人體防御能力受損時乘虛而入。此外，銅綠假單胞菌是林麝化膿性肺炎的主要病原體之一[5]。

林麝是我國一級保護動物，主要分布在陜西省和四川省。由于過度狩獵、棲息地破壞以及缺乏科學管理等原因，導致林麝的種群數(shù)量呈下降趨勢。從1950年前后開始人工繁殖林麝，由于化膿性疾病導致林麝的大規(guī)模繁育出現(xiàn)困難[6]。目前，該病的治療仍采用傳統(tǒng)抗生素。但是大量使用抗生素會促進銅綠假單胞菌的耐藥性增強，導致其治療難度增加。銅綠假單胞菌產(chǎn)生的毒力因子主要包括胞外蛋白酶(降解宿主分泌的介質(zhì)，逃避宿主的防御機制[7-8])、胞外多糖(抵抗宿主細胞的吞噬作用和氧化應激，加強該菌對宿主細胞表面的黏附[9])、內(nèi)毒素(脂質(zhì)A結(jié)合TLR4-MD2，賦予對補體殺傷和陽離子抗微生物肽的抗性[10])、膿青素(促進鐵的螯合作用[11])、外毒素A(導致宿主蛋白質(zhì)生物合成失活[12])和綠膿菌素(pyocyanin，PYO)等。PYO是銅綠假單胞菌分泌的次級代謝物吩嗪之一，也是該菌特有的毒力因子。PYO不僅能促進生物膜的形成，也能誘導氧化應激引起宿主細胞損傷[13]。90%～95%的銅綠假單胞菌分離株都能分泌綠膿菌素[14]。本實驗室從因化膿性肺炎死亡的林麝肺中分離出2株銅綠假單胞菌，其中1株不分泌綠膿菌素命名為ZP-1株；1株分泌綠膿菌素命名為BX-1株。為了更好地研究這2株表型差異的銅綠假單胞菌導致林麝化膿性肺炎的差異性，本研究比較其在體外的毒力因子表達，并且建立了接近于臨床的小鼠急性、慢性肺部感染模型，旨在為林麝化膿性肺炎的治療與防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 銅綠假單胞菌林麝源分離株BX-1株(分泌綠膿菌素)和ZP-1株(不分泌綠膿菌素)，均由四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院微生物與免疫實驗室分離鑒定并保存。

1.1.2 試驗動物 120只CD-1小鼠，6周齡，雌性，體質(zhì)量25 g/只，購于成都達碩實驗動物有限公司。

1.1.3 主要試劑 彈性蛋白-剛果紅(elastin-Congo red，ECR)、偶氮酪蛋白、礦物油，購于Sigma-Aldrich公司；小鼠白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素1(IL-1β)酶聯(lián)免疫分析試劑盒，購于江蘇酶免實業(yè)有限公司；Mouse IFN-gamma ELISA Kit，購于杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；紅細胞裂解液，購于北京索萊寶科技有限公司；96孔板，購于康寧公司；高碘酸、檸檬酸、硝酸銀，購于成都市科隆化學品有限公司；瓊脂糖，購于生工生物工程股份有限公司；10%多聚甲醛固定液，購于武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.1.4 儀器設備 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE52CS-1)，購于上海亞榮生化儀器廠；磁力攪拌器(SH-3)，購于北京市光明醫(yī)療器械有限公司；倒置顯微鏡(TS100)，購于Nikon；低溫組織研磨儀(KZ-Ⅲ-F)，購于武漢賽維爾生物科技有限公司；自動細胞計數(shù)儀(RWD-C100)，購于瑞沃德公司；多功能酶標儀(VARIOSKAN LUX)，購于Thermo。

1.2 ZP-1和BX-1株的毒力表達測定

1.2.1 上清液制備 將ZP-1和BX-1單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫搖床中培養(yǎng)，測定24 h培養(yǎng)物的OD600，并用培養(yǎng)基將其OD600調(diào)成一致。將菌液在4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液并用0.22 μm無菌過濾器過濾，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 毒力因子檢測 胞外蛋白酶LasA和LasB：參考Das等[15]的方法，測定ZP-1株和BX-1株上清液中的LasA和LasB活性。

胞外多糖EPS：將1 mL上清液與2.2倍體積的冷凍無水乙醇混合，-20 ℃下孵育1 h后，于4 ℃下3 500 r/min離心20 min。將含有EPS的沉淀溶解在無菌水中，采用苯酚-硫酸法[16]測定胞外多糖EPS含量。

鼠李糖脂：參考Rasamiravaka等[17]的方法，測定ZP-1株和BX-1株上清液中的鼠李糖脂含量。

膿青素：參考Adonizio等[18]的方法，測定ZP-1株和BX-1株上清液中的膿青素含量。

脂多糖LPS：參考Hitchcock等[19]的方法，提取ZP-1株和BX-1株的脂多糖LPS，并采用Tsai[20]的方法對LPS提取物染色。

1.3 ZP-1和BX-1株對小鼠致病性比較

1.3.1 小鼠急性肺部感染模型的建立 (1)菌懸液的制備。采用LB液體培養(yǎng)基，將ZP-1株和BX-1株置于37 ℃恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)過夜，再按照1∶100的體積比重新接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；菌液以3 000g離心10 min，收集菌體后用無菌的體積分數(shù)0.9% NaCl溶液洗滌3次；最后使用分光光度計調(diào)整菌液濃度為4×104CFU/μL。

(2)氣管插管滴注。小鼠腹腔注射250 μL體積分數(shù)0.75%戊巴比妥鈉溶液麻醉后，利用無創(chuàng)式氣管插管的方法，將22 G留置針插入氣管，向試驗組(ZP-1組和BX-1組)小鼠滴入制備好的菌懸液，對照組小鼠滴入無菌PBS。滴注完成后，轉(zhuǎn)動小鼠身體1 min左右，使菌液在肺部均勻分布。最后將小鼠置于溫暖干凈的鼠籠內(nèi)，恢復清醒。試驗組(ZP-1組、BX-1組)以及對照組各接種10只小鼠。該試驗獨立重復3次。

1.3.2 小鼠慢性肺部感染模型的建立 (1)慢性感染包埋株的制備。采用胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)，將ZP-1株和BX-1株置于37 ℃恒溫搖床中培養(yǎng)過夜，按照1∶10的體積比重新接種于新鮮的10 mL TSB中培養(yǎng)至OD600為0.8～1.2時，2 700 r/min離心15 min，收集細菌菌體；用1 mL PBS重懸菌體，并充分混勻后加入9 mL未凝固的胰酪胨大豆瓊脂糖培養(yǎng)基振蕩混勻，緩慢倒入含有150 mL礦物油的錐形瓶中，500 r/min旋轉(zhuǎn)錐形瓶6 min；將錐形瓶置于冰水浴中繼續(xù)轉(zhuǎn)動35 min后靜置20 min；將靜置后的上層液體倒入50 mL離心管中，于4 ℃、2 700 r/min離心5 min；移去上油層，用無菌PBS清洗，于4 ℃、2 700 r/min離心5 min，反復清洗、離心直至管內(nèi)的瓊脂球呈肉眼可見的憑自重下落，最后加20～30 mL無菌PBS重懸。吸取少量重懸液于孔板內(nèi)，通過倒置光學顯微鏡觀察其形態(tài)與大小。取500 μL制備好的試驗組(ZP-1和BX-1)包埋株進行無菌勻漿，用無菌PBS進行10倍梯度稀釋后涂板，調(diào)整試驗組包埋株濃度為4×104CFU/μL，對照組包埋株做無菌檢驗。

(2)模型建立。按1.3.1節(jié)(2)的方法，將瓊脂糖包埋株遞入小鼠肺中。試驗組(ZP-1組、BX-1組)以及對照組各接種20只小鼠。該試驗獨立重復3次。

1.3.3 肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)的制備 腹腔注射過量的戊巴比妥鈉溶液對小鼠實施安樂死。待小鼠死亡后，固定小鼠，用1 mL一次性注射器抽取0.8 mL預冷的生理鹽水，通過連接留置針軟管注入小鼠氣管內(nèi)，反復抽吸3次，抽出液體放入無菌離心管中，回收率應大于80%。將所得BALF均勻混合后，于4 ℃、1 000 r/min離心10 min，取上清液-80 ℃保存?zhèn)溆?；沉淀用于后續(xù)的白細胞計數(shù)。

1.3.4 肺組織銅綠假單胞菌殘留數(shù)評估 小鼠肺泡灌洗完成后，取100 μL BALF涂板。然后取小鼠肺臟放入組織研磨管，使用低溫研磨機充分研磨，研磨液于4 ℃、1 500 r/min離心10 min，取上清進行10倍稀釋涂板。小鼠肺臟的總細菌負荷量由BALF總細菌數(shù)和組織總細菌殘留數(shù)組成。

1.3.5 白細胞計數(shù) 用500 μL體積分數(shù)0.9% NaCl溶液重懸BALF離心后的沉淀，并取10 μL充分混勻后的重懸液用細胞計數(shù)儀計數(shù)。若離心后有紅色沉淀，采用紅細胞裂解液將紅細胞完全裂解后再進行白細胞計數(shù)。

1.3.6 細胞因子含量檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)的方法[21]，測定BALF中的細胞因子干擾素-γ(interferon-gamma，IFN-γ)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)含量。

1.3.7 病理組織學觀察 取安樂死14 d后的試驗組(ZP-1組和BX-1組)以及對照組小鼠肺組織，放入體積分數(shù)10%多聚甲醛固定液中固定。待組織固定完全后，經(jīng)過脫水、石蠟包埋、漂片、攤片和烘片后進行蘇木精-伊紅H&E染色、鏡檢。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0軟件以及GraphPad Prism 7.00軟件處理試驗數(shù)據(jù)并作圖，采用單因素方差分析或t檢驗進行不同組間比較分析。檢驗水平α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅綠假單胞菌ZP-1和BX-1株的毒力因子檢測

由表1可知，BX-1株的胞外蛋白酶LasA和LasB活性略高于ZP-1株，但二者差異不顯著(P>0.05)；ZP-1株的胞外多糖EPS含量顯著高于BX-1株，而鼠李糖脂含量卻顯著低于BX-1株(P<0.05)；ZP-1株的膿青素含量顯著高于BX-1株(P<0.05)。

表1 銅綠假單胞菌ZP-1和BX-1株體外毒力因子表達量的比較Table 1 Comparison of in vitro virulence expression of ZP-1 and BX-1 of Pseudomonas aeruginosa

由圖1可見，ZP-1和BX-1株的LPS均具有O-抗原，屬于平滑性LPS，這與其在固體培養(yǎng)基上的菌落特征相符；但其在核心多糖處的結(jié)構(gòu)具有明顯差異。

圖1 銅綠假單胞菌ZP-1和BX-1株脂多糖結(jié)構(gòu)對比Fig.1 Comparison of lipopolysaccharide structure of ZP-1 and BX-1 of Pseudomonas aeruginosa

2.2 急性和慢性感染ZP-1和BX-1株小鼠致病性的比較

2.2.1 小鼠肺組織銅綠假單胞菌殘留數(shù) 急性肺部感染時，ZP-1組小鼠肺組織銅綠假單胞菌殘留數(shù)略高于BX-1組，但二者差異不顯著(P>0.05)；隨著感染時間延長，兩組小鼠肺組織銅綠假單胞菌殘留數(shù)均降低；對照組未檢出銅綠假單胞菌(圖2-A)。慢性肺部感染時，隨著感染時間的延長，ZP-1和BX-1組小鼠肺組織銅綠假單胞菌殘留數(shù)均呈先降低后升高的趨勢；在感染的第3天，ZP-1和BX-1組的銅綠假單胞菌殘留數(shù)差異顯著(P<0.05)；對照組未檢測出銅綠假單胞菌(圖2-B)。綜上所述，隨著感染時間的延長，無論是急性肺部感染還是慢性肺部感染，小鼠肺組織銅綠假單胞菌殘留數(shù)均逐漸減少。

A.急性感染；B.慢性感染A.Acute infection；B.Chronic infection圖柱上標不同小寫字母表示同一時間不同組間差異顯著(P<0.05)。下同Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05). The same below圖2 小鼠急性和慢性肺臟感染模型中的銅綠假單胞菌殘留數(shù)Fig.2 Residual number of Pseudomonas aeruginosa in acute and chronic lung infection models in mice

2.2.2 小鼠BALF中的白細胞總數(shù) 急性肺部感染時，ZP-1組小鼠肺泡灌洗液(BALF)中白細胞總數(shù)高于BX-1組，但二者差異不顯著(P>0.05)；隨感染時間延長，ZP-1和BX-1組小鼠BALF中白細胞總數(shù)均有增加；與對照組相比，ZP-1和BX-1組小鼠BALF中白細胞總數(shù)均顯著增高(圖3-A)。慢性肺部感染時，BX-1和ZP-1組小鼠BALF中白細胞總數(shù)的變化趨勢相似，均呈先降低再趨于穩(wěn)定的變化趨勢；除感染第3天外，其余感染時間段ZP-1組小鼠BALF中白細胞總數(shù)顯著高于BX-1組和對照組；對照組小鼠BALF中白細胞總數(shù)除在接種的第1天略有升高外，其他感染階段無明顯異常；與對照組相比，ZP-1和BX-1組小鼠BALF中白細胞總數(shù)均顯著增高(圖3-B)。綜上所述，隨著感染時間的延長，小鼠急性感染時BALF中白細胞總數(shù)呈上升趨勢，而慢性感染時則相反。白細胞的明顯增高表明接種感染性包埋株后，引起了小鼠肺部持續(xù)性炎癥的發(fā)生。

A.急性感染；B.慢性感染A.Acute infection；B.Chronic infection

2.2.3 小鼠BALF中的細胞因子含量 利用酶聯(lián)免疫法檢測試驗組(ZP-1組和BX-1組)和對照組小鼠肺泡灌洗液(BALF)中免疫炎性因子IL-1β、IL-6和IFN-γ含量的變化，結(jié)果見圖4～6。 由圖4可知，急性感染階段，隨著感染時間的延長，試驗組小鼠BALF中IL-1β含量呈下降趨勢。感染12 h時，ZP-1組小鼠BALF中IL-1β含量高于BX-1組；感染24 h時,ZP-1組小鼠BALF中IL-1β含量略低于BX-1組，但二者差異均不顯著(P>0.05)；與對照組相比，試驗組小鼠BALF中IL-1β含量顯著升高。慢性感染階段，隨著感染時間的延長，試驗組小鼠BALF中IL-1β含量呈逐漸升高的趨勢，對照組小鼠BALF中IL-1β含量呈下降趨勢。除感染后第14天外，其余感染時間ZP-1組小鼠BALF中IL-1β含量均高于BX-1組；試驗組小鼠BALF中IL-1β含量顯著高于對照組(除感染第3天外)。

A.急性感染；B.慢性感染A.Acute infection；B.Chronic infection

由圖5可知，急性感染階段，隨著感染時間的延長，試驗組小鼠BALF中IL-6含量略有降低。感染12 h時，ZP-1組小鼠BALF中IL-6含量顯著高于BX-1組；感染24 h時，ZP-1組小鼠BALF中IL-6含量顯著低于BX-1組(P<0.05)；與對照組相比，感染的各個時期試驗組小鼠BALF中IL-6含量均顯著升高(P<0.05)。慢性感染階段，隨著感染時間的延長，試驗組小鼠BALF中IL-6含量逐漸升高，對照組小鼠BALF中IL-6含量逐漸降低；除感染第14天外，ZP-1組小鼠BALF中IL-6含量均高于BX-1組；與對照比相比，感染各個時期試驗組小鼠BALF中IL-1β含量均顯著升高。

A.急性感染；B.慢性感染A.Acute infection；B.Chronic infection

由圖6可知，急性感染階段，隨著感染時間的延長，小鼠BALF中IFN-γ含量逐漸降低；感染12和24 h，ZP-1組小鼠BALF中IFN-γ含量均高于BX-1組，其中感染12 h時二者差異不顯著，感染24 h時二者差異顯著(P<0.05)；與對照組相比，試驗組小鼠BALF中IFN-γ含量均顯著升高。慢性感染階段，隨著感染時間的延長，試驗組小鼠BALF中IFN-γ含量逐漸降低，對照組小鼠BALF中IFN-γ含量無明顯異常；同一感染時期ZP-1組和BX-1組小鼠BALF中IFN-γ含量差異不顯著(P>0.05)，但二者均顯著高于對照組(P<0.05)。

2.2.4 小鼠肺臟組織病理學觀察 從小鼠急性感染后24 h的肺組織病理切片結(jié)果(圖7)可以看出，ZP-1組和BX-1組均有明顯的宿主損傷以及炎癥浸潤；大面積肺泡壁增厚，肺泡腔狹窄，可見大量粒細胞、紅細胞散分布；支氣管上皮細胞形態(tài)正常，少量支氣管內(nèi)可見粒細胞浸潤；肺泡腔內(nèi)及支氣管內(nèi)廣泛可見粒細胞散在分布；對照組無明顯異常。

A.對照組；B.ZP-1組；C.BX-1組A.Control group；B.ZP-1 group；C.BX-1 group圖7 小鼠急性肺部感染的組織切片(感染24 h)(HE×200)Fig.7 Tissue section of acute lung infection in mice(24 hours after infection)(HE×200)

從小鼠慢性感染第14天的肺組織病理切片結(jié)果(圖8)可以看出，與對照組相比，ZP-1組和BX-1組小鼠的肺組織雖然仍有肺泡結(jié)構(gòu)，但肺泡間隔明顯增厚，且具有明顯的炎性細胞浸潤。

A.對照組；B.ZP-1組；C.BX-1組A.Control group；B.ZP-1 group；C.BX-1 group

3 討 論

銅綠假單胞菌是一種革蘭氏陰性機會病原體，具有強大的基因組和環(huán)境適應能力。綠膿菌素是銅綠假單胞菌的重要毒力因子，不僅能促進生物膜的形成，還具有誘導多藥外排泵的表達等作用。研究顯示，不同銅綠假單胞菌分離株的綠膿菌素分泌水平差異很大，可能是由于適應宿主導致毒力表達降低[22-23]。比較野生型和綠膿菌素缺陷的銅綠假單胞菌菌株發(fā)現(xiàn)，綠膿菌素缺陷型銅綠假單胞菌導致更高的死亡率，并且在大鼠的肺氣道中誘導更廣泛的肺泡壁增厚[24]。但目前針對綠膿菌素分泌缺陷的大部分研究都是選擇性缺失掉phzM基因后得到的結(jié)果[25]，只有較少文獻研究綠膿菌素缺陷的野生型。選擇性缺失導致的表型消失是人為介導的改變，而野生株的出現(xiàn)是在與宿主動態(tài)相互作用中逐漸形成的，所以對野生株的深入研究具有一定臨床意義。

細菌的致病性與其毒力密切相關。本研究體外毒力檢測發(fā)現(xiàn)，ZP-1株分泌LasA和LasB的能力略低于BX-1株，但二者差異不顯著，表明在感染階段ZP-1株和BX-1株對宿主分泌的細胞介質(zhì)的降解能力差異不大。鼠李糖脂在銅綠假單胞菌侵襲宿主時具有抵抗先天性免疫的作用。本研究中ZP-1株的鼠李糖脂分泌量低于BX-1株，該結(jié)果與預期相符，這是由于綠膿菌素會間接促進鼠李糖脂的合成；ZP-1株可產(chǎn)生大量的膿青素，膿青素不僅是銅綠假單胞菌重要的鐵載體，同時也能上調(diào)外毒素A表達的信號通路[26]；ZP-1株和BX-1株的LPS在核心多糖處的結(jié)構(gòu)有明顯差異，致病性可能有所不同，需要進一步試驗證實。

本研究中，選擇小鼠為建模動物，采用無創(chuàng)式氣管插管以及制備瓊脂糖包埋株的方法，建立小鼠肺部感染模型。急性肺部感染通常會引起壓倒性的宿主損傷；而在慢性肺部感染期間，銅綠假單胞菌會調(diào)整自身的侵襲力和毒力以達到適應宿主環(huán)境，與宿主長期共存。目前常見的慢性包埋株載體主要有瓊脂糖和海藻酸鹽等。本試驗選擇瓊脂糖作為包裹載體，因其能夠提供一種微厭氧環(huán)境，并具有從單細胞發(fā)展到微菌落的細菌繁殖所需的基本養(yǎng)分。在肺部感染階段，宿主會啟動炎癥反應來抵抗入侵的病原體。由微生物感染引起的主要促炎性細胞因子包括IL-1β和IL-6等，其能協(xié)調(diào)白細胞募集至感染位點[27]。隨著感染時間的延長，肺部炎癥也會持續(xù)發(fā)生，其中BALF中的白細胞水平反應了肺部炎癥的感染免疫應答水平[28]。本研究所建立的小鼠肺部急性、慢性感染模型中，ZP-1組小鼠引起宿主的炎癥水平均高于BX-1組；在急性感染過程中，ZP-1和 BX-1株在感染12 h后雖然小鼠機體逐漸清除了細菌，但是炎癥仍在發(fā)生；在慢性感染過程中，ZP-1和 BX-1組小鼠BALF中IL-1β和IL-6含量呈逐漸升高的趨勢，而IFN-γ含量則是逐漸降低，說明所建立的小鼠感染模型是成立的。

綜上所述，銅綠假單胞菌ZP-1株和BX-1株的毒力因子分泌側(cè)重不一樣，ZP-1株引起肺部感染小鼠的致病性較BX-1株更強。