盧宏博，夏寧，馮傳陽，魏海峰，劉長發(fā)

（1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.遼寧省近岸海洋環(huán)境科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，遼寧 大連 116023；3.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023）

赤潮是海洋中微型浮游生物快速增殖、聚集，破壞生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能的一種生態(tài)異?，F(xiàn)象[1]。赤潮的發(fā)生與沿岸海域富營養(yǎng)化的關(guān)系是人們關(guān)注的焦點問題之一[2-5]。海洋環(huán)境中氨氮含量的變動等不僅影響赤潮生物的生理生化組成，也決定了赤潮形成的規(guī)模和程度[6]。大型海藻吸收營養(yǎng)元素（N、P）的效率高，并具一定的經(jīng)濟效益，用大型海藻修復(fù)海洋富營養(yǎng)化和治理的技術(shù)，受到高度關(guān)注。

提高用大型海藻修復(fù)和治理水體環(huán)境的效果已成為發(fā)展海洋環(huán)境修復(fù)和治理技術(shù)的關(guān)鍵問題，我國加強了對大型藻吸收營養(yǎng)鹽相關(guān)機理的探索與研究。胡章喜等[7]研究表明，海洋微藻能利用有機氮源，在無機氮缺乏而有機氮豐富的水體中，微藻有很強的競爭優(yōu)勢。王翔宇等[8]表明海藻對氮磷有明顯的去除作用。呂冬偉等[9]研究了孔石莼Ulva pertusa 在不同濃度營養(yǎng)鹽養(yǎng)殖廢水中的凈化作用，表現(xiàn)了良好的防治水體富營養(yǎng)化的應(yīng)用前景。胡勁召等[10]認(rèn)為，利用石莼處理養(yǎng)殖廢時間短、效率高，可處理富營養(yǎng)化水體或養(yǎng)殖廢水。張亮等[11]明確了不同存在形態(tài)的氮、氮磷比會影響藻類的光合速率和生長速率。張忠山等[12]綜述了幾種大型石莼屬綠藻在不同環(huán)境因子脅迫下的生理生化特征變化及其調(diào)控機制，為近海海域環(huán)境治理提供科學(xué)了依據(jù)。

目前大多數(shù)研究主要集中在大型海藻對受N、P 污染富營養(yǎng)化海域的生物修復(fù)方面，證明海藻對各種重金屬均有一定的富集能力[13]，且積累量隨著海水重金屬濃度的增加而增加，但關(guān)于重金屬對海藻的毒性效應(yīng)、致毒機理以及對重金屬的耐受能力及修復(fù)機制等研究報道甚少。本實驗著重研究了重金屬Cu2+和Cd2+的脅迫對孔石莼吸收氮磷速率的影響，為今后利用孔石莼改善海洋環(huán)境、修復(fù)海洋富營養(yǎng)化提供科學(xué)理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用孔石莼采自大連市黑石礁海域，經(jīng)室內(nèi)培養(yǎng)一段時間，選取生長良好的部分用于實驗。實驗用海水為大連黑石礁海區(qū)砂濾海水，鹽度31、pH 8.0～8.1。

實驗所需主要藥品為：三氯甲烷（分析純）、磷酸二氫鉀（分析純）、氯化鈉（分析純）、硫酸銅（分析純）、硫酸氨（分析純）、f/2 配方（除氮磷以外的微量元素）。按照實驗設(shè)定的時間間隔取適量水樣進行保存和檢測。

1.2 方法

實驗在屋頂為半透明板材的實驗室（22℃）中進行，自然光條件下用多瓶法和干擾法測定在Cu2+、Cd2+脅迫下孔石莼對氮磷營養(yǎng)元素（NH4+-N 和PO43--P）的吸收率[14]。

實驗用盛水500 mL 的1 000 mL 燒杯中進行。以（NH4）2SO4為氮源，KH2PO4為磷源。NH4+-N 濃度梯度為：0 mg/L、0.25 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L 和2.0 mg/L，N∶P＜16∶1，保證磷過量；PO43--P濃度梯度為：0 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.4 mg/L 和0.5 mg/L，N∶P＞16∶1，保證氮過量。每組濃度設(shè)置3 個平行，每個燒杯按1 mL/L 加入f/2 配方（除氮磷以外的微量元素），經(jīng)室內(nèi)培養(yǎng)馴化后的孔石莼，選取生長良好部分切成1 cm×1 cm，以1 g/L生物量投放于燒杯中，隨后定量加入Cu2+和Cd2+，均設(shè)兩個濃度0.5 mg/L 和1 mg/L，開始孔石莼對氮磷營養(yǎng)元素吸收實驗。

實驗從早上8：00 開始，持續(xù)12 h，期間采用自然光源，光照強度平均值為（4 000±500）lux。實驗開始后0.25 h、0.5 h、1 h、3 h、6 h 12 h 取樣10 mL，置于冰箱保存。水樣水質(zhì)分析主要采用BRAN+LUBEE 公司的AutoAnalyzer3 型自動水質(zhì)分析儀測定樣品中氮磷的含量，溫度用溫度計直接讀取。NH4+-N 和PO43--P 濃度分別采用靛酚藍分光光度法和磷鉬藍分光光度法測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS25 統(tǒng)計軟件和Excel 進行統(tǒng)計分析和數(shù)據(jù)處理，用t 檢驗法方差分析檢測平均數(shù)之間的差異（P），以P＜0.05 作為差異的顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 無重金屬脅迫下孔石莼對氮磷營養(yǎng)元素的吸收

如圖1 所示，孔石莼對氮磷營養(yǎng)鹽的平均吸收速率隨營養(yǎng)鹽濃度及吸收時間的變化而變化；其吸收符合三個階段[15]，即快速吸收階段（surge up take）、內(nèi)部控制的吸收階段（internally controlled up take）和外部控制的吸收階段（externally controlled up take）三階段。在0～15 min 內(nèi)孔石莼對氮磷的吸收速度最快，30～720 min 內(nèi)，吸收速率大幅下降，符合前人研究發(fā)現(xiàn)的規(guī)律。

圖1 對照組孔石莼對氮磷營養(yǎng)鹽的吸收速率Fig.1 Absorption rate of to nitrogen and phosphorus by sea lettuce Ulva pertusa in the control group

2.2 Cu2+脅迫下孔石莼對NH4+-N 的吸收

由圖2 可知，在磷含量不受限制的情況下，0.5和1 mg/L Cu2+脅迫下，孔石莼吸收NH4+-N 的速率隨著NH4+-N濃度的增加而增加，并隨著Cu2+濃度的增加抑制率顯著逐漸降低（P＜0.05）。

圖2 在0.5 mg/L、1.0 mg/L Cu2+脅迫下孔石莼對NH4+-N營養(yǎng)鹽的吸收速率Fig.2 Absorption rate of NH4+-N by sea lettuce Ulva pertusa exposed to stress of at 0.5 mg/L、1.0 mg/L Cu2+

在0.5 mg/L Cu2+脅迫下，孔石莼吸收氮的速率變化規(guī)律與對照組較為相似，可分為三個階段，但吸收速率均有提高，相鄰時間段的吸收速率差值較對照組減?。辉?.0 mg/L Cu2+的脅迫下，在初始階段（15～60 min）孔石莼對NH4+-N的吸收速率顯著增加，與其他時間段的吸收速率趨于同步。在兩個濃度的脅迫下，孔石莼對NH4+-N的吸收速率均可分為3 個階段：第1 個階段為快速吸收階段（0～60 min），第2 個階段為過渡階段（120 min），第3 個階段為緩慢吸收階段（360～720 min）。魏海峰等[16]認(rèn)為，吸收速率隨時間而變化的原因可能是海藻處于NH4+-N限制時，開始的快速吸收是用于充盈細胞內(nèi)營養(yǎng)庫的階段；吸收率下降至穩(wěn)定階段則是充盈細胞內(nèi)NH4+-N的反饋抑制作用；接著是由介質(zhì)營養(yǎng)鹽濃度控制的吸收，隨著介質(zhì)營養(yǎng)鹽的消耗，吸收速率迅速下降。

2.3 Cd2+脅迫下孔石莼對NH4+-N的吸收

如圖3 所示，在磷不受限制的情況下，0.5 mg/L Cd2+的脅迫對孔石莼吸收NH4+-N的速率影響不明顯。在1 mg/L Cd2+脅迫下，實驗開始15 min 內(nèi)孔石莼對NH4+-N吸收的速率顯著加快，最大達9.3 mg/（g·h），但30～720 min 內(nèi)吸收速率顯著低于對照組，對孔石莼吸收NH4+-N速率已無明顯影響，吸收速率一直控制在0.2 mg/（g·h）左右，并不隨NH4+-N 初始濃度的提高而提高，Cd2+表現(xiàn)出了對孔石莼吸收NH4+-N的抑制作用，抑制率達到55.4%。朱喜鋒等[17]研究表明，Cd2+對藻類的毒性作用主要在于Cd2+可以結(jié)合到生物大分子的活性位點，不僅能與酶活性中心的巰基結(jié)合，還能取代金屬蛋白中的必需元素，導(dǎo)致生物大分子構(gòu)象改變、酶活性喪失及必需元素缺乏，干擾細胞的正常代謝。鎘可以使藻體發(fā)生氧化脅迫產(chǎn)生活性氧（ROS），影響藻體的光合作用器官和重要的酶活性，較長的Cd2+脅迫會顯著降低石莼吸收NH4+-N的速率，影響藻類的正常生長。

圖3 在0.5 mg/L、1.0 mg/L Cd2+脅迫下孔石莼對NH4+-N營養(yǎng)鹽的吸收速率Fig.3 The absorption rate of NH4+-N by sea lettuce Ulva pertusa under 0.5 mg/L and 1.0 mg/L Cd2+stress

2.4 Cu2+、Cd2+脅迫下孔石莼對PO43--P 的吸收

如圖4 所示，在低濃度PO43--P下，Cu2+對孔石莼吸收的抑制作用較為明顯，PO43--P濃度在0.1～0.2 mg/L 時，孔石莼吸收PO43--P的速率為負值，PO43--P濃度為0.2 mg/L 及以上時，孔石莼吸收速率才為正值。張亮等[11]實驗結(jié)果表明，藻穩(wěn)定生長狀態(tài)時，磷酸鹽濃度必須高于0.2 mg/L，這與孔石莼對PO43--P的吸收在0.2 mg/L 為正值的現(xiàn)象相符合。以實驗12 h 內(nèi)的平均吸收速率觀察，Cu2+對孔石莼吸收PO43--P速率受時間和濃度的影響較大，低濃度PO43--P條件下，孔石莼對PO43--P的吸收很少，甚至出現(xiàn)磷濃度增長現(xiàn)象，這與藻類受金屬Cu2+脅迫釋放磷有關(guān)。

圖4 在1.0 mg/L Cu2+脅迫下孔石莼對PO43--P營養(yǎng)鹽的吸收速率Fig.4 Absorption rate of PO43--P by sea lettuce Ulva pertusa under 1.0 mg/L Cu2+stress

如圖5 所示，在0～60 min 內(nèi)Cd2+對孔石莼吸收的抑制作用較為明顯，60 min 以后，孔石莼吸收速率才有所加快，以12 h 內(nèi)的平均吸收速率觀察，Cd2+對孔石莼吸收PO43--P速率影響和Cu2+類似，也有很大影響，后期孔石莼對PO43--P的吸收速率接近于0.0523 mg/（g·h），抑制率為67.34%。

圖5 在1.0 mg/L Cd2+脅迫下孔石莼對PO43--P營養(yǎng)鹽的吸收速率Fig.5 Absorption rate of PO43--P by sea lettuce Ulva pertusa under 1.0 mg/L Cd2+stress

3 討論

3.1 Cu2+、Cd2+脅迫下孔石莼對氮磷的吸收特點

在NH4+-N濃度為0.25～2.0 mg/L 時，對照組孔石莼對NH4+-N吸收速率在20.8～166 μg/（g·h）之間，呈快吸收現(xiàn)象，而在0.5 mg/L Cu2+脅迫下，平均吸收速率在19.1～126 μg/（g·h）；Cd2+脅迫下的平均吸收速率在20.6～157 μg/（g·h）之間；在Cu2+脅迫下孔石莼吸收NH4+-N的快吸收現(xiàn)象不明顯。短時間內(nèi)Cu2+（1.0 mg/L）、Cd2+（1.0 mg/L）對孔石莼吸收PO43--P的抑制作用也較強。Cu2+、Cd2+分別脅迫影響顯著孔石莼對PO43--P吸收的動力學(xué)過程。本實驗發(fā)現(xiàn)，磷酸鹽含量出現(xiàn)比前一個時間段升高的情況。大量研究表明[20-22]，在細胞外金屬離子會結(jié)合到細胞壁的多糖上，發(fā)生金屬離子的排斥作用，或是改變細胞膜上金屬離子的運輸通道，使金屬離子在細胞膜上改變價態(tài)、或轉(zhuǎn)變成無毒性的有機金屬化合物。

Cu2+對孔石莼吸收NH4+-N的影響比Cd2+強，抑制程度更大。同濃度的Cu2+、Cd2+脅迫下，1 mg/L Cu2+和Cd2+對不同起始濃度NH4+-N的最大抑制率分別為37.1%～55.4%和1.24%～9.68%，說明在本實驗條件下Cu2+的毒性遠大于Cd2+。朱喜鋒[17]、張海波[18]研究表明，重金屬顯著影響海藻光合色素含量、光合作用、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶和硝酸還原酶（NR）活性及丙二醛（MDA）含量等生理生化指標(biāo)，Cu2+的毒性效應(yīng)相對弱一些，且低濃度Cu2+對藻體的生長有一定的促進作用；當(dāng)其在較高濃度時抑制效應(yīng)開始顯現(xiàn)，葉綠素a、可溶性蛋白及甘露醇含量下降，過氧化物酶（POD）活性和丙二醛含量升高。Cd2+的脅迫作用沒有Cu2+強，在高濃度、長時間作用下才表現(xiàn)出顯著的抑制效應(yīng)。

藻類對重金屬脅迫是生理上一系列的響應(yīng)，一些耐受性機理還尚不清楚，一些研究結(jié)果甚至不一致，因此需要進一步從分子水平、細胞水平及機體水平進行廣泛深入研究。

3.2 Cu2+、Cd2+對藻類毒性作用的機理

Liu 等[19]和Wang 等[20]研究表明，Cu2+比較特殊，具有雙重作用,既是藻類代謝必需的微量營養(yǎng)元素,又是有毒的重金屬,其含量超過毒性效應(yīng)閾值,對藻類的生長有較大的毒性。本實驗中，Cu2+為藻類代謝必需的微量營養(yǎng)元素。林碧琴等[21]認(rèn)為，在非致死濃度范圍內(nèi)（0.25～1.5 mg/L Cd2+），隨Cd2+濃度增加強烈影響DNA 酶、脫氫酶和過氧化物酶活性，強烈抑制光合作用和細胞膜透性。但在本實驗中，其脅迫效果并不明顯，抑制率在10%以下，可能與大型藻具有解除金屬毒性或增加其耐受力的機制有關(guān)。

重金屬影響孔石莼吸收營養(yǎng)鹽速率的機理有二：一種是重金屬與酶蛋白的某些結(jié)合形成螯合物,使酶的結(jié)構(gòu)與構(gòu)型發(fā)生變化而影響酶的活性，使其吸收速率減慢[23]；二種可能是重金屬的作用使作為酶的輔助因子的金屬離子的吸收和利用受阻[24]。重金屬抑制海藻營養(yǎng)代謝的原因是重金屬能阻止海藻細胞分裂，破壞細胞內(nèi)含物，降低酶的活性，產(chǎn)生抑制作用。魏海峰等[16]認(rèn)為：重金屬對藻類產(chǎn)生抑制作用的原因,還可能是重金屬影響了藻類的酶活性。大型藻具有降低重金屬毒性或增加自身耐受力的機制，藻類的胞外產(chǎn)物在細胞外結(jié)合金屬離子，以達到解毒的作用。結(jié)合到細胞壁上的多糖可排斥金屬離子，或改了細胞膜上金屬離子的運輸通道，細胞內(nèi)的多糖可使金屬離子改變價態(tài)或轉(zhuǎn)變成無毒性的有機金屬化合物，以達到解毒作用。