趙文聞，徐黎明，陳桂花，段凱越，趙景壯，任廣明，邵軼智，張穎，盧彤巖

（1.大連海洋大學(xué)，遼寧 大連 116023；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江省水生動物病害與免疫重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510380）

傳染性胰腺壞死病（Infectious pancreatic necrosis，IPN）是鮭鱒魚類最為嚴(yán)重的傳染性疾病之一。該病病原傳染性胰臟壞死病毒（Infectious pancreatic necrosis virus，IPNV）隸屬于雙RNA 病毒科Birnaviridae、水生雙RNA 病毒屬Aquabirnavirus[1]。IPNV 為二十面體對稱，無囊膜，直徑為50～75 nm，核酸為雙鏈RNA[2,3]，主要危害虹鱒Onchorhynchus mykiss、美洲紅點鮭Salvelinus fontinalis、褐鱒Salmo trutta、大西洋鮭Salmo salar 和大麻哈屬Oncorhynchus spp.的魚苗及幼魚[4]。不同毒株、宿主和環(huán)境因素,IPNV可造成宿主10%～90%的死亡率[5,6]。IPNV 在美國[7]、法國[8]、土耳其[9]、智利[10]、墨西哥[11]、芬蘭[12]、挪威[13]、西班牙[14]、日本[15]、韓國[16]以及伊朗[17]等國家均有檢出。IPNV 最早于20 世紀(jì)80 年代在我國甘肅[18]、山西[19]以及山東[20]等地被檢出，近些年又從四川省[21]以及云南省[22]分離到IPNV 毒株。本實驗室于2013—2020 年在我國鮭鱒主養(yǎng)區(qū)進(jìn)行IPNV流行病學(xué)監(jiān)測過程中分離到了大量的IPNV 毒株[23]。目前尚無有效防治IPN 的藥物，進(jìn)行IPNV檢測，阻止病毒的流通擴(kuò)散，對減少我國虹鱒養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失具有重要的意義。

目前用于IPNV 檢測的方法有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）、實時熒光定量PCR、酶聯(lián)免疫吸附測定法、免疫熒光法、基因探針法[24-26]、基因芯片法[27]原位雜交法[28]以及環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[29,30]等多種方法，其中PCR 是最常用的實驗室檢測方法。該方法需擴(kuò)增提取病毒的核酸，但擴(kuò)增效果受病毒含量的影響，通常會先利用敏感細(xì)胞對病毒進(jìn)行擴(kuò)增，然后再檢測出現(xiàn)細(xì)胞病變的細(xì)胞培養(yǎng)物的病毒。江育林等[19]研究結(jié)果表明：目前可用于IPNV 體外培養(yǎng)的細(xì)胞系有鯉上皮瘤細(xì)胞（Epit helioma papulosum cyprini，EPC）、大鱗大麻哈魚胚胎細(xì)胞（Chinook salmon embryo，CHSE-214）、虹鱒性腺細(xì)胞（Rainbow trout gonad，RTG-2）、虹鱒肝細(xì)胞（Liver cells of rainbow trout，R1）、狗魚性腺細(xì)胞（Gonad cells of pike，PG）等魚類細(xì)胞系。劉淼等[31]研究發(fā)現(xiàn)，IPNV ChRtm213 分離株可在CHSE-214 和RTG-2 細(xì)胞上增殖，并產(chǎn)生典型細(xì)胞病變，但CHSE-214 比RTG-2 細(xì)胞具有更好的敏感性。現(xiàn)有研究表明，CHSE-214 細(xì)胞和RTG-2 細(xì)胞是IPNV 體外培養(yǎng)最常用細(xì)胞系。為篩選出IPNV 體外培養(yǎng)最佳敏感細(xì)胞系，本研究將實驗室保存的24 株IPNV 分離株分別接種于CHSE-214 和RTG-2 細(xì)胞，通過細(xì)胞病變情況比較這兩種細(xì)胞對IPNV 的敏感性，確定IPNV 敏感細(xì)胞并分析IPNV 毒株在敏感細(xì)胞上的增殖特性，以期為IPNV 的檢測提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究中所用的全部IPNV 分離株由本實驗室分離保存[23]。CHSE-214 細(xì)胞和RTG-2 細(xì)胞由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所魚類病害教研室曾令兵研究員惠贈。胎牛血清、胰蛋白酶、MEM 培養(yǎng)基（Minimum essential medium）購自Gibco 公司，青霉素-鏈霉素購自ThermoFish 公司；TRIzol Reagent 購自Invitrogen 公司；PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

從液氮罐里取出CHSE-214 和RTG-2 細(xì)胞，將其置于30℃水浴鍋融化，在無菌條件下將其移入15 mL 離心管中，1 000 g/min 離心2 min，棄去凍存液，加入1 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液（MEM 培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗）吹勻，之后將細(xì)胞移入T-25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加4 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液，置于18℃二氧化碳生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待長成均勻的單層細(xì)胞，用胰蛋白酶消化并用細(xì)胞培養(yǎng)液吹打混勻，放入新T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行1∶2 傳代培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞敏感性分析

將24 株IPNV 分離株以1 000 TCID50的劑量分別接種于單層RTG-2 和CHSE-214 細(xì)胞上，連續(xù)觀察7 d。每天觀察細(xì)胞變化，記錄在RTG-2 和CHSE-214 細(xì)胞上病變的IPNV 毒株數(shù)量，以確定IPNV 最敏感細(xì)胞系，用以開展IPNV 在最佳敏感細(xì)胞上的增殖特性研究。

1.4 IPNV 在CHSE-214 細(xì)胞上增殖的實驗設(shè)計

將IPNV 毒株ChRtm213 分別以10 TCID50和100 TCID50的劑量接種于六孔板上的CHSE-214 單層細(xì)胞中，每天在顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞病變情況，并在接種后第1、2、3、4、5 d 收獲細(xì)胞培養(yǎng)物。每3 個孔為一個平行樣，凍存于-80℃冰箱備用。

1.5 IPNV 在CHSE-214 細(xì)胞上增殖的分析

每個平行孔取200 μL 病毒液于一個EP 管中，混勻后取出200 μL 病毒液于無RNA 酶的離心管中，用Trizol 法提取病毒RNA[32]。分別以IPNV A 鏈和IPNV B 鏈為靶標(biāo)基因，β-actin 為內(nèi)參基因，對各組樣品中IPNV 載量的變化情況進(jìn)行RT-qPCR分析。反應(yīng)體系（20 μL）包括：10 μL 2×One Step TB Green RT-PCR Buffer 4、1.2 μL TaKaRa Ex Taq HS Mix、0.4 μL PrimeScript PLUS RTase Mix、2 μL RNA 模板、各0.8 μL 的上下游引物以及4.8 μL 的RNase Free dH2O。反應(yīng)程序為：42℃5 min，95℃10 min，95℃5 s；60℃34 s（40 個循環(huán)）；95℃15 s，60℃1 min；95℃30 s，60℃15 s。以10 TCID50接種后1 d 收獲的細(xì)胞樣本作為陰性對照，采用2-ΔΔCT方法計算基因相對表達(dá)量[33]。β-actin 上游引物βactin F：GCCGGCCGC GACCTCACAGACTAC，下游引物β-actin R：CGGCCGTGGTGGTGA AGCTGTAAC；A 基因上游引物AF：GCATTCAACTACGGGAGAC，下游引物AR：CATCAGGCTGTTGTAGGTTAG；B 基因上游引物BF：CCGCAGCAC AGTTCCTAA，下游引物BR：GCTTGCCATCGTCTACCA。引物由吉林省庫美生物合成。

1.6 IPNV 在CHSE-214 細(xì)胞上的生長曲線繪制

在1.5 mL 無菌離心管中，用細(xì)胞維持液（MEM培養(yǎng)基+2%胎牛血清+1%雙抗）將1.4 中收獲的IPNV 病毒液分別進(jìn)行10 倍系列稀釋（10-1～10-8）。將稀釋好的病毒懸液分別接種于96 孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板上單層CHSE-214 細(xì)胞，每孔接種病毒懸液100 μL，每個濃度接種8 個孔，將只加細(xì)胞維持液的孔設(shè)成陰性對照孔，置于15℃二氧化碳生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，連續(xù)觀察7 d，記錄出現(xiàn)及未出現(xiàn)CPE 的孔數(shù)，利用Reed-Muench 法計算IPNV 的TCID50[34]。

2 結(jié)果與分析

2.1 敏感性分析

將24 株IPNV 分離株1 000 TCID50劑量接種于CHSE-214 細(xì)胞和RTG-2 細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變產(chǎn)生、變化情況及導(dǎo)致細(xì)胞病變的毒株數(shù)量。顯微鏡觀察結(jié)果顯示，接毒后1 d 時，CHSE-214 細(xì)胞和RTG-2 細(xì)胞均未出現(xiàn)任何變化；接毒后2 d 時，各CHSE-214 細(xì)胞組均出現(xiàn)變薄、變圓、崩解脫落等明顯的典型細(xì)胞病變，個別RTG-2 細(xì)胞組出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞病變；接毒后3 d 時，CHSE-214 細(xì)胞出現(xiàn)大面積脫落，RTG-2 細(xì)胞病變部位擴(kuò)大，出現(xiàn)了崩解脫落的現(xiàn)象（圖1）。接毒后7 d，CHSE-214 細(xì)胞產(chǎn)生了典型的細(xì)胞病變并幾乎完全崩解脫落，8 組RTG-2 細(xì)胞產(chǎn)生了典型的細(xì)胞病變及崩解脫落。這表明所有的IPNV 分離株均能在CHSE-214 上增殖，而僅有8 株IPNV 分離株可以在RTG-2 細(xì)胞上增殖，說明CHSE-214 細(xì)胞IPNV 敏感性更好，更適用于IPNV 的分離培養(yǎng)，推薦CHSE-214 細(xì)胞用于IPNV 的體外分離培養(yǎng)。

圖1 IPNV 在RTG-2 細(xì)胞和CHSE-214 細(xì)胞上產(chǎn)生的細(xì)胞病變Fig.1 Cytopathic effect of IPNV on RTG-2 and CHSE-214 cells

2.2 IPNV 不同接毒劑量下CHSE-214 細(xì)胞的病變

分別以10 TCID50和100 TCID50接毒劑量將IPNV 分離株ChRtm213 接種于CHSE-214 細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變產(chǎn)生及變化情況以及出現(xiàn)細(xì)胞病變的時間。結(jié)果顯示，在接毒后1 d，以兩種劑量接種IPNV 分離株的CHSE-214 細(xì)胞均未出現(xiàn)任何變化；接毒后2 d，兩個劑量組的CHSE-214 細(xì)胞均出現(xiàn)了細(xì)胞變圓、變薄、部分消融的典型細(xì)胞病變（圖2），其中，以100 TCID50劑量接種IPNV 的CHSE-214細(xì)胞病變更為明顯；接毒3 d，以10 TCID50接種的細(xì)胞全部出現(xiàn)典型細(xì)胞病變，開始出現(xiàn)部分崩解，以100 TCID50劑量接種的細(xì)胞也同樣開始出現(xiàn)崩解，但尚未嚴(yán)重脫落；接毒后4～5 d，所有劑量組細(xì)胞均幾乎全部崩解，嚴(yán)重脫落，僅能觀察到極少量的完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)（圖2）。

圖2 接種不同劑量IPNV 后CHSE-214 細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞病變Fig.2 Cytopathic effect of CHSE-214 cells inoculated with IPNV at different doses

2.3 IPNV 在CHSE-214 細(xì)胞上增殖的RTqPCR 分析

將IPNV 毒株分別以10 TCID50和100 TCID50接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上單層的CHSE-214 細(xì)胞，接毒后5 d 內(nèi)每天收獲病毒培養(yǎng)物，提取RNA，分別以IPNV A 鏈和IPNV B 鏈為靶標(biāo)基因，β-actin為內(nèi)參基因，利用RT-qPCR 方法檢測接毒后不同時間病毒在細(xì)胞中載量的變化，以10 TCID50劑量接種IPNV 病毒1 d 后收獲的病毒培養(yǎng)物提取的RNA 作為陰性對照。結(jié)果顯示，隨著時間的增加兩種劑量組的IPNV 載量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在接毒后3 d 時達(dá)最大值，顯著高于其余各時間點，不同靶基因檢測結(jié)果相一致（P＜0.05，圖3）。接種后3 d 時，10 TCID50劑量組的IPNV 病毒載量顯著高于100 TCID50劑量組（P＜0.05）（圖3）。上述結(jié)果表明，利用CHSE-214 細(xì)胞對IPNV 進(jìn)行增殖時病毒載量先升高再下降。

圖3 以不同劑量接種于CHSE-214 細(xì)胞的IPNV 載量變化Fig.3 Variation in viral load in CHSE-214 cells inoculated with different doses of IPNV

2.4 IPNV 生長曲線的繪制

將IPNV 毒株以10 TCID50、100 TCID50兩種不同劑量接種于單層CHSE-214 細(xì)胞，接種后5 d 內(nèi)，每天收獲病毒液，進(jìn)行TCID50測定，繪制生長曲線。兩個劑量組的IPNV 滴度均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在接毒后3 d 時達(dá)最大值：接種后第1～3 d 呈對數(shù)增長，第4～5 d 緩慢下降（圖4）。當(dāng)接種劑量為10 TCID50時，接毒后第3 d 時IPNV 滴度高達(dá)106.57TCID50/0.1 mL，而在接毒后第5 d 時IPNV 滴度降低至103.88TCID50/0.1 mL；除接種后1 d 外，10 TCID50劑量組IPNV 滴度在各時間點均顯著高于100 TCID50劑量組。接毒后第3 d 和5 d 時，100 TCID50劑量組IPNV 滴度分別為105.62TCID50/0.1 mL和103.43TCID50/0.1 mL，顯著低于10 TCID50劑量組（P＜0.05）。

圖4 IPNV 在CHSE-214 細(xì)胞上的滴度變化Fig.4 Changes in IPNV titers in CHSE-214 cells

3 討論

3.1 IPNV 毒株的選擇

水生雙RNA 病毒共包括7 個基因型（基因組I-基因組VII 型）[35]，包括Blake 等[8]基于VP2 序列建立的6 個基因型（基因組I 型-VI 型）和Nishizawa 等[24]基于VP2/NS 基因建立的1 個基因型。每種基因型的IPNV 毒株的地理分布不同，基因組I 型IPNV 毒株主要分布于美國[7]、智利[10]、墨西哥[11]、西班牙[14]、日本[15]和中國[18-20]，基因組II 型、III 型和IV 型IPNV 毒株主要分布于加拿大[31]、西班牙[14]和加拿大，基因組V 型IPNV 毒株分布于土耳其[9]、芬蘭[12]、挪威[13]、伊朗[17]和意大利[36]，基因組VI 型IPNV 毒株分布于德國以及芬蘭。根據(jù)GenBank 公布的中國IPNV 毒株VP2 基因序列，對本實驗室于2013—2020 年分離獲得的二十余株IPNV 毒株，Duan 等[23]進(jìn)行了基因型分析。結(jié)果顯示：我國IPNV基因型為I 型和V 型，I 型分布更廣。因此在本研究中選擇了I 型IPNV 來分析CHSE-214 和RTG-2的敏感性，將實驗室保存的我國不同養(yǎng)殖區(qū)域的全部I 型IPNV 作為實驗表株，以期為我國IPNV 病毒的檢測提供指導(dǎo)。

3.2 細(xì)胞敏感性分析

IPNV 可從許多感染的魚類中分離出，并在許多魚類細(xì)胞系中增殖。不同的細(xì)胞對IPNV 敏感性不同。IPNV 可在許多細(xì)胞系中增殖感染并產(chǎn)生典型的細(xì)胞病變狀態(tài)：CHSE-214、RTG-2、EPC、淡水鯉科魚類細(xì)胞系（fathead minnow muscle cell line，F(xiàn)HM）、銅吻鱗鰓太陽魚細(xì)胞系（Bluegill fry，BF-2）、虹鱒肝細(xì)胞系（Liver cells of rainbow trout，R1）、虹鱒魚細(xì)胞系（steelhead trout embryo-137，STE-137）、紅鮭胚胎細(xì)胞系（sockeye salmon embryo-5，SSE-5）、虹鱒肝臟瘤細(xì)胞系（rainbow trout hepatoma-149，RTH-149）、虹鱒脾臟細(xì)胞系（Rainbow trout spleen，RBS）、虹鱒魚苗細(xì)胞系（rainbow trout fry-1，RTF-1）以及大西洋鮭細(xì)胞系（Atlantic salmon，AS）等[37]。其中CHSE-214 細(xì)胞、RTG-2 細(xì)胞以及EPC 細(xì)胞均可用于IPNV 的檢測[19]，但劉淼等[31]發(fā)現(xiàn)，IPNV ChRtm213 分離株在EPC 細(xì)胞上的滴度最低，產(chǎn)生細(xì)胞病變最慢，而CHSE-214 和RTG-2 細(xì)胞比EPC 細(xì)胞的敏感性更好。IPNV 檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)《GB 15805.1-2008-T 魚類檢疫方法 第1 部分：傳染性胰臟壞死病毒（IPNV）》推薦使用RTG-2、CHSE-214 或者PG 細(xì)胞分離IPNV。我國大多數(shù)實驗室更傾向于利用鮭鱒魚來源的CHSE-214 和RTG-2 分離IPNV。本研究中選用了CHSE-214 和RTG-2 細(xì)胞分析IPNV 敏感性，以此來篩選出更適合IPNV 分離鑒定的細(xì)胞系。將IPNV 分離株全部以較大劑量接種于CHSE-214 和RTG-2 細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有的IPNV 分離株均能在CHSE-214 細(xì)胞上增殖并產(chǎn)生典型細(xì)胞病變，而僅有三分之一的IPNV 分離株能在RTG-2 細(xì)胞上增殖并產(chǎn)生細(xì)胞病變，證明CHSE-214 細(xì)胞比RTG-2 細(xì)胞對IPNV 敏感。Lorenzen 等[37]研究發(fā)現(xiàn)，不同實驗室的同一細(xì)胞系對同一病毒的敏感性存在一定的差異，但是該差異性并不會影響細(xì)胞對病毒敏感性的判斷。本研究證明CHSE-214 細(xì)胞更適合用于IPNV 的體外分離培養(yǎng)。

3.3 IPNV 在CHSE-214 細(xì)胞上的增殖特性

病毒體外增殖的主要決定因素包括細(xì)胞系、接種劑量、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度等。江育林等[19]將IPNV 毒株分別接種于鯽（Carassius auratus auratus）的囊胚細(xì)胞（Blaetoderm ofCarassius auraius，CAR）、鯉（Cyprinus carpio）的白細(xì)胞（Leucocytes of common carp，GLC）和草魚（Ctenopharyngodon idella）卵巢細(xì)胞（Overy cells of grass carp，CO），于20℃培養(yǎng)7 d，細(xì)胞未出現(xiàn)任何病變；而在CHSE-214、RTG-2、PG和R1 細(xì)胞上，3 d 內(nèi)皆出現(xiàn)CPE，7 d 內(nèi)CPE 達(dá)到90%以上，7 d 時測得滴度分別為105.8TCID50/0.1 mL、105.5TCID50/0.1 mL、106.5TCID50/0.1 mL 和106.2TCID50/0.1 mL。劉淼等[31]發(fā)現(xiàn)，將IPNV ChRtm213 毒株分別接種于CHSE-214、RTG-2、EPC 細(xì)胞上，在接毒后48 h時，CHSE-214 細(xì)胞出現(xiàn)皺縮變圓、崩解脫落等明顯的細(xì)胞病變，RTG-2 細(xì)胞只出現(xiàn)少數(shù)的病變灶，在接毒后72 h，CHSE-214 細(xì)胞大面積崩解脫落，RTG-2 細(xì)胞病變部位擴(kuò)大，部分細(xì)胞崩解脫落，而EPC 細(xì)胞生長正常。20℃下培育7 d 時ChRtm 213 在CHSE-214、RTG-2 和EPC 細(xì)胞上病毒滴度分別為105.2TCID50/0.1 mL、103.2TCID50/0.1 mL、102.3TCID50/0.1 mL。謝文萍等[38]將IPNV 接種于FHM 細(xì)胞上，18 h細(xì)胞病變，出現(xiàn)空洞，15℃培育7 d 所測得的病毒滴度分別為103.064TCID50/0.1 mL。上述各研究所采用的培養(yǎng)溫度均在15～20℃的最適范圍[19]，但所用毒株各不相同，接種劑量也不相同，因此無法精確衡量各培養(yǎng)條件對病毒滴度的影響。將IPNV 接種于CHSE-214 細(xì)胞上，第7 d 時收獲病毒，但本研究發(fā)現(xiàn)在CHSE-214 細(xì)胞上，IPNV 表現(xiàn)出獨特的增殖特性：接毒后第3 d 時IPNV 滴度高達(dá)106.57TCID50/0.1 mL，而第5 d 時IPNV 滴度降低至103.43TCID50/0.1 mL。由此可見，病毒載量和病毒滴度隨著接種時間的增加，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。這與段凱越等[39]研究結(jié)果相一致；且在接毒后3～5 d 時，低劑量組收獲的IPNV 的病毒量顯著高于高劑量組。由此可見，將IPNV 接種于單層CHSE-214 細(xì)胞后，病毒培養(yǎng)時間并非越長越好，接毒劑量也并非越大越好，應(yīng)在大部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變，但尚未完全崩解脫落時收獲病毒進(jìn)行檢測，不但可縮短檢測時間而且會提高檢出效率。IPNV 在CHSE-214 細(xì)胞中的增殖特性在先前的研究中并未被報道過。掌握該增殖特性，有利于IPNV 的檢測和在滅活疫苗的制備時降低接毒劑量，縮短培養(yǎng)時間降低成本，提高病毒產(chǎn)量。利用CHSE-214 培養(yǎng)IPNV，培養(yǎng)溫度18℃，病毒接種量為10 TCID50，培養(yǎng)時間3 d 時最為合適。