栗紅江， 胡素玲， 劉 洋， 孫靜瑋， 耿坤靜

保定市人民醫(yī)院1.消化三科；2.功能科；3.檢驗(yàn)科；4.健康管理中心，河北 保定 071000

慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B，CHB)是世界范圍內(nèi)的流行性傳染病，全球每年約有100萬(wàn)人死于CHB相關(guān)的肝衰竭或肝細(xì)胞癌[1]。CHB患者肝病變發(fā)展與抗病毒效果取決于免疫應(yīng)答的性質(zhì)、強(qiáng)度和范圍，有效的T細(xì)胞應(yīng)答是控制病毒感染的關(guān)鍵[2]。但目前，有關(guān)T淋巴細(xì)胞對(duì)乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)產(chǎn)生免疫耐受的機(jī)制尚不明確。維生素D參與細(xì)胞的增殖、分化，對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)有一定的調(diào)節(jié)作用，且CHB患者普遍存在維生素D缺乏或不足[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，慢性丙型病毒性肝炎患者采用聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒的治療效果會(huì)受到維生素D水平的影響，維生素D缺乏可能是造成抗病毒治療無(wú)應(yīng)答的原因之一[4]。維生素D對(duì)慢性丙型病毒性肝炎治療的效果影響也推動(dòng)了其在CHB中的研究，并發(fā)現(xiàn)維生素D對(duì)CHB的影響可能與維生素D的免疫調(diào)節(jié)功能有關(guān)，正常維生素D水平的CHB患者乙肝e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)轉(zhuǎn)陰率更高[5]。此外，循環(huán)血T淋巴細(xì)胞亞群與CHB患者細(xì)胞免疫狀態(tài)有明顯關(guān)聯(lián)，是影響機(jī)體對(duì)HBV清除能力與肝纖維化情況的重要因素，但有關(guān)CHB患者維生素D水平與肝纖維化、外周血T淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系研究少見(jiàn)報(bào)道。飲食來(lái)源和皮膚合成的維生素D前體在肝中于25羥化酶作用下進(jìn)行羥化反應(yīng)形成25羥維生素D3[25-dihydroxyvitam in D3，25(OH)D3]，是血液循環(huán)中維生素D的主要形式。本研究旨在探討CHB患者血清25(OH)D3水平與肝纖維化進(jìn)展及外周血T淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取自2018年5月至2020年4月保定市人民醫(yī)院收治的140例CHB患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[6]中CHB的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)無(wú)抗病毒藥物及免疫調(diào)節(jié)劑治療史；(3)無(wú)甲、丙等其他肝炎感染者；(4)無(wú)長(zhǎng)期飲酒史；(5)均行肝穿刺病理活檢；(6)患者簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)入組前半年內(nèi)服用過(guò)鈣劑、維生素D制劑、二磷酸鹽、降鈣素、雌激素、糖皮質(zhì)激素者；(2)伴心、腦、腎等器官功能不全者；(3)伴糖尿病、骨質(zhì)疏松等可能影響維生素D水平的疾病者；(4)伴酒精性或脂肪性肝病、遺傳代謝性肝病、藥物性肝病、自身免疫性肝病者；(5)伴膽汁淤積性疾病、肝血液循環(huán)障礙性疾病者。根據(jù)血清25(OH)D3水平將患者分為嚴(yán)重缺乏組[25(OH)D3<10 ng/ml，n=45]、不足組[25(OH)D3 10～30 ng/ml，n=55)和充足組[25(OH)D3>30 ng/ml，n=40]。嚴(yán)重缺乏組中，男性23例，女性22例；平均年齡(35.89±5.63)歲；HBV感染時(shí)間(9.54±3.16)年。不足組中，男性30例，女性25例；平均年齡(33.65±5.28)歲；HBV感染時(shí)間(10.29±3.33)年。充足組中，男性22例，女性18例；平均年齡(35.76±5.61)歲；HBV感染時(shí)間(10.62±3.52)年。各組患者一般資比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 于晨起空腹?fàn)顟B(tài)下采集5 ml外周靜脈血，3 500 r/min離心10 min，留取分離血清待測(cè)。采用貝克曼AU680全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、總膽紅素(total bilirubin，TB)，其中ALT、AST檢測(cè)試劑購(gòu)自新健康成生物股份有限公司；TB試劑購(gòu)自北京瑞正醫(yī)療科技有限公司。采用電化學(xué)發(fā)光法(羅氏ROCHE E601及配套試劑)檢測(cè)血清HBeAg，Cut off指數(shù)<1.0為陰性，否則為陽(yáng)性。采用上海宏石全自動(dòng)熒光定量PCR儀SLAN-96P檢測(cè)HBV-DNA，檢測(cè)試劑購(gòu)自圣湘生物。采用流式細(xì)胞術(shù)(邁瑞B(yǎng)riCyte E6流式細(xì)胞儀及配套試劑)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群。采用衍射光譜法(奧林巴斯AU680全自動(dòng)生化分析儀)測(cè)定25(OH)D3，檢測(cè)試劑購(gòu)自北京九強(qiáng)生物。所有檢測(cè)均嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.2 肝纖維化檢測(cè) 采用Fibroscan測(cè)定肝彈性測(cè)量值(liver stiffness measurement，LSM)，判定肝纖維化程度[7]：對(duì)于TB正常且轉(zhuǎn)氨酶異常者，LSM≥17.5 kPa為肝硬化，12.4～17.5 kPa為進(jìn)展性肝纖維化，9.4～12.4 kPa為顯著肝纖維化，7.4～9.4 kPa為輕度肝纖維化，LSM<7.4 kPa為無(wú)肝纖維化；對(duì)于轉(zhuǎn)氨酶及TB均正常者，LSM≥12.0 kPa為肝硬化，9.0～12.0 kPa為進(jìn)展性肝纖維化，6.0～9.0 kPa為輕度肝纖維化，LSM<6.0 kPa為無(wú)肝纖維化。

2 結(jié)果

2.1 各組患者血清學(xué)指標(biāo)比較 各組血清ALT、AST、TB及HBV-DNA比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。嚴(yán)重缺乏組HBeAg陽(yáng)性率明顯高于不足組和充足組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不足組與充足組HBeAg陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組患者血清學(xué)指標(biāo)比較

2.2 各組患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群比較 嚴(yán)重缺乏組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+T細(xì)胞低于不足組與充足組，且不足組低于充足組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；嚴(yán)重缺乏組CD8+T細(xì)胞高于不足組與充足組，且不足組高于充足組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組外周血T淋巴細(xì)胞亞群比較

2.3 各組患者肝纖維化程度比較 嚴(yán)重缺乏組與不足組的進(jìn)展性纖維化比例明顯高于充足組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組患者肝纖維化程度比較/例(百分率/%)

2.4 相關(guān)性分析 CHB患者血清25(OH)D3與LSM呈負(fù)相關(guān)(r=-0.257，P<0.05)，與CD4+/CD8+呈正相關(guān)(r=0.227，P<0.05)；LSM與CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān)(r=-0.194，P<0.05)。

3 討論

維生素D在細(xì)胞增生、分化、機(jī)體免疫功能、抗炎、抗纖維化等方面均有明顯作用，可對(duì)慢性肝病的進(jìn)展及治療效果產(chǎn)生明顯影響。有研究表明，維生素D受體可在人體肝、胰腺、消化道上皮細(xì)胞和單核細(xì)胞，以及巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞中表達(dá)[8]。維生素D受體被維生素D激活后會(huì)促進(jìn)上述免疫細(xì)胞中維生素D合成酶的生成，將血清中低活性的維生素D轉(zhuǎn)化為高活性的25(OH)D3，進(jìn)而通過(guò)自分泌或旁分泌等途徑調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能[9]。

本研究結(jié)果顯示，嚴(yán)重缺乏組的HBeAg陽(yáng)性率明顯高于不足組和充足組，提示較高水平的25(OH)D3有利于促進(jìn)CHB患者的HBeAg自發(fā)清除，與既往研究[10]結(jié)果一致。CHB屬于異質(zhì)性疾病，不同患者的病毒復(fù)制水平有所不同，肝組織炎癥輕重也各異，兩者的平衡制約著感染的轉(zhuǎn)歸，反映機(jī)體的免疫狀態(tài)，而免疫功能和病毒復(fù)制也決定了肝病變程度，較弱的免疫功能與較高水平的病毒復(fù)制能力會(huì)促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展[11]。有效的T細(xì)胞應(yīng)答對(duì)控制CHB患者的病毒感染與復(fù)制起關(guān)鍵作用，成為CHB的研究熱點(diǎn)。T淋巴細(xì)胞亞群可分為效應(yīng)性T細(xì)胞或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，T細(xì)胞總數(shù)或不同T細(xì)胞亞群絕對(duì)數(shù)及比值的變化常與疾病的發(fā)生及機(jī)體免疫功能強(qiáng)弱有關(guān)[12]。本研究中，嚴(yán)重缺乏組的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+T細(xì)胞低于不足組與充足組，且不足組低于充足組(P<0.05)；嚴(yán)重缺乏組CD8+T細(xì)胞高于不足組與充足組，且不足組高于充足組(P<0.05)，且血清25(OH)D3與CD4+/CD8+呈顯著正相關(guān)，提示較低水平25(OH)D3的患者免疫功能也越差。有研究表明，初始T淋巴細(xì)胞的活化依賴(lài)維生素D水平，T淋巴細(xì)胞受到HBV刺激后表達(dá)的維生素D受體需在維生素D作用下形成復(fù)合體，從而激活T淋巴細(xì)胞，較低水平的25(OH)D3在激活T淋巴細(xì)胞后的增生指數(shù)較低，難以完全滿(mǎn)足對(duì)HBV的殺滅作用，因此，CHB患者的25(OH)D3水平與CD4+/CD8+T細(xì)胞呈現(xiàn)出正相關(guān)性[13-14]。也有研究發(fā)現(xiàn)，維生素D還可抑制Th1型淋巴細(xì)胞的增生并抑制相關(guān)細(xì)胞因子分泌，使免疫應(yīng)答向Th2型轉(zhuǎn)變，以此減輕Th1型細(xì)胞應(yīng)答產(chǎn)生的組織損傷[15]。

HBV感染后啟動(dòng)機(jī)體免疫反應(yīng)，使CD8+T細(xì)胞與靶細(xì)胞接觸，誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞，但與此同時(shí)也在HBV致敏后釋放顆粒酶和穿孔素，清除肝細(xì)胞內(nèi)HBV的同時(shí)也會(huì)對(duì)肝細(xì)胞造成損傷，誘發(fā)肝組織炎癥，激活肝星狀細(xì)胞，促進(jìn)膠原纖維合成與沉積，進(jìn)而導(dǎo)致肝組織纖維化甚至進(jìn)展為肝硬化[16-17]。隨著CD8+T細(xì)胞的消耗，為了維持免疫平衡的穩(wěn)態(tài)，機(jī)體CD8+T細(xì)胞的分泌速度也會(huì)加快，造成CD8+T細(xì)胞的上調(diào)，CD4+/CD8+減小。因此，CD4+/CD8+越小，機(jī)體免疫耐受越嚴(yán)重，肝纖維化也越重，使LSM與CD4+/CD8+呈顯著負(fù)相關(guān)。有研究認(rèn)為，CHB患者因HBV感染，長(zhǎng)期處于免疫耐受狀態(tài)，使機(jī)體免疫細(xì)胞數(shù)量及功能失衡，最終誘發(fā)肝組織持續(xù)炎癥與肝纖維化[18]。本研究結(jié)果顯示，嚴(yán)重缺乏組與不足組進(jìn)展性纖維化患者的占比明顯高于充足組，且血清25(OH)D3水平與LSM呈負(fù)相關(guān)，提示較低水平的血清25(OH)D3更易造成肝纖維化的出現(xiàn)與進(jìn)展。以上結(jié)果說(shuō)明，CHB患者的血清25(OH)D3水平與機(jī)體T淋巴細(xì)胞之間存在一定的相關(guān)性，通過(guò)該途徑影響肝組織纖維化的進(jìn)展，外源性補(bǔ)充維生素D有利于HBeAg的自發(fā)清除及強(qiáng)化免疫應(yīng)答，從而減輕肝組織損傷并抑制肝纖維化進(jìn)展。國(guó)外研究也表明，低水平25(OH)D3是重度肝纖維化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，外源性補(bǔ)充維生素D可調(diào)節(jié)鈣磷代謝并抑制肝纖維化[19-20]，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，CHB患者維生素D水平可能影響T淋巴細(xì)胞亞群，并通過(guò)該途徑調(diào)控肝組織纖維化進(jìn)展，未來(lái)需要更多的體內(nèi)或體外研究來(lái)探討具體機(jī)制。本研究不足之處：肝纖維化診斷分級(jí)依據(jù)較為單一，且Fibroscan易受檢查者經(jīng)驗(yàn)、肝炎癥程度等因素影響，應(yīng)進(jìn)一步通過(guò)肝活檢、血清學(xué)等聯(lián)合檢查提高肝纖維化的診斷準(zhǔn)確性。此外，羥化酶CYP2R1、CYP27A1和CYP24A1等也會(huì)影響25(OH)D3代謝，但本研究未能進(jìn)行分析，可能造成一定的偏倚，有待后續(xù)完善研究。