陳 鈺，劉 梅，郭 靖，戎振英，竺柏康，陳慶國

（1.浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)石油化工與環(huán)境學(xué)院，浙江舟山 316022；3.舟山市污水處理有限公司，浙江舟山 316000）

隨著石油生產(chǎn)、運輸和使用的日益廣泛，溢油污染已經(jīng)成為一個重大環(huán)境問題，且對生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重損害。溢油污染發(fā)生后，溢油在海面形成油膜阻礙海水和外部環(huán)境的物質(zhì)交換，嚴(yán)重破壞生態(tài)環(huán)境[1-2]。在石油污染的處理眾多處理方法中，與化學(xué)、物理方法相比，生物修復(fù)是徹底消除油污染的最重要途徑。生物修復(fù)最常用的是微生物，但游離微生物在實際使用時會被海水沖刷稀釋導(dǎo)致有效菌濃過低，且因苛刻多變的海洋環(huán)境影響而活性較低，極大的影響處理效果，而微生物的固定化可解決此難題。貽貝殼作為一種養(yǎng)殖廢棄物，產(chǎn)量巨大，現(xiàn)已被作為固定劑廣泛用于環(huán)境污染修復(fù)中[3-5]。已有研究表明，固定化微生物對pH 的耐受力高于游離態(tài)，且在更大溫度范圍內(nèi)有良好的活性及更好的耐受性[1,6]，因此可將貽貝殼作為固定化載體吸附固定微生物應(yīng)用于海洋溢油的降解處理中。

由于貽貝殼內(nèi)表面光滑，吸附性能有待于提高，為進一步提高貽貝殼吸附固定微生物效率，需對其表面進行改性處理。而檸檬酸作為一種活化試劑，常用于生物炭的活化處理[7-8]。因此，本文借鑒生物炭的活化方法，以檸檬酸作為貽貝殼的改性劑并對其進行高溫改性，探究貽貝殼在不同改性條件下作為固定化材料對石油烴降解菌的吸附固定效果，獲得貽貝殼改性最優(yōu)條件，同時在優(yōu)化改性貽貝殼吸附固定石油烴降解菌條件基礎(chǔ)上考察固定化微生物對原油的降解作用，評價不同環(huán)境對固定化微生物的降解效果，為改性貽貝殼固定化微生物在海洋溢油修復(fù)中的應(yīng)用提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用菌種為實驗室保存的海洋石油烴降解菌Alcanivorax sp.ASW-2。實驗所用貽貝殼采自舟山嵊泗貽貝養(yǎng)殖區(qū)，使用前經(jīng)過清洗后破碎處理。所用試劑均為分析純。實驗所用原油來自中化興中石油轉(zhuǎn)運（舟山）有限公司[9]。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：蛋白胨10 g,牛肉膏3 g，NaCl 10 g，去離子水1 000 mL。

原油培養(yǎng)基：人工海水按照文獻[10]配方進行配置，原油添加量為0.1～5 g·L-1。

所有培養(yǎng)基均在高壓蒸汽121 ℃滅菌20 min 后使用，接種后的培養(yǎng)基均在錐形瓶中，置于搖床中120 r·min-1恒溫培養(yǎng)。

1.3 實驗方法

1.3.1 貽貝殼改性條件設(shè)定

對破碎的貽貝殼在檸檬酸中浸泡活化，活化一段時間后，經(jīng)蒸餾水清洗再烘干，然后將活化后貽貝殼置于充氮保護的管式馬弗爐中進行高溫改性。采用單因素單水平試驗進行貽貝殼的改性條件優(yōu)化。選擇檸檬酸濃度梯度為0.2%～3.5%，檸檬酸活化時間設(shè)為0.25～2 h，設(shè)定不同改性溫度（100～1 000 ℃）與改性時間（0.5～2.5 h）[7]，通過不同貽貝殼樣品對菌懸濁液的吸附前后吸光度改變量為評價指標(biāo)進行優(yōu)化。具體步驟如下：將石油烴降解菌ASW-2 在肉湯培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)3 d 后離心去除培養(yǎng)基，制成OD660為0.8 的菌懸液。將制備的改性貽貝殼樣品置于50 mL 菌懸濁液，搖床振蕩吸附12 h 后，靜置1 h 后取上層清液測定吸光度。

將不同改性后的貽貝殼樣品進行掃描電鏡（德國蔡司EVO 18 掃描電鏡）與紅外光譜分析（美國熱電，Nicolet6700 紅外光譜儀），探究改性前后貽貝殼的結(jié)構(gòu)與性能變化，確定最佳改性條件。

1.3.2 改性貽貝殼固定化微生物性能評價

將一定量改性貽貝殼置于OD660為0.8 的菌懸濁液中，振蕩吸附一定時間后，過濾分離，使用無菌人工海水沖洗2 次，即得固定化微生物。利用單因素優(yōu)化法，設(shè)定改性貽貝殼不同投加量（0.2～2.5 g）和吸附時間（2～30 h），通過改性貽貝殼投加前后菌懸濁液的吸光度變化確定最優(yōu)的改性貽貝殼載體用量和微生物吸附固定時間[11]。

1.3.3 固定化微生物降解石油的影響因素實驗

將固定化微生物在優(yōu)化改性條件的基礎(chǔ)上，采用單因素法優(yōu)化固定化微生物在不同鹽度（0～40）、降解時間（1～13 d）、pH（6～9）、溫度（5～35 ℃）、原油濃度（0.1～5 g·L-1）條件下的降解效率，同時進行游離微生物降解實驗做對比。為考察貽貝殼對原油的吸附能力，在不同改性貽貝殼用量（0.5～2.5 g）及不同原油濃度（0.1～5 g·L-1）下測定改性貽貝殼對原油的吸附率。原油濃度測定采用紫外分光光度法，波長為225 nm，所用萃取劑為60～90 ℃的脫芳石油醚[12]。

單看國內(nèi)市場，其實不難發(fā)現(xiàn)在長達幾個月的時間內(nèi)，國內(nèi)方面所能提供的上漲動力一直都不夠強硬，更多的是為高價尿素提供支撐作用。

1.3.4 固定化微生物對石油中主要飽和烴和芳烴組分的效果評價

為考察固定化微生物對石油中主要的飽和烴和芳烴的利用情況，并與游離微生物作對比，分別對固定化微生物和游離微生物降解不同原油（0.1～5 g·L-1）前后的原油樣品參考文獻[13]方法對原油中主要的烷烴和芳烴組分進行分離。采用氧化鋁層析柱進行分離，分別利用正己烷、正己烷和二氯甲烷混合液（體積比為1:3）對飽和烴洗和芳烴分別進行洗脫，分離得到的樣品揮發(fā)溶劑至恒重后進行稱量。對主要的飽和烴和芳烴的利用作為參照。

所有實驗均設(shè)3 次平行實驗，實驗數(shù)據(jù)結(jié)果為平均值，每組均設(shè)空白對照組。

2 結(jié)果與討論

2.1 改性貽貝殼制備條件優(yōu)化

2.1.1 檸檬酸濃度與活化時間對固定化載體吸附效果的影響

考察了檸檬酸濃度、浸泡時間對固定化載體吸附率的影響，結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可以看出，檸檬酸對貽貝殼的改性效果隨著檸檬酸濃度的上升而增強，在3%時吸附效果最好，濃度高于3%有下降趨勢。原因可能是隨著檸檬酸濃度增加酸性增強，該有機酸與貽貝殼表面的碳酸鈣反應(yīng)形成新的微孔使其吸附性能上升。且檸檬酸改性后貽貝殼表面的含氧官能團種類和數(shù)目增加，會提高其對石油的吸附能力[7]，但檸檬酸濃度過高強酸可能會破壞骨架結(jié)構(gòu)導(dǎo)致吸附效率下降。GUO Junyuan,et al[14]利用過硫酸鹽活化生物炭去除苯并（a）芘的研究結(jié)果與本文類似。

圖1 檸檬酸濃度、浸泡時間對固定化載體吸附效率的影響Fig.1 Effect of citric acid concentration and soaking time on adsorption efficiency of immobilized carrier

隨著檸檬酸浸泡時間的增加（＜1 h），改性貽貝殼表面孔隙率增大，其對微生物的吸附率也增大，但隨著浸泡時間延長（＞1 h），貽貝殼表面孔隙率持續(xù)增大，破壞了貝殼本身的碳骨架結(jié)構(gòu)，反而不利于貽貝殼的吸附，使其吸附性能下降。

2.1.2 碳化溫度與碳化時間對固定化載體吸附效果的影響

如圖2 所示，隨著碳化溫度的升高，改性貽貝殼的吸附效率出現(xiàn)多次的波動變化，這應(yīng)該是與貽貝殼升溫過程的結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。但在較低的碳化溫度（300 ℃）時，改性貽貝殼對微生物的吸附效果即達到最佳，因此選擇300 ℃為改性貽貝殼的碳化溫度。貽貝殼隨碳化時間延長吸附效率先上升后下降，碳化時間為30 min 時，改性貽貝殼對微生物的吸附效果最好，原因可能是貽貝殼隨著碳化時間增加，平均孔徑和氣孔率降低，從而降低了貽貝殼的吸附能力[15]。

圖2 碳化溫度和碳化時間對固定化載體吸附效率的影響Fig.2 Effect of carbonization temperature and carbonization time on adsorption efficiency of immobilized carrier

如圖3 所示，100～300 ℃溫度升高，貽貝外殼結(jié)構(gòu)逐漸松散，呈現(xiàn)明顯的層狀文石結(jié)構(gòu)，比表面積顯著增加，孔隙率增大，可為微生物的代謝生長提供足夠的空間[16]，使得改性貽貝外殼的吸附性能不斷提升。當(dāng)溫度在500～1 000 ℃之間時，貽貝殼中的有機質(zhì)成分被大量消耗，高溫使貽貝的鈣質(zhì)外殼由文石結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為光滑致密的碳酸鈣結(jié)構(gòu)，使得改性貽貝殼的吸附性能急劇下降，這與其吸附性能的變化相吻合。

圖4 為檸檬酸活化后改性貽貝殼樣品與未改性、直接高溫改性的貽貝殼對照樣品紅外光譜圖。在1 458 cm-1左右的強峰是C-N、C=O 的伸縮振動峰，該吸收峰變得更寬意味著貽貝殼內(nèi)蛋白質(zhì)等有機成分的不斷分解使成分越來越復(fù)雜。2 978 cm-1、2 870 cm-1分別為不飽和鍵上C-H 不對稱伸縮振動和對稱伸縮振動峰，879 cm-1、710 cm-1左右出現(xiàn)的較強吸收峰為不飽和鍵上的C-H 面外彎曲振動峰，在檸檬酸活化后改性貽貝殼樣品中都比改性、直接高溫改性的貽貝殼樣品中的吸收峰增強，說明在檸檬酸活化后改性貽貝殼樣品中不飽和鍵顯著增多，活性官能團增多。2 515 cm-1、879 cm-1分別為文石CO32-的C-O 鍵的不對稱伸縮振動峰和面外彎曲振動吸收峰，都有顯著增大，說明檸檬酸活化后改性貽貝殼樣品中文石成分要多于未改性、直接高溫改性的貽貝殼樣品，即文石的含量增大可使其吸附性能增強[16]。

2.2 固定化載體對微生物和原油的吸附研究

2.2.1 固定化載體質(zhì)量和固定化時間對改性貽貝殼吸附固定化微生物的影響

固定化載體改性貽貝殼的添加量和吸附固定化時間對改性貽貝殼吸附固定微生物的影響如圖5 所示。隨著載體質(zhì)量的增加，改性貽貝殼對降解菌ASW-2 吸附率也隨之增加。但0.5～2.5g·L-1投加量，微生物吸附率從52.82%至56.27%緩慢遞增，考慮到成本，選擇0.5 g·L-1的固定化載體投加量。隨著吸附時間延長（2～30 h），改性貽貝殼對降解菌ASW-2 吸附率先快速上升，到12 h 后趨于穩(wěn)定，因此確定12 h 為載體吸附固定化微生物的最佳吸附時間，本實驗結(jié)果與張秀霞等人[17]的研究結(jié)果一致。

圖5 固定化載體質(zhì)量與吸附時間對降解菌吸附固定化效果的影響Fig.5 Effect of carrier mass and adsorption time on adsorption and immobilization of degrading bacteria

2.2.2 固定化載體添加量與原油含量對固定化載體原油吸附率的影響

固定化載體添加量和原油含量對固定化載體原油吸附率的影響如圖6 所示。固定化載體對油吸附的貢獻較小[18]，隨著載體用量的增加，雖然原油的吸附量也在增加，2.5 g·L-1載體吸附量也僅為7.36%。隨著原油含量的增加，固定化載體對原油吸附率先增加再趨于平緩，后繼續(xù)增加，總體呈上升趨勢，5 g·L-1原油吸附率也只有7.06%。在現(xiàn)有的實驗條件中，固定化載體對原油的吸附率均不高于8%。

圖6 固定化載體添加量與原油含量對固定化材料吸附原油效率的影響Fig.6 Effects of the amount of immobilized carrier and crude oil content on the adsorption efficiency of crude oil by immobilized materials

2.3 固定化微生物降解溢油的影響因素優(yōu)化

2.3.1 降解時間和原油濃度對固定化微生物除油效果的影響

降解時間和原油濃度對游離微生物與固定化微生物降解影響如圖7 所示。當(dāng)原油濃度為在1 g·L-1時，經(jīng)過7 d 的生物降解之后，其降解率進入穩(wěn)定階段。已有研究表明，利用生物炭固定化微生物去除柴油是也在7 d 的效率達到高值[19]。因此本文選擇7 d 作為最佳的降解時間。固定化和游離微生物對原油的降解率隨原油濃度的升高而顯著降低。原因可能是原油初始濃度低時，培養(yǎng)基表面原油覆蓋率較少，降解菌可與氧氣充分接觸使原油降解效果較好[20]。且原油濃度增大會使表面原油覆蓋面積增大，影響氧氣的傳遞，使固定化微生物因缺氧而無法生長繁殖[21]。而原油濃度為1 g·L-1時，貽貝殼固定化對微生物的利用原油效率提升作用最為顯著，降解率提升可達24.61%，因此選擇1g·L-1原油濃度作為后續(xù)實驗條件。

圖7 原油濃度和降解時間對固定化和游離微生物降解原油的影響Fig.7 Effect of crude oil concentration and degradation time on degradation of crude oil by free and immobilized microorganisms

2.3.2 環(huán)境條件對固定化微生物降解原油效果的影響

環(huán)境溫度、pH、鹽度對固定化微生物降解影響如圖8 所示。隨鹽度增加，原油降解率呈先上升后降低的趨勢，在鹽度為30 時，固定化與游離微生物降解率均達到最大值，這與該菌初始生長環(huán)境有關(guān)，該菌篩選自鹽度約為30 的海域。適宜的鹽度促進了嗜鹽微生物的生長，使固定化載體中微生物濃度增加從而提高了有機物的降解率[22]。固定化微生物和游離微生物在pH 為8 時降解率達到最大值。已有文獻報道生物炭固定化微生物對石油烴的降解研究[23-24]也表明石油烴降解微生物適宜pH 范圍為中性和弱堿性環(huán)境。固定化微生物和游離微生物均于25 ℃時具有最高的油降解水平，分別為81.03%、60.47%。溫度過高會加速微生物體內(nèi)酶蛋白的變性，使酶失活；溫度過低也會限制微生物的酶活性[25-26]。固定化微生物降解溢油時，改性貽貝殼對原油吸附率小于8%，主要是生物降解貢獻，固定化載體的添加顯著促進了生物降解，相對于游離微生物，其降解效率提高5.17%～28.66%。

圖8 環(huán)境因素（鹽度、溫度、pH）對固定化和游離微生物降解原油的影響Fig.8 Effect of environmental factors（salinity,temperature,pH）on crude oil degradation by immobilized and free microorganisms

2.4 固定化與游離微生物對原油中主要組分的去除對比

游離微生物與固定化微生物對不同濃度原油樣品（0.1～5 g·L-1）中飽和烴和芳烴組分去除效果如圖9 所示。降解菌AS-2 對飽和烷烴和芳烴均有一定降解去除效果，但隨著原油濃度升高而顯著下降，這與圖7 中的趨勢相同。降解菌AS-2 對飽和烴的降解作用顯著高于芳烴，而改性貽貝殼固定化微生物對飽和烴和芳烴的降解作用均高于游離微生物。已有研究表明，經(jīng)固定化處理過的微生物對原油中的正構(gòu)烷烴與多環(huán)芳烴降解力高于游離的微生物[27]。而改性貽貝殼固定化微生物也顯著提高了細菌對飽和烷烴和芳烴的去除率。改性貽貝殼固定化微生物對飽和烴去除率最高可提高21.61%，對芳烴去除率最高可提升11.92%。改性貽貝殼固定化材料對飽和烴的生物降解提升效果高于芳烴，這可能與芳烴相對于飽和烴毒性更大，更難被微生物利用有關(guān)。

圖9 固定化微生物與游離微生物對原油中主要組分的去除效率對比Fig.9 Comparison of removal efficiency of main components in crude oil by immobilized microorganisms and free microorganisms

3 結(jié)論

本論文研究了改性貽貝殼固定化微生物對海洋溢油的降解，進行了改性貽貝殼的制備、吸附固定化微生物與微生物降解溢油條件的優(yōu)化，并考察了改性貽貝殼固定化微生物對原油各組分的降解特性。主要得出以下結(jié)論：

（1）3%的檸檬酸活化1 h 的貽貝殼具有較強的吸附效果，在300 ℃下改性30 min 吸附效果最好，有較多的孔隙和對微生物較高的吸附能力。改性貽貝殼對微生物最優(yōu)吸附時間為12 h，其對微生物的吸附率可達44.25%；固定化載體質(zhì)量變化對吸附率的影響不顯著，選取載體質(zhì)量為0.5 g·L-1時，其固定化載體對微生物吸附率可達53.54%。

（2）降解時間為7 d 時得出最適原油濃度為1 g·L-1，固定化微生物降解溢油的最適環(huán)境條件鹽度為30、pH 為8、溫度為25 ℃。

（3）固定化微生物也顯著提高了細菌對飽和烴和芳烴的去除，相對于游離微生物，其對石油降解效率提高5.17%～28.66%，固定化微生物比游離微生物表現(xiàn)出更好的環(huán)境耐受性。