魏文鳳，朱宗雨，裴婉琦，陳 香，劉自平

(安徽新華學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 合肥 230088)

近年來(lái)，隨著中草藥的廣泛運(yùn)用于臨床，報(bào)道的因中草藥引發(fā)的各種各樣的的不良反應(yīng)也越來(lái)越多。決明子因被列為109種藥食同源中藥材之一而作為原料用于保健品長(zhǎng)期服用，隨之關(guān)于決明子保健品的負(fù)面影響的報(bào)道也日漸增多[1]。通過(guò)篩查，決明子中存在潛在風(fēng)險(xiǎn)的化學(xué)成分主要為蒽醌類[2]、植物甾醇和生物堿，而關(guān)于多糖的不良反應(yīng)未見(jiàn)報(bào)道。

決明子又叫草決名，還瞳果，是一種豆科植物決明Cassia obtusifoliaL或小決明Cassia tora L的干燥種子[3]，決明子中含有多糖類、蒽醌類、萘駢吡喃酮類等成分。多糖既能抗氧化，調(diào)控免疫功能，降低血壓血脂、改善胃腸道功能、保護(hù)肝臟和眼睛，同時(shí)對(duì)視神經(jīng)也有一定的保護(hù)作用[4,5]，本課題擬通過(guò)乳酸菌[6]發(fā)酵法提高決明子中多糖含量。

1 儀器與試劑

SF-130C-萬(wàn)能粉粹機(jī)，山東精誠(chéng)制造有限公司；SGSP-電熱恒溫隔水式培養(yǎng)箱，上海天美儀器有限公司；RE-3000立式壓力蒸汽滅菌鍋，濟(jì)南生物技術(shù)有限公司；DZ30-32C6臺(tái)式離心機(jī)，長(zhǎng)沙離心機(jī)有限公司；UV1000紫外分光光度計(jì)，上海天美儀器公司；決明子，亳州市勝利飲片銷售有限公司；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 決明子多糖的含量方法

2.1.1 供試品溶液的制備

稱取10 g決明子粉末用石油醚脫脂，將揮干了石油醚的決明子粗粉與蒸餾水按體積比1:10混合，70 ℃下回流提取 30 min，無(wú)水乙醇常溫靜置24 h后，用離心機(jī)除去濾液，取沉淀，干燥除雜得到?jīng)Q明子多糖。稱取決明子多糖10 mg在 100 mL容量瓶中定容至刻度線，得到濃度為0.1 mg/mL的溶液，即為供試品溶液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取100 mg的葡萄糖，定容于1000 mL容量瓶中，得到濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.3 最大吸收波長(zhǎng)的選擇

量取1 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL試管中，加入15%的苯酚溶液1 mL，緩慢加入5 mL濃硫酸溶液混合后將其加熱20 min，取出放置于溫室下20 min放涼，加蒸餾水到 10 mL，以相同的方式對(duì)蒸餾水處理，記為空白對(duì)照組，按紫外分光光度法在450～550 nm波長(zhǎng)區(qū)域內(nèi)確定最大吸光度值，得出最大吸收波長(zhǎng)為490 nm。

2.1.4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

依次量取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL葡萄糖溶液,加蒸餾水至1 mL，向試管中各中加入15%的苯酚溶液1 mL，充分混合，緩慢滴入5 mL的濃硫酸，充分反應(yīng)后加熱20 min后，取出放置室溫環(huán)境冷卻20 min，以蒸餾水為空白對(duì)照組，測(cè)定吸光度值，回歸方程為y=5.0685x-0.0052(R2=0.9996)。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.5 決明子多糖含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[7]來(lái)測(cè)定多糖含量，量取1 mL供試品于試管中，加入15%的苯酚溶液1 mL混均，加入5.0 mL濃硫酸搖勻，加熱20 min，然后冷卻至室溫測(cè)定吸光度。根據(jù)回歸方程得到?jīng)Q明子多糖的濃度。計(jì)算決明子多糖含量從而計(jì)算多糖得率。公式如下：

決明子多糖得率=c×v×n/(1000m)×100%

式中：c為決明子多糖質(zhì)量濃度(mg/mL)；v為提取液的總體積(mL)；n為稀釋的倍數(shù)；m為決明子的質(zhì)量(g)。

對(duì)供試品進(jìn)行含量測(cè)定，得：

決明子多糖得率=c×v×n/(1000m)×100%=8.50%

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.2.1 菌種活化

將奶粉兌水配制后，將乳酸菌加入其中，放置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃連續(xù)傳代，在恒溫培養(yǎng)箱中放置48 h。

2.2.2 培養(yǎng)基制備

將決明子進(jìn)行除雜，粉粹，過(guò)400目篩備用。稱取10 g決明子粉末與蒸餾水按體積比1:10混合，添加適量玉米粉做為氮源(15 g/L)，滅菌后分別調(diào)節(jié)pH為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0。

2.3.3 接種

在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌吸量管吸取2 mL活化后的乳酸菌加入到三角瓶中。

2.3.4 發(fā)酵

2.3.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

(1)培養(yǎng)溫度對(duì)決明子多糖得率的影響

選取pH為7.0的培養(yǎng)基接種乳酸菌后分別在35 ℃， 36 ℃，37 ℃，38 ℃，39 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵48 h。發(fā)酵結(jié)束后取發(fā)酵液進(jìn)行多糖提純除雜，計(jì)算多糖得率。

由圖2可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度38 ℃時(shí)，決明子多糖得率逐漸上升達(dá)到峰值，然后決明子多糖提取率隨著發(fā)酵溫度的上升而下降。分析原因可能是溫度升高，酶出現(xiàn)失活現(xiàn)象，導(dǎo)致多糖合成下降，故選擇最適溫度為38 ℃。

圖2 溫度對(duì)多糖發(fā)酵的影響

(2)發(fā)酵時(shí)間對(duì)決明子多糖得率的影響

選取pH為7.0的培養(yǎng)基接種乳酸菌在發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)，發(fā)酵時(shí)間依次選擇24 h、36 h、48 h、56 h、72 h。發(fā)酵結(jié)束后取發(fā)酵液進(jìn)行多糖提純除雜，計(jì)算多糖得率。

由圖3可知，發(fā)酵時(shí)間在48 h之前決明子多糖的得率呈上升趨勢(shì)，時(shí)間為48 h時(shí)達(dá)到頂峰，48 h后決明子多糖得率隨著溫度的升高而下降，可能是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，一方面代謝產(chǎn)物得積累，不利于多糖的合成，另一方面原料的消耗，促使乳酸菌以多糖為碳源，導(dǎo)致多糖含量下降，故培養(yǎng)時(shí)間為48 h時(shí)為最適時(shí)間。

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)多糖發(fā)酵的影響

(3)pH對(duì)決明子多糖發(fā)酵的影響

選取pH為5.0、6.0、7.0，8.0，9.0的培養(yǎng)基接種乳酸菌后在38 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵48 h。發(fā)酵結(jié)束后取發(fā)酵液進(jìn)行多糖提純除雜，計(jì)算多糖得率。

由圖4所示在pH為8.0之前決明子多糖得率呈上升趨勢(shì)，在pH為8.0時(shí)達(dá)到頂峰，然后決明子多糖得率隨著pH值得上升呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，分析原因可能是在pH為8.0時(shí)酶活性最大，故取pH為8.0為最適pH。

圖4 pH對(duì)多糖發(fā)酵的影響

2.3.4.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，考慮單因素之間的交叉作用，設(shè)計(jì)考察培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)pH對(duì)多糖發(fā)酵的交互影響，選用L9(34)實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，正交試驗(yàn)各因素水平參考表1，正交試驗(yàn)結(jié)果分析參考表2，方差分析結(jié)果參考表3。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)

表3 方差分析

F0.05(2,2)=19.0

由表1～表3可以看出，對(duì)決明子多糖發(fā)酵的影響因素大小以培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)時(shí)間>培養(yǎng)pH，決明子多糖提取最佳工藝條件組合A2B1C2，即培養(yǎng)pH為8.0，培養(yǎng)時(shí)間48 h，培養(yǎng)溫度37 ℃的條件下決明子多糖經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后多糖得率最高。

3 結(jié) 論

將決明子作為碳源、玉米為氮源利用乳酸菌進(jìn)行多糖發(fā)酵，考察培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)pH對(duì)多糖得率的影響。結(jié)果當(dāng)培養(yǎng)溫度為37 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為48 h，培養(yǎng)為pH 7.0時(shí)為多糖發(fā)酵最佳工藝，其多糖得率為11.85%，與決明子水提法相比多糖得率提高了39.4%。

本實(shí)驗(yàn)工藝簡(jiǎn)單，多糖得率高，可為開(kāi)發(fā)利用決明子多糖進(jìn)行食品、保健品、換妝品等產(chǎn)品的研發(fā)提供一定的理論依據(jù)和參考。