周 程，汪光亮，潘光玉，廖洪濤，袁樹民，譚 寧

(桂林醫(yī)學(xué)院 1.研究生院、2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織與胚胎學(xué)教研室、3.生物技術(shù)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程教研室、4.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室、5.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室,廣西 桂林 541000)

肝癌是世界上第六大癌癥，據(jù)統(tǒng)計，2020年新發(fā)病例約90萬例，死亡約83萬例[1]。目前，手術(shù)切除治療是肝癌的首選治療方式，但其復(fù)發(fā)率高。肝癌的新型治療模式免疫療法也仍處于起始階段，總體療效并不理想，并且存在諸多問題。為此，探索新的治療方案和治療藥物成為肝癌治療的關(guān)鍵。

大量研究表明，自噬在肝臟生理和穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中起著重要作用，自噬受損導(dǎo)致包括肝癌在內(nèi)的各種肝臟疾病發(fā)生[2]。自噬對腫瘤發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要，在某些情況下，自噬具有癌細(xì)胞保護作用，導(dǎo)致癌細(xì)胞化療耐藥；在另一些情況下，自噬又具有細(xì)胞毒性作用，利用化合物誘導(dǎo)自噬可以介導(dǎo)癌細(xì)胞死亡[3]。盡管自噬對腫瘤的作用具有雙重性，但是靶向腫瘤細(xì)胞自噬逐漸成為腫瘤治療的熱點。Fan等[4]發(fā)現(xiàn)，檸檬酸鹽通過下調(diào)CaMKII/AKT/mTOR途徑激活前列腺癌細(xì)胞的自噬性死亡。另外，在最近研究中新發(fā)現(xiàn)的自噬抑制劑和激活劑3-Methyladenine(3-MA)、SAR405、miconazole(MCZ)、CRO15等正在進行臨床前研究，具有重要臨床應(yīng)用前景[5]。

鈣通道的異常激活已被證實在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，鈣通道阻滯劑維拉帕米聯(lián)合多烯紫杉醇或長春新堿能夠誘導(dǎo)肺癌耐藥細(xì)胞自噬爆發(fā)和凋亡[7]。硝苯地平(nifedipine)是一種已知的L型鈣通道阻滯劑，是世界衛(wèi)生組織(WHO)基本藥物目錄中最有效、最安全的藥物之一。其通過阻斷L型電壓依賴性鈣通道(L-type voltage dependent calcium channel，L-VDCC)，減少鈣離子內(nèi)流進入血管平滑肌和心肌細(xì)胞而達到降壓作用，故臨床上廣泛用于高血壓的治療。雖然硝苯地平長期作為抗高血壓藥物用于臨床，但有文獻報道，硝苯地平在肺癌[8]、卵巢癌[9]、結(jié)腸癌[10]中均表現(xiàn)出抗腫瘤作用。目前，硝苯地平對肝癌的作用及機制研究鮮有文獻報道，本研究將探討硝苯地平對肝癌細(xì)胞增殖和自噬的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 肝癌細(xì)胞株Huh-7(購自中科院上海生物科學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)，穩(wěn)定過表達GFP-LC3B肝癌細(xì)胞株Huh-7(由暨南大學(xué)醫(yī)院腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和病理研究所張灝教授饋贈)。

1.1.2藥物與試劑 硝苯地平(分子式C17H18N2O6，CAS號：21829-25-4，純度≥98%，Sigma公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich公司，D2438)；胎牛血清FBS(Corille公司，C1015-05)；BCA 蛋白定量試劑盒(Thermo公司，#23327)；Cell Counting Kit-8試劑(上海同仁化學(xué)研究所，CK04)；單克隆抗體LC3B(3868S)、單克隆抗體Beclin1(3595P)、單克隆抗體Atg7(8558P)、單克隆抗體Atg3(3415P)、單克隆抗體Atg5(12994P)均購自CST公司，抗α-tubulin一抗(66031-1-Ig)購自Proteintech公司。

1.1.3儀器 Elix3+30 L+3YNERGY超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；311氣套式CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；Infinite M200 pro Nano Quant光柵型連續(xù)波長酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；Allegra X-22R冷凍離心機(美國Beckman公司)；ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；LSM710激光共聚焦掃描顯微鏡(德國ZEISS公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將Huh-7細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，胰蛋白酶常規(guī)消化傳代，選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進行實驗。

1.2.2藥物IC50實驗 胰酶室溫常規(guī)消化細(xì)胞后，用含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基吹打成分布均勻的單細(xì)胞懸液，以每孔4 000個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。細(xì)胞貼壁生長24 h后，加入硝苯地平進行干預(yù)，使其終濃度分別為0.195、0.391、0.781、1.562、3.125、6.25、12.5、25、50、100 mg·L-1，對照組給予與硝苯地平處理組對應(yīng)的DMSO，每一濃度設(shè)置3個復(fù)孔。2 d后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。使用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處吸光值。利用GraphPad Prism 8.0軟件計算IC50。

1.2.3細(xì)胞增殖實驗 胰酶室溫常規(guī)消化細(xì)胞后，用含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基吹打成分布均勻的單細(xì)胞懸液，以每孔2 000個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。細(xì)胞貼壁生長24 h后，加入硝苯地平進行干預(yù)，使其終濃度分別為1.562、3.125、6.25、12.5、25 mg·L-1，對照組給予等體積DMSO(以25 mg·L-1硝苯地平處理組為對照)，每一濃度設(shè)置3個復(fù)孔。分別干預(yù)細(xì)胞2 h，1、2、3、4、5 d后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。使用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處吸光值。細(xì)胞增殖抑制率計算公式：增殖抑制率/%=(1-藥物組OD450 nm值/對照組OD450 nm值)×100%。

1.2.4克隆形成實驗 胰酶室溫常規(guī)消化細(xì)胞后，用含10% FBS的高糖培養(yǎng)基吹打成分布均勻的單細(xì)胞懸液，以每孔2 500個細(xì)胞的密度接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)10 d后加硝苯地平，使其終濃度為25 mg·L-1，對照組給予等體積DMSO(以25 mg·L-1硝苯地平處理組為對照)，各設(shè)置6個復(fù)孔。再繼續(xù)培養(yǎng)6 d后棄去上層培養(yǎng)液，PBS輕柔洗板2次，細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min。棄去多聚甲醛，結(jié)晶紫溶液染色15 min，清水反復(fù)浸洗，室溫晾干，采集圖像保存后，每孔加入2 mL 10%的冰醋酸溶液溶解結(jié)晶紫，每孔再取100 μL置于96孔板中。使用酶標(biāo)儀檢測各孔560 nm波長處吸光度值[10]。細(xì)胞克隆抑制率公式：克隆抑制率/%=(1-藥物組OD560 nm值/對照組OD560 nm值)×100%。

1.2.5Western blot檢測 將Huh-7細(xì)胞室溫消化后接種于培養(yǎng)皿中，24 h貼壁后，加入硝苯地平進行干預(yù)，使其終濃度為0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25 mg·L-1，對照組給予等體積DMSO(以25 mg·L-1硝苯地平處理組為對照)。作用2 d后收集細(xì)胞，采用RIPA裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，再在蛋白樣品中加入上樣緩沖液混勻后，95 ℃金屬浴10 min，冰上放置10 min后，保存于-20 ℃冰箱備用。采用SDS-PAGE凝膠電泳分離總蛋白樣品，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉(TBST配制)室溫?fù)u床封閉1 h，4 ℃孵育一抗過夜，TBST洗膜5次，每次10 min。5%脫脂奶粉(TBST配制)室溫?fù)u床封閉0.5 h，室溫孵育二抗1.5 h，TBST洗膜5次，每次10 min。與ECL發(fā)光液反應(yīng)2～3 min后，X線片曝光、顯影、定影。采用Gel-Pro Analyzer圖像分析系統(tǒng)計算分析X線片吸光度值。

1.2.6激光共聚焦檢測 胰酶室溫常規(guī)消化穩(wěn)定過表達GFP-LC3B的Huh-7細(xì)胞后，用含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基吹打成分布均勻的單細(xì)胞懸液，按每孔1×105個細(xì)胞的密度接種于35 mm激光共聚焦觀測培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)于恒溫培養(yǎng)箱中。細(xì)胞貼壁24 h后，加入硝苯地平進行干預(yù)，使其終濃度為6.25、25 mg·L-1，對照組給予等體積DMSO(以25 mg·L-1硝苯地平處理組為對照)。再繼續(xù)培養(yǎng)2 d后，-20 ℃預(yù)冷的無水甲醇進行固定。PBS漂洗3次，每次5 min，進行DAPI染色。PBS漂洗3次，每次5 min，使用熒光抗淬滅劑進行封片。通過激光共聚焦顯微鏡采集圖像，GFP檢測波長為510～550 nm，DAPI檢測波長為450～470 nm。

2 結(jié)果

2.1 硝苯地平對Huh-7細(xì)胞增殖的抑制作用CCK-8結(jié)果顯示，不同濃度的硝苯地平干預(yù)Huh-7細(xì)胞2 d后，硝苯地平劑量在12.5 mg·L-1開始對Huh-7細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且隨著藥物濃度的升高抑制作用越明顯，呈劑量效應(yīng)依賴性，見Fig 1A。2 d時硝苯地平的半數(shù)抑制濃度(IC50)為22.7 mg·L-1，硝苯地平12.5、25 mg·L-1的細(xì)胞增殖抑制率結(jié)果分別(36.62 ± 2.48)%、(60.04 ± 2.10)%。為了證明硝苯地平作用時間對肝癌細(xì)胞的影響，我們用硝苯地平(1.562、3.125、6.25、12.5、25 mg·L-1)干預(yù)Huh-7細(xì)胞2 h，1、2、3、4、5 d，結(jié)果顯示，硝苯地平對Huh-7細(xì)胞表現(xiàn)出的抑制作用隨濃度或時間的增加而增強，見Fig 1B。

Fig 1 The inhibitory effect of nifedipine on proliferation of hepatoma cell line Huh-7 n=3)A:Different concentrations of nifedipine intervened Huh-7 cells for 2 days;B:Different concentrations of nifedipine intervened for 2 h,1 d,2 d,3 d,4 d and 5 d.*P<0.05,**P<0.01 vs control group

Fig 2 Clone formation of hepatoma cell line Huh-7 inhibited by nifedipine n=6)**P<0.01 vs control group

2.2 硝苯地平對Huh-7細(xì)胞克隆形成的影響采用克隆形成實驗觀察硝苯地平對Huh-7細(xì)胞集落形成能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硝苯地平(25 mg·L-1)干預(yù)后，與對照組相比，結(jié)晶紫陽性染色明顯減少，Huh-7細(xì)胞的克隆形成率顯著降低，克隆形成的抑制率為(95.46±0.45)%。

2.3 硝苯地平對LC3B-Ⅱ、Beclin1蛋白表達的影響Western blot結(jié)果表明，硝苯地平(0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25 mg·L-1)干預(yù)Huh-7細(xì)胞后，自噬相關(guān)蛋白(Atg)7、Atg3、Atg5表達無明顯變化，Ⅱ型微管相關(guān)蛋白輕鏈3B(LC3B-Ⅱ)的表達水平隨濃度而增加，Beclin1蛋白表達水平也上調(diào)，見Fig 3。提示硝苯地平對肝癌細(xì)胞的自噬小體形成具有明顯的促進作用。

2.4 硝苯地平對穩(wěn)定表達GFP-LC3B肝癌細(xì)胞Huh-7自噬小體形成的影響對GFP-LC3B穩(wěn)定表達的Huh-7細(xì)胞進行硝苯地平(6.25、25 mg·L-1)干預(yù)，24 h后使用激光共聚焦顯微鏡進行觀測。結(jié)果顯示，硝苯地平可以促進GFP-LC3B的聚集，在細(xì)胞內(nèi)形成了綠色熒光富集區(qū)。熒光光密度分析結(jié)果提示，硝苯地平組GFP熒光密度明顯增高，見Fig 4。提示硝苯地平可以促進自噬小體形成。

Fig 3 Effect of nifedipine on LC3B-Ⅱ and Beclin1 protein expression n=3)A:Western blot detected the expression of autophagy related proteins;B:The relative expression of proteins,alpha-tubulin was used as an internal control.**P<0.01 vs control group

Fig 4 Effect of nifedipine on formation of autophagosomes in Huh-7 hepatoma cells stably expressing GFP-LC3B n=3)**P<0.01 vs control group

3 討論

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重的威脅著我國人民的生命健康。研究發(fā)現(xiàn)，鈣離子與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，維拉帕米、地爾硫卓等包括硝苯地平在內(nèi)的多種鈣通道阻滯劑均被報道具有腫瘤抑制作用[6]。其中，與其它阻滯劑相比，硝苯地平憑借其作為幾十年暢銷藥的安全性更值得在抗腫瘤藥物的探索中被關(guān)注。本研究中，以人肝癌細(xì)胞Huh-7為研究對象，硝苯地平進行干預(yù)，檢測硝苯地平對肝癌細(xì)胞增殖抑制的作用。CCK-8結(jié)果提示，硝苯地平對Huh-7細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，并隨著藥物濃度和時間的增加抑制作用增強；細(xì)胞克隆形成實驗結(jié)果顯示，肝癌細(xì)胞Huh-7具有較強增殖能力，但在25 mg·L-1劑量的硝苯地平作用下表現(xiàn)出顯著的增殖抑制作用。以上結(jié)果表明硝苯地平對肝癌細(xì)胞具有良好的體外抗腫瘤效應(yīng)。

自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有雙重作用，一方面，自噬在氧化應(yīng)激與機體防御中，維持基因組的穩(wěn)定性起到抑癌作用[5]；另一方面，細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的循環(huán)利用，讓腫瘤細(xì)胞在營養(yǎng)壓力、缺氧和細(xì)胞毒性治療中得以生存[12]。盡管癌癥治療過程中自噬的應(yīng)用存在爭議，但不可否認(rèn)自噬抑制劑和誘導(dǎo)劑在癌癥治療中都是有用的。自噬抑制劑與化療藥物的聯(lián)合可導(dǎo)致癌細(xì)胞對化療藥物敏感，從而提高其療效；相反，自噬的過度激活(自噬誘導(dǎo)劑)會導(dǎo)致細(xì)胞失去對這種生存機制激活的控制，從而導(dǎo)致自噬介導(dǎo)的細(xì)胞死亡[3]。自噬是細(xì)胞成分選擇性降解的重要過程。自噬首先形成杯狀雙層膜結(jié)構(gòu)，包圍并隔離細(xì)胞器和蛋白質(zhì)，進一步延伸、封閉而形成自噬小體。然后自噬小體經(jīng)歷一個逐步成熟的過程，與溶酶體融合，最終導(dǎo)致自噬小體內(nèi)容物傳遞到溶酶體進行降解和循環(huán)。LC3與自噬小體的形成有關(guān)，LC3包括LC3A、LC3B、LC3C 3種亞型，其中LC3B-Ⅱ是由LC3B-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合而形成的一種難以降解的蛋白質(zhì)，已知其水平與自噬體的數(shù)量相關(guān)[13-14]。在本研究中，在硝苯地平進行干預(yù)后通過Western blot檢測LC3B-Ⅱ的變化，結(jié)果顯示，LC3B-Ⅱ蛋白表達增加，表明硝苯地平促進自噬小體的形成，增加了自噬小體的數(shù)量。另外，通過激光共聚焦顯微成像技術(shù)觀測穩(wěn)定過表達GFP-LC3B的Huh-7細(xì)胞在硝苯地平干預(yù)后的改變，結(jié)果顯示，GFP-LC3B聚集增加，GFP熒光密度明顯增高，進一步證明硝苯地平促進自噬小體的形成，表明硝苯地平抑制Huh-7細(xì)胞增殖與細(xì)胞自噬有關(guān)。

哺乳動物自噬基因Beclin1位于染色體17q21上，在高達50%的乳腺癌、75%的卵巢癌以及40%的前列腺癌中發(fā)現(xiàn)該區(qū)域的單等位基因缺失[15]。Beclin1對自噬蛋白定位到自噬前體結(jié)構(gòu)(PAS)具有重要意義，其與Ⅲ類磷酸肌醇3-激酶(PI3KC3)/液泡分選蛋白(Vps)34相互作用，形成Beclin1-Vps34-Vps15核心復(fù)合體[16]。該復(fù)合促進PI3P的產(chǎn)生，從而促進自噬小體的形成[17]。在本研究中，同樣對Huh-7細(xì)胞進行硝苯地平干預(yù)，通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，Beclin1蛋白表達水平隨硝苯地平濃度的增加而上調(diào)，這提示硝苯地平可能通過上調(diào)Beclin1蛋白從而促進自噬小體的形成。

綜上，硝苯地平可抑制肝癌細(xì)胞Huh-7增殖，引起LC3B-Ⅱ和Beclin1蛋白的改變，同時，促進肝癌細(xì)胞Huh-7自噬小體形成，這可能與細(xì)胞自噬有關(guān)。本研究將提供一個潛在的以自噬為靶向的抗肝癌藥物。