李連旭， 王 軍， 李 旋， 王 東， 汝少國

(中國海洋大學海洋生命學院， 山東 青島 266003)

多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是指由兩個或兩個以上苯環(huán)組成的有機化合物，具有致癌、致畸、致突變和難降解等特性，一直以來都是環(huán)境科學領(lǐng)域備受關(guān)注的一類污染物[1-2]。PAHs在水體、沉積物和生物體內(nèi)被廣泛檢出，并且低環(huán)PAHs占主導地位[3-5]。Yu等[6]發(fā)現(xiàn)二環(huán)和三環(huán)PAHs是中國七條主要河流PAHs污染的主要組分，其中三環(huán)的菲(Phenanthrene, Phe)被認定為需要優(yōu)先控制的一種PAHs。Phe在中國海水與地表水中的濃度通常在50 ng/L～26.1 μg/L之間[7-8]，如九龍江河口、閩江河口、珠江澳門水域和長江口表層水體中Phe的濃度分別為1 370、1 700、101.8和91.73 ng/L[9-13]。鑒于Phe的高檢出率與高環(huán)境濃度，它常被作為PAHs的代表，用于研究此類污染物對海洋生物的毒性效應(yīng)[14-15]。

萘、菲、熒蒽和苯并[a]芘對大型蚤(Daphniamagna)的24 h半數(shù)致死濃度(LC50)分別為5.485、3.226、0.295和0.004 1 mg/L；0.4 mg/L的Phe暴露會對大型蚤的體長、產(chǎn)卵時間與初次產(chǎn)幼時間產(chǎn)生顯著影響[16]。1,2-二甲基萘和芘對火腿偽鏢水蚤(Pseudodiaptomuspoplesia)的96 h LC50分別為788.98和54.68 μg/L[17]。Hung等[18]調(diào)查表明臺灣高平海域浮游動物體內(nèi)PAHs含量在5～5 440 ng/L(干質(zhì)量)，其中Phe是最主要的化合物，占總PAHs的10.5%。Yoshinori等[19]表明短時間內(nèi)苯并[a]芘會對浮游動物的豐度和群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。由于海洋浮游動物占據(jù)著重要的生態(tài)學地位，所以急需拓展相關(guān)污染物對浮游動物的毒性效應(yīng)研究。

海洋橈足類是海洋次級生產(chǎn)力的主要組成部分，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動中起重要作用[20-21]。日本虎斑猛水蚤(Tigriopusjaponicus)是一種廣泛分布于西太平洋近岸的底棲橈足類[22]，在實驗室內(nèi)易于培養(yǎng)、世代周期短、對污染物敏感，已被用作海洋污染物毒性測試的標準生物[23-24]。本研究選擇日本虎斑猛水蚤為受試生物開展Phe的毒性效應(yīng)研究。首先，測定了Phe對日本虎斑猛水蚤96 h的LC50。隨后，利用不同濃度的Phe開展全生命周期暴露，從攝食率、發(fā)育周期、持續(xù)產(chǎn)幼量與卵囊發(fā)育時間等多個指標綜合探究了Phe對日本虎斑猛水蚤的攝食、生長發(fā)育和繁殖能力的潛在危害，以期為評估PAHs對海洋浮游動物的生態(tài)風險提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和實驗生物

菲(Phe, CAS NO.: 85-01-8, 純度99.9%)購自Dr. Ehrenstorfer GmbH公司(奧格斯堡, 德國)，二甲基亞砜(DMSO, CAS NO.: 67-68-5, 純度99.5%)購于Sigma-Aldrich公司(上海, 中國)。將5 mg Phe溶于1 mL DMSO制備成5 mg/mL的儲液，常溫下避光保存，每周更新一次。

本研究所用的日本虎斑猛水蚤已在實驗室內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)了數(shù)代，在光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，條件為溫度(21±2) ℃，光暗比12 h∶12 h。培養(yǎng)所用海水經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后滅菌，培養(yǎng)鹽度為29±1。每天投喂1×105cells/mL青島大扁藻(Platymonashelgolandica)，并清除培養(yǎng)器皿底部沉降的餌料、糞便和尸體等殘渣。

1.2 生物毒性實驗

1.2.1 急性毒性實驗 參照國標《GB/T 13266-91水質(zhì) 物質(zhì)對蚤類(大型蚤)急性毒性測定方法》進行。設(shè)置空白對照組、溶劑對照組，以及2.0、2.8、3.9、5.4、7.4、10.4、14.4 mg/L Phe暴露組，共9組。每個組挑選20只孵化時間小于24 h的日本虎斑猛水蚤無節(jié)幼體，持續(xù)暴露96 h，期間投喂青島大扁藻作為餌料，濃度為1 × 105cells/mL。暴露體系為5 mL，所有實驗組中的DMSO濃度均不高于0.1 ‰，每組設(shè)置3個平行。每24 h更新一次暴露液，并觀察日本虎斑猛水蚤的狀況，通過反復轉(zhuǎn)動試驗容器，以15 s內(nèi)失去活動能力視為死亡，根據(jù)概率單位分析方法計算96 h的LC50[25]。

1.2.2 比生長速率 根據(jù)急性毒性實驗結(jié)果設(shè)置Phe的慢性暴露濃度分別為0、5、50、500 μg/L，挑選孵化24 h以內(nèi)的無節(jié)幼體開展暴露實驗。實驗在六孔板中進行，每孔放置10只無節(jié)幼體，每個實驗組設(shè)置3個平行，所有實驗組中的DMSO濃度均不高于0.1‰，實驗過程中水質(zhì)等條件與養(yǎng)殖過程相同。實驗期間每天更換暴露液，并從各組隨機選取6只日本虎斑猛水蚤，在顯微鏡下觀察拍照，用S-gauge測量，記錄體長、體寬，根據(jù)公式g=[ln(lt)-ln(l0)]/t，計算生長速率(g)，式中：lt表示培養(yǎng)當天的日本虎斑猛水蚤體長，l0表示初始的無節(jié)幼體體長，t表示培養(yǎng)的天數(shù)。

1.2.3 發(fā)育時期 在實驗前一天挑選帶紅褐色卵的雌性個體(n=100)于六孔板中培養(yǎng)，以保證實驗所需的無節(jié)幼體均為同一時間段孵化。挑選新出生的F0代無節(jié)幼體(< 24 h)于12孔板中，每孔1只，每個實驗組20個重復，暴露體系為4 mL，喂食和換液方式同1.2.1。每天在解剖鏡下觀察無節(jié)幼體的發(fā)育情況，記錄各組從無節(jié)幼體至橈足幼體(N～C)、橈足幼體至成體(C～A)的發(fā)育時間。各時期蟲體的判斷標準為：無節(jié)幼體蟲體腹部出現(xiàn)分節(jié)表示發(fā)育到橈足幼體期，而雄性觸角特化為執(zhí)握器、雌性生殖節(jié)愈合或掛卵表示發(fā)育到成體(見圖1)。

(A～F.無節(jié)幼體時期Naupliu stages；G～J.為橈足幼體期Copepodid stages；K.雄性成體(箭頭所示為特化成的執(zhí)握器)。Adult males (The arrow shows the specialized clasper)；L.雌性成體(箭頭所示為愈合生殖節(jié))。Adult females (The arrow shows the genital segments).)

1.2.4 總產(chǎn)幼數(shù)與卵囊發(fā)育時間 待日本虎斑猛水蚤發(fā)育至性成熟后，從各組收集雌體，在相同的Phe濃度下繼續(xù)暴露，觀察并記錄日本虎斑猛水蚤10 d內(nèi)的卵囊發(fā)育情況和產(chǎn)幼數(shù)量，以及卵囊發(fā)育時間(從掛卵孵化到下一次掛卵的時間)。

收集各組第三批新出生的F1代無節(jié)幼體(<24 h)，轉(zhuǎn)移至不含有Phe的清水中孵育，培養(yǎng)方式同上。統(tǒng)計F1代無節(jié)幼體(N)發(fā)育到橈足幼體期(C)和成體期(A)所需的時間。

1.2.5 攝食率、濾水率與呼吸率 在100 mL的密閉塑料瓶中配置含有0、5、50、500 μg/L Phe和1×105cells/mL青島大扁藻液的培養(yǎng)體系。向每個瓶中投放30只饑餓了24 h的無節(jié)幼體，置于黑暗中持續(xù)暴露24 h。同時，設(shè)置溶劑對照組和藻類對照組(無橈足類)，以表示微藻在無捕食條件下的正常生長情況，每個濃度設(shè)置3個平行。實驗結(jié)束后，首先用YSI溶氧儀測定對照組和實驗組的溶解氧(DO)，然后取1 mL暴露液用魯哥氏液固定，在顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)，計算青島大扁藻的濃度。根據(jù)公式(1)～(3)計算濾水率、攝食率和呼吸率：

F=V(lnCt-lnCtf)/(N·t)；

(1)

G=V(lnCt-lnCtf)(Ctf-C0)/[N·t(lnCtf-lnC0)]。

(2)

式中：F代表濾水率(mL·h-1)，即每只橈足類每小時過濾的海水量；G代表攝食率(cells·h-1)，即每只橈足類每小時過濾的餌料細胞數(shù)；V代表食物溶液體積(mL)；N代表橈足類的只數(shù)；C0代表起始食物濃度(cells·mL-1)；Ct代表對照瓶中的最終食物濃度(cells·mL-1)；Ctf代表實驗瓶中剩余食物濃度(cells·mL-1)；t代表攝食時間(h)。

R0=(C0-Ci)·V·0.7/(n·t)。

(3)

式中：R0代表呼吸率 (μL·ind-1·h-1)；C0代表空白對照組DO濃度(mg·L-1)；Ci代表實驗組DO濃度(mg·L-1)；V代表實驗溶液體積(mL)；n為每瓶橈足類個數(shù)；t代表實驗時間(h)；0.7代表氧氣質(zhì)量轉(zhuǎn)化體積的系數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示，用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，方差同質(zhì)性用Levene’s方法檢驗，采用單因素方差分析(One-Way·ANOVA)評價對照組和各暴露組間的差異，并進行Tukey’s顯著性檢驗，置信水平P< 0.05為差異顯著，P< 0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 Phe對日本虎斑猛水蚤的半數(shù)致死濃度

溶劑對照組日本虎斑猛水蚤的抑制率均為0。采用概率單位法計算出Phe對日本虎斑猛水蚤的48、72、96 h LC50分別為3.061、3.983和3.675 mg/L(見表1)。通過觀察，日本虎斑猛水蚤死亡率隨著暴露時間的延長和暴露濃度的升高逐漸升高，表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系(見圖2)。

表1 Phe對日本虎斑猛水蚤急性毒性實驗結(jié)果

圖2 不同濃度Phe對日本虎斑猛水蚤的致死率結(jié)果

2.2 Phe對攝食率、濾水率和呼吸率的影響

與空白對照組相比，50和500 μg/L Phe暴露顯著降低了日本虎斑猛水蚤的濾水率與攝食率(P<0.05)，其中攝食率只有對照組的45.1%與27.8%(見圖3)。日本虎斑猛水蚤的呼吸率則在Phe的暴露下出現(xiàn)了劑量依賴性下降，與對照組相比分別下降了68.5%、84.4%、93.8%(P<0.01)。

(表示與對照組相比具有統(tǒng)計學上的顯著性(P<0.05)，表示與對照組相比具有統(tǒng)計學上的極顯著性(P<0.01)。The asterisks indicate statistically significant differences from the control group (P<0.05, P<0.01).)

2.3 Phe對生長和繁殖的影響

2.3.1 比生長速率 與空白對照組相比，5、50和500 μg/L Phe暴露72和96 h均顯著降低了日本虎斑猛水蚤的比生長速率(P<0.05)，其中500 μg/L Phe暴露組72和96 h的比生長速率分別比對照組下降了67.2%和63.9%(P<0.01, 見圖4)。50和500 μg/L Phe暴露24 h后日本虎斑猛水蚤的比生長速率也出現(xiàn)了顯著下降(P<0.05)，而48 h時各組的比生長速率無顯著性差異(P>0.05)。

(表示與對照組相比具有統(tǒng)計學上的顯著性(P<0.05)，表示與對照組相比具有統(tǒng)計學上的極顯著性(P<0.01)。The asterisks indicate statistically significant differences from the control group (P<0.05, P<0.01).)

2.3.2 發(fā)育時間 與對照組相比，5、50和500 μg/L Phe暴露顯著延長了F0代日本虎斑猛水蚤從無節(jié)幼體發(fā)育到橈足幼體、從無節(jié)幼體為發(fā)育到成體，以及從橈足幼體發(fā)育到成體的時間，并且Phe對F0代發(fā)育時間的延長表現(xiàn)出明顯的劑量依賴效應(yīng)(P<0.01, 見圖5)。500 μg/L Phe暴露下F0代交配后無掛卵雌蚤出現(xiàn)，未產(chǎn)出F1代。收集5和50 μg/L Phe暴露后F0代雌蚤產(chǎn)出的F1代在清水中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)它們的發(fā)育時間與對照組相比顯著延長(P<0.01)。

(表示與對照組相比具有統(tǒng)計學上的顯著性(P<0.05)，表示與對照組相比具有統(tǒng)計學上的極顯著性(P<0.01)。The asterisks indicate statistically significant differences from the control group (P<0.05, P<0.01).)

2.3.3 掛卵率 與對照組相比，5、50和500 μg/L Phe暴露18 d顯著降低了日本虎斑猛水蚤的掛卵率，其中500 μg/L Phe暴露組未出現(xiàn)掛卵現(xiàn)象(P<0.01)，導致生殖失敗(見圖6)。

(表示與對照組相比具有統(tǒng)計學上的顯著性(P<0.05)，表示與對照組相比具有統(tǒng)計學上的極顯著性(P<0.01)。The asterisks indicate statistically significant differences from the control group (P<0.05, P<0.01).)

2.3.4 總產(chǎn)幼數(shù)和卵囊發(fā)育時間 與對照組相比，50 μg/L Phe暴露導致日本虎斑猛水蚤10 a內(nèi)的總產(chǎn)幼數(shù)出現(xiàn)顯著下降(P<0.01)，僅為對照組的58.3%(見圖7A)。此外，50 μg/L Phe暴露下卵囊發(fā)育時間也出現(xiàn)了顯著延長(P<0.01, 見圖7B)。

(表示與對照組相比具有統(tǒng)計學上的顯著性(P<0.05)。The asterisks indicate statistically significant differences from the control group (P<0.05).)

3 討論

3.1 Phe對日本虎斑猛水蚤幼體的急性毒性效應(yīng)

本研究測得Phe對日本虎斑猛水蚤幼體的96 h-LC50為3.675 mg/L。急性毒性試驗即單次給藥毒性試驗，指機體(人或試驗動物)一次(或24 h內(nèi)多次)接觸外來化合物之后所引起的中毒效應(yīng)，甚至死亡[26-28]。橈足類種類繁多且存在多個發(fā)育階段，導致同一種污染物對不同橈足類的急性毒性數(shù)據(jù)存在較大差異。例如，Phe對湯氏紡錘水蚤(Acartiatonsa)的48 h LC50為316.7 μg/L，而Phe對萼花臂尾輪蟲(Brachionuscalyciflorus)的24 h EC50為195.7 mg/L[29-30]。有研究報道Phe對偽鏢水蚤(Pseudodiaptomuspelagicus)的96 h LC50為161 μg/L[31]，遠低于本研究測得Phe對日本虎斑猛水蚤的96 h LC50值。急性毒性測試結(jié)果為污染物環(huán)境基準的制訂與生態(tài)風險評估工作的開展提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。為保證制訂的環(huán)境標準能夠有效保護整個生態(tài)系統(tǒng)，建議采用生物的敏感期開展暴露實驗。

3.2 Phe對日本虎斑猛水蚤攝食、呼吸以及生長發(fā)育的影響

慢性毒性暴露實驗結(jié)果表明，5、50和500 μg/L Phe暴露均導致日本虎斑猛水蚤的呼吸率顯著下降，同時高濃度的Phe暴露顯著降低了其攝食率和濾水率。隨著Phe暴露濃度的增加，日本虎斑猛水蚤的比生長速率逐漸降低，其中中、高濃度Phe暴露顯著降低了日本虎斑猛水蚤F0和F1代的發(fā)育周期。低濃度Phe暴露雖然沒有影響F0代的發(fā)育周期，但是導致F1代的發(fā)育周期延長。Yoon等[32]報道20 mg/L阿特拉津長期暴露日本虎斑猛水蚤，會導致生長發(fā)育遲緩，蛻皮和變態(tài)時間延長。Fei等[33]研究表明，食物短缺會延長日本虎斑猛水蚤的幼蟲發(fā)育。本研究的生長速率的降低和發(fā)育周期的延長也是攝食率的降低導致。例如，暴露于3.5 μg/L甲維鹽24 h后日本虎斑猛水蚤出現(xiàn)部分個體趴底、運動能力明顯下降的現(xiàn)象，而5 μg/L甲維鹽會導致所有個體均趴底，無自主活動能力，嚴重影響到其攝食和濾水的效率[34]。因此，Phe可能是通過減少橈足類的攝食，降低其營養(yǎng)積累，導致最終生長發(fā)育緩慢。

3.3 Phe對日本虎斑猛水蚤繁殖能力的影響

Phe暴露下日本虎斑猛水蚤雖有持續(xù)交配行為，但隨著Phe濃度的升高其掛卵率不斷下降，500 μg/L暴露組甚至無掛卵，導致無F1代產(chǎn)生。在高濃度Phe暴露下，日本虎斑猛水蚤的10 d總持續(xù)產(chǎn)幼數(shù)顯著下降，且卵囊發(fā)育時間顯著增加。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是其在面臨環(huán)境的脅迫時將自身所獲得的能量更多的分配在抵御環(huán)境脅迫上，而減少分配在發(fā)育及繁殖上的能量。王超等[35]研究指出55.29 μg/L的四溴雙酚A(TBBPA)可以導致日本虎斑猛水蚤雌體生殖力顯著升高。徐風風[36]的研究發(fā)現(xiàn)高濃度的四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)會導致日本虎斑猛水蚤產(chǎn)幼數(shù)量明顯減少。橈足類的卵富含脂類，會積聚高濃度的親脂污染物[18,37]。Almeda等[37]報道Acartiatonsa經(jīng)過石油暴露后，其卵中會存在Phe、熒蒽(Fluoranthene)等PAHs，表明PAHs可以通過卵向下一代轉(zhuǎn)移。金香琴等[16]報道PAHs會對雌性大型水蚤的最終體長、初次掛卵時間、初次產(chǎn)幼時間以及產(chǎn)水蚤總量產(chǎn)生顯著的影響，其中雌性大型水蚤的最終體長和產(chǎn)水蚤總量對PAHs最為敏感。因此，PAHs暴露會引起橈足類為抵御不良狀態(tài)而降低產(chǎn)卵量，同時降低生長發(fā)育速率，導致種群數(shù)量減少。

綜上所述，Phe暴露導致日本虎斑猛水蚤的攝食率、濾水率和呼吸率受到抑制，發(fā)育周期延長，繁殖能力下降，且存在一定時間和劑量效應(yīng)。海洋橈足類作為食物鏈中重要的一環(huán)，是多種海洋生物幼體的優(yōu)質(zhì)開口餌料[38]，其繁殖能力的降低可能會縮小種群規(guī)模，群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進而影響海洋生態(tài)系統(tǒng)功能。

4 結(jié)語

Phe對日本虎斑猛水蚤幼體的96 h LC50為3.675 mg/L。Phe的短期暴露降低了日本虎斑猛水蚤的攝食率、濾水率與呼吸率，導致能量攝入減少，進而造成比生長速率降低和發(fā)育周期延長；Phe長期暴露會導致日本虎斑猛水蚤掛卵率降低，總持續(xù)產(chǎn)幼數(shù)減少，卵囊發(fā)育時間延長，甚至在最高濃度組無掛卵，繁殖能力受到嚴重損傷。