張明亮,王俊,翁可欣,李力,黃建忠,林清強(qiáng)*

1(福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,福建 福州,35018) 2(工業(yè)微生物發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,福建 福州,35018)

二十二碳六烯酸(C22:6,cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid,DHA)對(duì)人類健康起重要生理作用,能影響細(xì)胞膜功能、增強(qiáng)機(jī)體免疫、治療抑郁癥、治療和預(yù)防心腦血管疾病、抗腫瘤、抗炎、對(duì)抗肥胖、促進(jìn)大腦發(fā)育、促進(jìn)視力發(fā)育和預(yù)防老年癡呆等[1]。人類和哺乳動(dòng)物無法從頭合成DHA,只能從食物中攝取。DHA的主要來源是魚類和植物。由于魚油容易受環(huán)境污染,存在食品安全隱患,人們對(duì)從可持續(xù)、安全和經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)DHA的替代資源的研究越來越廣泛。許多微生物物種/菌株具有大量合成DHA的能力,且DHA占總脂肪酸的比例很高,這些天然生產(chǎn)者主要包括海洋細(xì)菌、真菌、原生生物和微藻。破囊壺菌(Aurantiochytriumsp.)是從海水中分離得到的海洋單細(xì)胞真菌,其生長(zhǎng)快,生物量高,油脂及DHA含量較高,一直以來被認(rèn)為是理想的DHA生產(chǎn)菌株[2-4]。同時(shí),破囊壺菌與裂殖壺菌(Schizochytriumsp.)的同源性很高[5],后者也是當(dāng)前DHA產(chǎn)業(yè)化的主要生產(chǎn)菌,其安全性已得到論證[6]。

近些年來,微生物生產(chǎn)DHA的發(fā)酵工藝研究比較多,如通過控制溶氧、pH及優(yōu)化碳源提高DHA產(chǎn)量等[7-9]。溫度對(duì)產(chǎn)油微生物生物量、油脂含量及組成的影響已有一些研究報(bào)道[5,10-12]。溫度是DHA生物合成的一個(gè)非常重要的環(huán)境因素。本課題組前期研究低溫脅迫對(duì)裂殖壺菌DHA生物合成及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)低溫有利于DHA的積累,低溫脅迫下SOD的mRNA表達(dá)量最高[13]。近年,溫度促進(jìn)DHA積累的機(jī)制也有一些研究報(bào)道,MA等[14]通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序手段研究了低溫對(duì)Aurantiochytriumsp.積累DHA的影響,發(fā)現(xiàn)參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞成分的生物合成、糖脂代謝的相關(guān)基因的差異表達(dá)對(duì)菌體低溫適應(yīng)至關(guān)重要；HU等[15]研究了低溫對(duì)裂殖壺菌生物合成DHA的影響及機(jī)制,低溫可以顯著增加DHA占總脂肪酸的含量,但負(fù)責(zé)DHA生物合成的聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)途徑基因的表達(dá)水平?jīng)]有明顯的差異,而支鏈氨基酸降解途徑和戊糖磷酸途徑及其相關(guān)基因表達(dá)明顯上調(diào),飽和脂肪酸生物合成(脂肪酸合成途徑基因和蘋果酸酶)明顯下調(diào),這促進(jìn)了大量底物乙酰-CoA進(jìn)入PKS途徑合成DHA。低溫可以顯著提高DHA占總脂肪酸的含量,但對(duì)細(xì)胞生物量的積累不利。另外,不同溫度對(duì)油脂的積累也有明顯的影響,但如何平衡三者量的關(guān)系,溫度優(yōu)化調(diào)控可能是DHA工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵。

本研究以Aurantiochytriumsp.FN21為研究對(duì)象,該菌為經(jīng)纖維素水解液馴化的破囊壺菌突變株,在富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中擁有積累較高DHA水平的能力[16]。通過優(yōu)化溫度調(diào)控策略,實(shí)現(xiàn)生物量、總脂肪酸含量及DHA的含量平衡,以促進(jìn)DHA產(chǎn)量提高,也為提高DHA產(chǎn)量及品質(zhì)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

YXQ-2S-30SⅡ高壓滅菌鍋,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;SW-CJ-2G超凈工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備有限公司;ZHWY-2122B雙層全控溫?fù)u床,上海智誠(chéng)分析儀器有限公司;SBA-40D生物傳感器,山東省科學(xué)院生物研究所;GUJS-15-100 AUTOBIO型全自動(dòng)機(jī)械攪拌成套不銹鋼發(fā)酵罐,鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司;Microfuge?22R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī),BECKMAN COULTEK;DO電極、pH電極計(jì),METTLER TOLEDO;6890C-5975N氣質(zhì)聯(lián)用儀,Agilent。

1.2 菌株

破囊壺菌(Aurantiochytriumsp.FN21),海水中分離篩選并通過纖維素水解液馴化,保存于-80 ℃超低溫冰箱中。

1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30,蛋白胨10,酵母浸汁粉5,海水晶15。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖含量為90 g/L,其他配方參考課題組前期已發(fā)表文獻(xiàn)[16]。

1.4 培養(yǎng)條件

15 L發(fā)酵罐發(fā)酵：按接種量5%～10%將種子液移入發(fā)酵罐中,初始發(fā)酵體積8 L,葡萄糖20 g/L,通氣量1.0～2.0 vvm(air volume/culture volume/min),攪拌速度200～600 r/min(根據(jù)溶液控制),在24～108 h間流加700 g/L的葡萄糖,每隔12 h取樣,測(cè)定殘?zhí)呛?、生物量、油脂含量及DHA含量。

1.5 測(cè)定方法

發(fā)酵液殘?zhí)呛繙y(cè)定：取1 mL發(fā)酵樣品8 000 r/min,5 min離心,去除菌體及固體殘?jiān)?取上清液,稀釋至合適濃度,使殘?zhí)侵迪陆抵?.6～0.8 g/L,使用生物傳感器測(cè)定樣品葡萄糖含量,殘?zhí)橇?測(cè)量值×稀釋倍數(shù)。細(xì)胞干重、總脂肪酸含量及脂肪酸組成分析參考課題組前期發(fā)表的文獻(xiàn)[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)破囊壺菌生物量、總脂肪酸產(chǎn)量及DHA產(chǎn)量的影響

ZENG等[12]考察了不同溫度對(duì)裂殖壺菌產(chǎn)DHA的影響,發(fā)現(xiàn)低溫(15 ℃)會(huì)延長(zhǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)的時(shí)間,當(dāng)溫度>35 ℃時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制,20～30 ℃為裂殖壺菌較佳的培養(yǎng)溫度。在搖瓶發(fā)酵水平考察了溫度對(duì)破囊壺菌生物量、總脂肪酸產(chǎn)量及DHA產(chǎn)量的影響,分別設(shè)置了15、20、25、28、30、35 ℃的培養(yǎng)溫度。從圖1-a可知,當(dāng)培養(yǎng)溫度為15 ℃時(shí),Aurantiochytrium.sp.FN21的生物量明顯減少,其生長(zhǎng)受到抑制。當(dāng)溫度為20～35 ℃時(shí),可以獲得較大的菌體生物量,尤其是當(dāng)溫度為28 ℃時(shí),菌體生物量最大為41.41 g/L,說明此溫度為菌體最適的生長(zhǎng)溫度。由圖1-b可知,溫度對(duì)Aurantiochytriumsp.FN21總脂肪酸的作用規(guī)律與生物量類似,20～35 ℃的培養(yǎng)溫度較利于破囊壺菌油脂的積累。當(dāng)培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí),收獲最大的總脂肪酸量達(dá)到18.13 g/L。15 ℃培養(yǎng)時(shí),總脂肪酸產(chǎn)量較低(4.41 g/L),主要是由于此溫度下培養(yǎng)獲得的生物量較低。

a-生物量；b-油脂含量；c-DHA含量圖1 溫度對(duì)破囊壺菌細(xì)胞生長(zhǎng)、油脂含量及DHA含量的影響Fig.1 Effects of temperature variation on biomass,total lipid and DHA production by Aurantiochytrium sp.FN21.

在不同溫度培養(yǎng)條件下,破囊壺菌的DHA產(chǎn)量變化較大,其變化趨勢(shì)總體與菌體生物量及總脂肪酸產(chǎn)量的變化趨勢(shì)呈正相關(guān),但也有一些差異。當(dāng)培養(yǎng)溫度為15 ℃時(shí),DHA產(chǎn)量最低為2.08 g/L,主要是因?yàn)樵摐囟认戮w生物量及總脂肪酸量均比較低。隨著培養(yǎng)溫度的升高,DHA產(chǎn)量顯著提高,培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí)達(dá)到最大值7.42 g/L,但培養(yǎng)溫度進(jìn)一步提高,DHA產(chǎn)量的降幅也明顯增加(圖1-c所示),說明DHA占總脂肪酸的比例可能有明顯的下降。

2.2 溫度對(duì)破囊壺菌油脂含量及組成的影響

從表1可知,不同培養(yǎng)溫度對(duì)破囊壺菌油脂含量及組成的影響較大。15 ℃培養(yǎng)時(shí),菌體油脂占細(xì)胞干重含量最低(18.02 g/L),但DHA占總脂肪酸的比例最高為47.16%。當(dāng)培養(yǎng)溫度為25～28 ℃時(shí),油脂含量處于最高區(qū)間(42.81～43.78 g/L),說明此溫度階段有利于油脂積累。隨著溫度的升高,DHA占總脂肪酸的含量降低,從15 ℃時(shí)的47.16%降低到了35 ℃時(shí)的32.71%。另外,二十二碳五烯酸(docosapentaenoic acid,DPA)與DHA的比值(DPA/DHA)不斷增加(從0.12到0.33),說明低溫有利于DHA的積累,同時(shí)可降低DPA的生成。而C16∶0(棕櫚酸)的含量隨著培養(yǎng)溫度的升高而升高,說明高溫利于飽和脂肪酸的形成。特別值得注意的是,溫度越低,奇數(shù)不飽和脂肪酸(C15)含量越低,可能低溫有利于脂肪酸α-氧化途徑的進(jìn)行,因?yàn)槠鏀?shù)碳脂肪酸是通過此途徑形成[17]。

表1 不同培養(yǎng)溫度下破囊壺菌脂肪酸的組成Table 1 Fatty acid compositions (of total fatty acids) of Aurantiochytrium sp.FN21 under different temperature

2.3 分階段控溫提高DHA產(chǎn)量

破囊壺菌發(fā)酵過程可分為細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)期和細(xì)胞體積增長(zhǎng)期。在第1個(gè)時(shí)期,細(xì)胞數(shù)量增加,體積增加不明顯。第2個(gè)時(shí)期細(xì)胞數(shù)目幾乎不增加,細(xì)胞體積變大,胞內(nèi)脂質(zhì)大量積累。由上述結(jié)果可知,當(dāng)培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí),可以收獲最大的菌體生物量,當(dāng)溫度區(qū)間為25～30 ℃時(shí),總脂肪酸占細(xì)胞干重的量最優(yōu)。隨著溫度的降低,能夠明顯的增加DHA占總脂肪酸的含量?；贏urantiochytriumsp.FN21的生長(zhǎng)特性,我們?cè)O(shè)計(jì)了以下變溫策略：0～84 h時(shí)28 ℃培養(yǎng),84～120 h時(shí)20 ℃培養(yǎng)(二階段控溫)；0～84 h培養(yǎng)溫度為28 ℃,84～108 h為25 ℃,108～120 h為15 ℃(三階段控溫),分別研究其對(duì)破囊壺菌生長(zhǎng)、油脂及DHA產(chǎn)生的影響,結(jié)果如表2所示。

表2 控溫方式對(duì)破囊壺菌發(fā)酵的影響Table 2 Effects of different temperature control mode on the fermentation of Aurantiochytrium sp.FN21

由表2可知,與對(duì)照組(全程28 ℃培養(yǎng))相比,二階段和三階段控溫培養(yǎng)對(duì)破囊壺菌生物量及油脂含量均有微降,而DHA占總脂肪酸量的比例有顯著提高,三階段控溫DHA含量46.39%,二階段控溫時(shí)DHA含量為44.79%,相比對(duì)照組,分別提高了11.33%和10.94%。采用三階段控溫策略可以有效地平衡生物量、油脂含量及DHA占總脂肪酸含量三者的關(guān)系,使它們均達(dá)到較高的水平,最終DHA產(chǎn)量達(dá)8.29 g/L,比對(duì)照提高了11.73%。

2.4 三階段控溫對(duì)分批補(bǔ)料培養(yǎng)破囊壺菌產(chǎn)DHA的影響

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們?cè)?5 L發(fā)酵罐中采取三階段控溫策略高密度發(fā)酵破囊壺菌生產(chǎn)DHA,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 采用三階段變溫發(fā)酵破囊壺菌的生長(zhǎng)、油脂含量 及DHA積累曲線Fig.2 The curve of growth,total lipid and DHA accumulations by Aurantiochytrium sp.FN21 under three-phase temperature shifting

從圖2可知,在整個(gè)發(fā)酵過程中,破囊壺菌的生物量、油脂含量及DHA含量均不斷提高。當(dāng)84 h變溫(25 ℃,84～108 h)后,菌體生物量、總脂肪酸含量及DHA含量增幅減小,108 h開始以15 ℃發(fā)酵,生物量有略微下降,可能是由于細(xì)胞停止生長(zhǎng),小部分菌體開始裂解。120 h時(shí)油脂含量有所降低,從108 h的55.15 g/L減少到了53.63 g/L,說明低溫減少總脂肪酸占比；而120 h比108 h的DHA產(chǎn)量略有增加(從26.99 g/L增加到27.17 g/L),這主要由于DHA占總脂肪酸的含量還在上升,從48.62%上升到了50.66%。

來源于Schizochytrium和Aurantiochytrium的高產(chǎn)DHA的菌株,DHA含量均可達(dá)40%以上[4]。采用分批補(bǔ)料的高密度培養(yǎng)模式,可以最大程度的得到高的生物量、油脂含量及DHA產(chǎn)量。CHANG等[18]研究了溶氧對(duì)高密度培養(yǎng)Schizochytriumsp.S31產(chǎn)DHA的影響,優(yōu)化發(fā)酵工藝后DHA產(chǎn)量達(dá)21.26 g/L,占總脂肪酸的33.94%；LI等[19]優(yōu)化了碳源使用策略,AurantiochytriumlimacinumSR21發(fā)酵得到32.36 g/L,占總脂肪酸的43.70%。這兩項(xiàng)研究獲得的DHA產(chǎn)量均處于較高水平,但DHA占總脂肪酸含量的比例偏低,說明還有一定的提升空間。YIN等[9]采取分階段控制pH策略,優(yōu)化了發(fā)酵中細(xì)胞生長(zhǎng)與DHA合成的平衡關(guān)系,最終,生物量、油脂含量及DHA占總脂肪酸含量均得到提高。本研究借鑒此策略,經(jīng)三階段控溫,提高了DHA的品質(zhì)及產(chǎn)量,最終DHA產(chǎn)量達(dá)27.17 g/L(表3),處于國(guó)內(nèi)外較先進(jìn)的發(fā)酵水平。

表3 部分高產(chǎn)DHA菌株的發(fā)酵水平Table 3 Some stains of high DHA productivity for fermentation

3 結(jié)論與討論

本研究探索了不同溫度對(duì)破囊壺菌Aurantiochytriumsp.FN21的生物量,總脂肪酸產(chǎn)量及DHA產(chǎn)量的影響。我們發(fā)現(xiàn),低溫利于DHA積累但不利于細(xì)胞生長(zhǎng),高溫利于細(xì)胞生長(zhǎng)但不利于DHA合成?；趽u瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果,提出了三階段控溫策略,在發(fā)酵前期(0～84 h),采用最利于細(xì)胞生長(zhǎng)及產(chǎn)油的溫度(28 ℃)培養(yǎng)；至發(fā)酵中后期(84～108 h),采取較有利于細(xì)胞生長(zhǎng)、產(chǎn)油及DHA積累的溫度(25 ℃)培養(yǎng)；最后發(fā)酵階段(108～120 h),不考慮生物量及油脂含量的積累,采取更低溫度(15 ℃)進(jìn)一步脅迫破囊壺菌積累DHA,最終在15 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)獲得27.17 g/L的DHA,且DHA占總脂肪酸比例較高(50.66%)。本研究為破囊壺菌工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)DHA提供了借鑒。