王國棟，張 星，李 恒，李洪姝，婁方亮

（1. 云南云天化股份有限公司研發(fā)中心，云南昆明 650228；2. 云南云天化股份有限公司，云南昆明 650228）

越來越多的農(nóng)業(yè)應(yīng)用證明，微生物能夠有效改良土壤，抑制土傳病害，提高肥料利用率，改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)［1］。微生物在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)種植中的應(yīng)用是農(nóng)業(yè)種植的發(fā)展趨勢。目前無機(jī)肥料市場競爭激烈，對無機(jī)肥料的增效、改性和升級換代要求十分迫切。

芽孢桿菌是一類好氧或兼性厭氧、桿狀革蘭氏陽性細(xì)菌。芽孢桿菌易于從土壤和植株中分離獲得，具有抗逆性強(qiáng)、營養(yǎng)要求簡單、繁殖速度快且穩(wěn)定性強(qiáng)等生物特性。一些芽孢桿菌因能夠降解土壤中難溶的含磷、含鉀等化合物，可促進(jìn)農(nóng)作物生長，并且具有提高農(nóng)作物抗性以防治病蟲害、改良土壤等作用，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛［2-3］。常用的芽孢桿菌包括枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌及多粘芽孢桿菌等［4］。

在國內(nèi)市場上，大部分生物肥料是微生物肥、生物有機(jī)肥，都是以一定有機(jī)質(zhì)為載體的生物肥料［5］。筆者研究將復(fù)合芽孢桿菌包裹在無機(jī)肥料（尿素、磷酸二銨（DAP）、復(fù)合肥料）顆粒表面，形成菌膜，制備微生物菌劑包膜無機(jī)肥料。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試驗(yàn)原料和設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)原料

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（液體）：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL混合，調(diào)節(jié)pH為7.2。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（固體）：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂粉15 g、蒸餾水1 000 mL混合，調(diào)節(jié)pH為7.2。

枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短小芽孢桿菌；小顆粒尿素、64%磷酸二銨（DAP）、碳酸鈣粉、復(fù)合肥料（18-18-18、17-17-17、17-15-15）。

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)備

噴槍，空壓機(jī)，圓盤造粒機(jī)，電熱鼓風(fēng)設(shè)備，超凈工作臺，滅菌鍋，生化培養(yǎng)箱，搖床，培養(yǎng)皿，移液槍，涂布棒。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 復(fù)合菌劑制備

首先用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（固體）分別對枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短小芽孢桿菌進(jìn)行活化，37 ℃培養(yǎng)24 h；然后將活化好的4 種菌株分別接入裝有50 mL 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（液體）的錐形瓶中，在37 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，取出作為種子液。

將4種菌株種子液分別進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵，發(fā)酵終點(diǎn)通過鏡檢觀察微生物菌體的形態(tài)、密度以及芽孢形成率最終確定，一般芽孢形成率≥95%時即可界定發(fā)酵完成，然后導(dǎo)入發(fā)酵液儲罐備用。發(fā)酵好的4種菌液按照質(zhì)量比1∶1∶1∶1進(jìn)行混合，攪拌均勻，完成復(fù)合菌劑的制備，1 mL 菌液中總菌落數(shù)≥4×109CFU。

1.2.2 菌液包裹

把無機(jī)肥料40 kg加入圓盤造粒機(jī)中，采用電熱鼓風(fēng)設(shè)備將無機(jī)肥料加熱到50 ℃，然后將復(fù)合菌劑攪拌均勻，裝入帶容器的噴槍內(nèi)，通過壓縮空氣使菌液霧化，噴涂到肥料顆粒表面，形成一層微生物菌膜。為了防止無機(jī)肥料水分過多導(dǎo)致結(jié)塊，加入碳酸鈣粉并混合10 ～15 min，讓復(fù)合菌劑、碳酸鈣粉均勻包裹在無機(jī)肥料顆粒表面。其工藝流程見圖1。

圖1 工藝流程

根據(jù)無機(jī)肥料產(chǎn)品質(zhì)量對水含量的要求，選擇復(fù)合菌劑的添加量為0.1%～0.8%、碳酸鈣粉添加量為0.2% ～1.0%，進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，最后得出最優(yōu)包裹條件，即復(fù)合菌劑添加量為0.2%，碳酸鈣粉添加量為0.4%。

2 結(jié)果與討論

根據(jù)NY/T 2321—2013《微生物肥料產(chǎn)品檢驗(yàn)規(guī)程》，對小顆粒尿素，64%磷酸二銨，18-18-18、17-17-17、17-15-15復(fù)合肥料包裹復(fù)合菌劑后，所制備微生物菌劑包膜無機(jī)肥料中所含的有效活菌數(shù)進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖2。

圖2 不同肥料包裹復(fù)合菌劑后有效活菌數(shù)

由圖2可知，尿素、磷酸二銨和復(fù)合肥料包裹復(fù)合菌劑后，肥料中4 種微生物的菌落數(shù)量不相同，3個配方復(fù)合肥和尿素2中微生物菌落總數(shù)大于1×106CFU/g，磷酸二銨和尿素1中菌數(shù)總數(shù)小于1×106CFU/g。復(fù)合肥料和尿素中地衣芽孢桿菌數(shù)量占優(yōu)，磷酸二銨中解淀粉芽孢桿菌數(shù)量占優(yōu)，說明這兩種菌株的耐鹽性和生物活性相對其余兩種菌株較好。尿素、磷酸二銨和復(fù)合肥料的鹽度不相同，導(dǎo)致包裹在肥料上的微生物存活率不一致，微生物菌落數(shù)差異較大。

所制備微生物菌劑包膜無機(jī)肥料中微生物存活周期見圖3。從圖3 可以看出，包裹微生物菌劑的復(fù)合肥料存放170 d 后，有效菌落數(shù)仍然維持1×106CFU/g 以上；包裹微生物菌劑的尿素和磷酸二銨存放170 d后，有效菌落數(shù)有所下降。

圖3 微生物菌劑包膜無機(jī)肥料中微生物存活周期

圖4是包菌磷酸二銨水溶液經(jīng)過牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（固體）培養(yǎng)后，固體培養(yǎng)基上微生物的菌落形態(tài)。4種菌株的菌落數(shù)量及菌落形態(tài)不完全一樣。

圖4 苞菌磷酸二銨水溶液培養(yǎng)后固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)

3 農(nóng)化效果

將微生物菌劑包膜無機(jī)肥料在馬鈴薯、生菜、甘藍(lán)上進(jìn)行農(nóng)化試驗(yàn)，驗(yàn)證微生物菌劑包膜無機(jī)肥料相比同等養(yǎng)分無機(jī)肥料的肥效。按照每個重復(fù)面積為20 m2，每個處理3個重復(fù)，每667 m2施肥量為40 kg設(shè)置試驗(yàn)。

（1）在馬鈴薯上施用微生物菌劑包膜17-17-17和17-15-15 復(fù)合肥料，折算每667 m2分別比常規(guī)馬鈴薯專用肥15-10-20增產(chǎn)21.0%和43.4%。比較合格種球與小種球的收獲比例，常規(guī)馬鈴薯專用肥施用區(qū)域的馬鈴薯小種球比例為23.04%，而微生物菌劑包膜17-17-17和17-15-15復(fù)合肥料施用區(qū)域馬鈴薯小種球比例僅為16.00%和17.70%，種球合格率升高。說明2種微生物菌劑包膜復(fù)合肥料在馬鈴薯種薯種植中能夠在提高產(chǎn)量的同時明顯增加種球的尺寸。

（2）在生菜上施用微生物菌劑包膜18-18-18復(fù)合肥料，生菜蛋白質(zhì)、總糖的含量比常規(guī)對照明顯增加，w（蛋白質(zhì)）增幅達(dá)44%～56%，w（總糖）增幅達(dá)102%～130%，增幅隨著微生物菌劑包膜復(fù)合肥料用量增加而呈擴(kuò)大的趨勢。微生物菌劑包膜復(fù)合肥料處理，生菜葉綠素含量比常規(guī)對照明顯增加。

（3）在甘藍(lán)上施用微生物菌劑包膜18-18-18復(fù)合肥料，并對各處理結(jié)球甘藍(lán)產(chǎn)量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，處理3（90%用量）比對照每公頃增產(chǎn)1.56 t，增產(chǎn)比例為2.94%；小區(qū)商品菜頭數(shù)比對照增加2 個，增加比例為2.47%。通過投入產(chǎn)出比分析，處理2（100%用量）和處理3（90%用量）凈收入比對照分別增加30.52%和43.99%，產(chǎn)投比分別達(dá)到2.32及3.56。說明該產(chǎn)品能夠較為顯著地提高農(nóng)戶的綜合收益。

4 結(jié)語

（1）微生物菌劑包膜復(fù)合肥料總菌落數(shù)都能達(dá)到1×106CFU/g，微生物菌劑包膜磷酸二銨總菌落數(shù)小于1×106CFU/g。

（2）微生物菌劑包膜磷酸二銨和包膜尿素放置170 d 后總有效活菌數(shù)均小于1×106CFU/g；微生物菌劑包膜復(fù)合肥料放置170 d后總有效活菌數(shù)均大于1×106CFU/g。

（3）微生物菌劑包膜復(fù)合肥料能夠顯著增加農(nóng)作物的產(chǎn)量，可以促進(jìn)植株的生長及根系發(fā)育、生物量的累積，顯著改善農(nóng)作物的品質(zhì)。且微生物的加入，能夠改善土壤微生物種群，協(xié)同根際微生物和農(nóng)作物互作，提升土壤肥力和有益微生物數(shù)量。

（4）微生物菌劑包膜無機(jī)肥料，是無機(jī)肥料和微生物結(jié)合的新產(chǎn)品，增加的原料成本為70 元/t，售價(jià)較無機(jī)肥料增加200元/t，可實(shí)現(xiàn)毛利130元/t，同時極大地提升了無機(jī)肥料品質(zhì)及功能，值得進(jìn)一步推廣。

（5）目前該包膜工藝能夠滿足尿素、磷酸二銨和復(fù)合肥料的產(chǎn)品質(zhì)量要求，但是有效活菌數(shù)還有待提升。下一步工作需要改進(jìn)微生物菌劑的活性和耐鹽性，使其貨架期延長，以利于保證產(chǎn)品質(zhì)量和市場銷售。