徐啟麗，鄒常超，莫麗莉，周海燕,劉興德,

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease，CHD),簡稱冠心病，是危害人類健康、造成中國人疾病負(fù)擔(dān)的主要疾病之一，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1-2]。隨著再灌注治療的不斷發(fā)展，CHD患者的病死率下降，遠(yuǎn)期預(yù)后得到明顯改善，然而心肌再灌注引起的心律失常、無復(fù)流、心肌細(xì)胞凋亡等，對患者的預(yù)后有著深遠(yuǎn)的影響。臨床研究表明[3-5]，銀丹心腦通可以降低冠心病患者心絞痛發(fā)作頻率、心絞痛持續(xù)時(shí)間，改善慢性心力衰竭患者心功能，降低心血管事件發(fā)生率。然而目前對該藥治療心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)8的藥理機(jī)制研究較少，該研究旨在利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討該作用機(jī)制，為銀丹心腦通軟膠囊(Yindan Xinnaotong soft capsules，YD)應(yīng)用于臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)檢索下列數(shù)據(jù)庫：TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，中國知網(wǎng)(http://search.chkd.cnki.net)，SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http://www. swisstargetprediction.ch/)，Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)，GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)，STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/)；使用下列軟件：Cytoscape3.7.2軟件，R3.6.0軟件，微生信在線作圖軟件(http://www.bioinformatics.com.cn/)，Autodock 2.5.0，Autodock vina 1.1.2，Pymol開源版等。

1.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)人心肌AC-16細(xì)胞株購自美國模式培養(yǎng)物研究所(ATCC)。胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液、DMEM-basic(1×)培養(yǎng)液、胰蛋白酶(美國Gibco公司)；銀丹心腦通軟膠囊(貴州百靈企業(yè)集團(tuán)制藥股份有限公司)；DMSO(美國Sigma公司)；細(xì)胞增殖與毒性檢測試劑盒CCK-8(日本同仁化學(xué)研究所)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；蛋白印跡相關(guān)試劑均購自北京索萊寶科技有限公司；抗體：AKT1、p-AKT1、p-STAT3多克隆抗體(美國CST公司),PI3K(美國abcam公司),STAT3多克隆抗體(沈陽萬類生物科技有限公司),GAPDH多克隆抗體、二抗山羊抗兔二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.3.1.1化學(xué)成分的收集 在CNKI數(shù)據(jù)庫上對YD的藥物組成及相關(guān)活性物質(zhì)進(jìn)行搜集，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行ADME參數(shù)設(shè)置(OB≥30%且 DL≥0.18 )，篩選出符合條件的活性物質(zhì)作為活性成分。

1.3.1.2靶點(diǎn)的預(yù)測篩選及中藥活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選得到的活性成分導(dǎo)入Swiss Target Prediction，物種選擇為“人類”(Homo sapiens)，進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測。利用 UniProt 數(shù)據(jù)庫對靶點(diǎn)處理，得到靶基因的標(biāo)準(zhǔn)名稱。利用GeneCards數(shù)據(jù)庫對“心肌缺血再灌注損傷”(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)進(jìn)行疾病靶點(diǎn)篩選。然后，將得到的藥物活性成分相關(guān)靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，重合的靶點(diǎn)即為YD活性成分作用于MIRI的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3.1.3靶點(diǎn)蛋白相互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 利用STRING在線數(shù)據(jù)庫對靶點(diǎn)的蛋白間相互作用(protein protein interaction,PPI)進(jìn)行分析。將靶點(diǎn)信息導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，物種選擇“Homo sapiens”，將蛋白互作綜合得分>0.7 作為篩選條件從而得到靶點(diǎn)的PPI信息，將得到的PPI信息導(dǎo)入 Cytoscape 軟件，得到 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖可視化。

1.3.1.4靶點(diǎn)基因本體論(gene ontology,GO)和KEGG通路富集分析 Metascape數(shù)據(jù)庫中提交交集靶集點(diǎn)，進(jìn)行GO和KEGG富集分析。

1.3.1.5分子對接驗(yàn)證 從Pubchem下載活性成分結(jié)構(gòu)式，保存為*mol2格式，利用pymol轉(zhuǎn)換為*pdb格式；從PDB數(shù)據(jù)庫下載蛋白3D結(jié)構(gòu)*pdb格式。利用Auto dock進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷等處理，保存為pdbqt文件，并用Autodock Vina進(jìn)行小分子與蛋白對接，將對接結(jié)果導(dǎo)入Pymol進(jìn)行分子對接做圖。

1.3.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 取對數(shù)期生長良好的AC-16細(xì)胞，種植在加有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液的DMEM中,于37 ℃、提供5% CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2.2低氧/復(fù)氧模型構(gòu)建 收集對數(shù)期生長良好的AC-16細(xì)胞種植在培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2、95%的新鮮空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁后將進(jìn)行低氧處理的AC-16細(xì)胞更換為不含有胎牛血清的培養(yǎng)液。按預(yù)定分組進(jìn)行加藥，需進(jìn)行低氧處理的AC-16細(xì)胞于含有1% O2、94% N2、5% CO2缺氧培養(yǎng)箱中孵育24 h后，將細(xì)胞放置在37 ℃，含有5% CO2、95%新鮮空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。進(jìn)行下一步檢測。

1.3.2.3CCK-8比色法檢測細(xì)胞活力 收集AC-16細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/ml，按每孔100 μl細(xì)胞懸液接接種到96孔板中，培養(yǎng)過夜。按照不同濃度的YD進(jìn)行分組：0、50、200、400 mg/L，復(fù)孔5個/組，每組均設(shè)置不加細(xì)胞的空白組進(jìn)行對照，以消除藥物本身的顏色對吸光度的影響。加藥后按照1.3.2.2中方法進(jìn)行缺氧，待細(xì)胞復(fù)氧結(jié)束后，在每孔中加入10 μl CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測OD值。細(xì)胞活力=[(實(shí)驗(yàn)孔-空白孔)]/[(對照孔-空白孔)]。選取細(xì)胞活力最強(qiáng)的藥物濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2.4乳酸脫氫酶(LDH)滲漏檢測 將細(xì)胞分成低氧/復(fù)氧組(H/R組)、低氧/復(fù)氧+銀丹心腦通組(H/R+YD組)，細(xì)胞復(fù)氧結(jié)束后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清液，按照試劑盒中檢測步驟，進(jìn)行LDH滲漏檢測。

1.3.2.5Western blot檢測蛋白表達(dá) 將AC-16細(xì)胞分成對照組(Control組)、銀丹心腦通組(YD組)、H/R組、H/R+YD組。低氧復(fù)氧處理結(jié)束后，吸去培養(yǎng)液，裂解液充分裂解后，轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中，4 ℃離心，14 000 r/min，20 min。將蛋白上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，BCA法檢測蛋白濃度。按比例加入5×Loading buffer，100 ℃煮沸10 min。每孔取40 μg蛋白進(jìn)行聚丙烯胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂牛奶封閉1 h，一抗孵育過夜，次日二抗孵育1 h，Bio-Rad成像儀顯影成像，Image Lab軟件進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 YD的活性成分篩選利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫對YD所含成分進(jìn)行檢索。其中，山楂、艾片未檢索到相關(guān)結(jié)果，大蒜未篩選到符合ADME參數(shù)的成分，通過文獻(xiàn)檢索獲取這3味藥的有效成分，并將其納入統(tǒng)計(jì)；根據(jù)ADME參數(shù)對余下的6味藥物進(jìn)行篩選。去重后共得到Y(jié)D 105個活性成分，其中銀杏20個，丹參48個，絞股藍(lán)10個，細(xì)辛11個，三七8個，大蒜4個；山楂5個，艾片4個。見表1。

表1 藥物-成分-靶點(diǎn)統(tǒng)計(jì)

2.2 潛在靶點(diǎn)的預(yù)測取每個活性成分在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中得到的預(yù)測靶點(diǎn)的前15名，去重后共得到藥物靶點(diǎn)382個。從GeneCards數(shù)據(jù)庫中得到“MIRI”疾病靶點(diǎn)1 223個，藥物-疾病共同靶點(diǎn)160個。見圖1。其中包括TNF、MAKP、IL-2、IL-6、MMP、PPAR、PIK3等。

圖1 YD與MIRI靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析利用Cytoscape軟件構(gòu)建YD藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)含有485個節(jié)點(diǎn)，1 822個化合物-靶標(biāo)關(guān)系。其中有95個化合物可同15個及以上的靶點(diǎn)相互連接，推測這些化合物可能是YD的主要活性成分藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，其中排名前30的活性成分。見表2。有46個靶蛋白可同10個及以上的活性成分產(chǎn)生相互作用。見表3。

表2 度值(degree)排名前30的活性化合物

表3 能與10個及以上的活性成分相關(guān)聯(lián)的基因

2.4 YD治療MIRI的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過在STRING數(shù)據(jù)庫中錄入藥物-疾病共同靶點(diǎn)，選擇綜合得分大于0.7的靶點(diǎn)，并去掉獨(dú)立于網(wǎng)絡(luò)外的靶點(diǎn)，得到的PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系數(shù)據(jù)導(dǎo)Cytoscape軟件進(jìn)行可視化分析，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。見圖2。在該網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖中，包含139個節(jié)點(diǎn)和725個關(guān)系，大于平均度值8的靶點(diǎn)共70個，其中包括AKT1、HSP90、MAPK8、BCL2-L1、IL2等。根據(jù)度值(degree)、中介中心性(betweenness)、接近中心性(closeness)分別篩選出前10名的基因，去重后得到13個關(guān)鍵靶點(diǎn)，分別是AKT1、STAT3、VEGFA、TNF、MAPK8、PIK3CA、F2、PPARA、APP、PTGS2、SRC、ESR1、HSP90AA1。推測YD可能通過這些靶點(diǎn)發(fā)揮抗MIRI作用。見表4。

圖2 YD治療MIRI的PPI網(wǎng)絡(luò)

表4 PPI網(wǎng)絡(luò)中Top的靶點(diǎn)

2.5 靶點(diǎn)通路富集分析將160個共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行GO分析，設(shè)置Pvalue≤0.01,得到的分析結(jié)果，分別取前10名導(dǎo)入微生信在線作圖軟件繪制富集分析圖。KEGG分析主要與TRP通道的炎性介質(zhì)調(diào)節(jié)、脂肪細(xì)胞脂解調(diào)節(jié)、PPAR信號通路、流體剪應(yīng)力與動脈粥樣硬化、血小板活化、鈣信號通路等相關(guān)。生物過程(biological process,BP)主要與細(xì)胞對氮化合物的反應(yīng)、肌肉細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、脂溶反應(yīng)等密切相關(guān)。細(xì)胞組成(cellular component,CC)主要涉及膜筏、細(xì)胞器外膜、內(nèi)體管腔、膜的外在成分、血小板α顆粒、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物、溶酶體管腔、受體復(fù)合物等。分子功能(molecular function,MF)主要富集為生長因子受體結(jié)合、肽結(jié)合、激素受體結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、內(nèi)肽酶活性、蛋白磷酸酶結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性、胰島素受體底物結(jié)合、氧化還原酶活性結(jié)合等。見圖3、4。

圖3 GO生物學(xué)過程分析、細(xì)胞組分分析、生物功能分析

圖4 KEGG富集分析

2.6 核心成分的分子對接驗(yàn)證將YD度值排名前3的化合物與PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前6的靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。通常認(rèn)為結(jié)合能<-5 kcal/mol提示兩者可以結(jié)合，<-7 kcal/mol提示兩者有較好的結(jié)合能力。結(jié)果顯示，AKT1、STAT3、VEGFA、APP、MAPK8、PIK3CA均能與槲皮素、木犀草素、山柰酚結(jié)合。其中VEGFA、APP、PIK3CA能與主要成分較好的結(jié)合。見表5和圖5。

圖5 分子對接圖A-D：STAT3和木犀草素對接模式；E：VEGFA和木犀草素對接模式；F：PIK3CA和山萘酚對接模式

表5 蛋白與小分子結(jié)合能(kcal/mol)

2.7 YD對H/R損傷誘導(dǎo)的AC-16細(xì)胞活力的影響通過CCK-8比色法分析在H/R損傷誘導(dǎo)下，暴露于不同濃度YD的AC-16細(xì)胞系的細(xì)胞活力。結(jié)果表明，200 mg/L的劑量可增加H/R損傷誘導(dǎo)的AC-16細(xì)胞的細(xì)胞活力(P<0.000 1),見圖6A。 因此，將增加AC-16細(xì)胞活力的200 mg/L YD用于以下實(shí)驗(yàn)。

2.8 YD對H/R損傷誘導(dǎo)的AC-16細(xì)胞的LDH滲漏的影響檢測LDH含量以評估細(xì)胞膜的完整性。結(jié)果表明，200 mg/L的YD能減少H/R損傷誘導(dǎo)的AC-16細(xì)胞的LDH滲漏，P<0.05。見圖6B。

圖6 YD對H/R損傷誘導(dǎo)的AC-16細(xì)胞活力、LDH滲漏的影響A:不同濃度YD對H/R損傷誘導(dǎo)的AC-16細(xì)胞的活力的影響；B:200 mg/L的YD對H/R損傷誘導(dǎo)的AC-16細(xì)胞LDH滲漏的影響；3：H/R組；4：H/R+YD組；與0 mg/L組比較：&P<0.05；與50 mg/L組比較：ΔP<0.05；與3組相比：#P<0.05

2.9 YD對H/R損傷誘導(dǎo)的AC-16細(xì)胞增殖的影響光鏡觀察YD對H/R損傷的AC-16細(xì)胞的增殖情況的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，H/R損傷明顯抑制細(xì)胞增殖，200 mg/L的YD可減輕這一現(xiàn)象。見圖7。

圖7 YD對H/R損傷誘導(dǎo)的AC-16細(xì)胞增殖的影響 ×100A:Control組；B:YD組；C:H/R組；D:H/R+YD組

2.10 YD對AC-16細(xì)胞STAT3、p-STAT3、PI3K、AKT1、p-AKT1蛋白表達(dá)的影響結(jié)果顯示，在無H/R誘導(dǎo)情況下，加藥組STAT3表達(dá)較未加藥組降低；H/R誘導(dǎo)后，H/R損傷可導(dǎo)致STAT3水平降低，加藥組與未加藥組未見明顯差異，見圖8B。在無H/R誘導(dǎo)的情況下，加藥組對STAT3磷酸化水平無明顯影響，H/R損傷可以刺激STAT3磷酸化，在H/R誘導(dǎo)情況下，YD可以促進(jìn)STAT3磷酸化水平,見圖8C。在無H/R損傷誘導(dǎo)情況下，加藥組與未加藥組未見明顯差異；H/R誘導(dǎo)可抑制Akt1磷酸化水平，200 mg/L YD能逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，促進(jìn)p-Akt1表達(dá),見圖8D。在無H/R誘導(dǎo)情況下，加藥組PI3K表達(dá)增加；H/R誘導(dǎo)后，加藥組PI3K表達(dá)明顯降低；200 mg/L YD能逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，促進(jìn)PI3K表達(dá),見圖8E。

圖8 YD對AC-16細(xì)胞STAT3、p-STAT3、PI3K、Akt1、p-Akt1蛋白表達(dá)的影響A:Western blot檢測各組細(xì)胞蛋白表達(dá)水平；B:STAT3蛋白表達(dá)水平；C:p-STAT3蛋白表達(dá)水平；D:PI3K蛋白表達(dá)水平；E:p-Akt1蛋白表達(dá)水平；1:control組；2:YD組；3：H/R組；4：H/R+YD組；與Control組比較：*P<0.05；與H/R組比較：#P<0.05

3 討論

MIRI是CHD病理生理過程中加重心肌組織進(jìn)一步損傷的重要機(jī)制。再灌注期間，大量氧自由基生成引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，白細(xì)胞激活，釋放大量促炎因子，導(dǎo)致心肌缺血缺氧損傷進(jìn)一步加重。YD應(yīng)用于臨床多年，療效安全確定，然而目前對該藥的藥理作用研究報(bào)告甚少，為了探究YD治療MIRI的藥理機(jī)制，該研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)檢索對其主要活性成分篩選，匹配出對應(yīng)基因，再與疾病基因映射，最終得到該藥物作用于MIRI的關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路。

雖然在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中沒有篩選出大蒜和艾片的活性成分，但大量文獻(xiàn)資料報(bào)道了大蒜及艾片治療心血管疾病藥效明確。艾片具有抗炎、抗氧化作用[6]，藥理學(xué)研究表明，艾片對改善大鼠急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)藥效明顯優(yōu)于天然冰片和合成冰片，且無明顯量效關(guān)系[7]。大蒜辣素能抑制心肌梗死后大鼠的心肌纖維化[8],大蒜素可以抑制自噬，減輕心肌肥大，抑制心室重塑[9]；蒜氨酸具有調(diào)節(jié)血脂和抗氧化的作用[10]。因此該研究增加了艾片中的4種活性成分以及大蒜中的大蒜素、大蒜精油、蒜氨酸和大蒜辣素。而在藥物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中也證實(shí)艾片中的α-蒎烯和左旋龍腦與核心靶點(diǎn)中的細(xì)胞色素P450c17α(CYP17A1)相互映射。

對PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選得到的重要靶標(biāo)進(jìn)行分析。其中度值位居第一的Akt1是影響心肌細(xì)胞活性與功能的主要決定因素之一，激活A(yù)kt1可以調(diào)控下游的因子影響細(xì)胞的增殖、凋亡、自噬等過程[11]；傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)在多種心血管疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。研究[12]表明，激活STAT3可降低心肌梗塞大鼠模型的梗塞面積。該研究中表明，YD能減輕H/R誘導(dǎo)的AC-16心肌細(xì)胞損傷，增加細(xì)胞活力，減少LDH滲漏。其機(jī)制與PI3K-AKT1和STAT3信號通路有關(guān)。

對160個共同靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析顯示，YD主要通過流體剪應(yīng)力與動脈粥樣硬化、TRP通道的炎性介質(zhì)調(diào)節(jié)、脂肪細(xì)胞脂解調(diào)節(jié)、血小板活化、鈣信號通路、PPAR受體信號通路發(fā)揮抗MIRI的作用。流體剪應(yīng)力能與TNF-α協(xié)同作用，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞自噬，加速內(nèi)皮細(xì)胞的脫落[13]，加快AS的進(jìn)程。鈣信號通路參與心肌細(xì)胞的增殖、凋亡過程,調(diào)節(jié)鈣信號通能減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載，保護(hù)心肌缺血再灌注損傷[14]。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)參與脂質(zhì)氧化和細(xì)胞增殖過程，激動PPAR信號通路能使caspase蛋白表達(dá)下調(diào),保護(hù)心肌細(xì)胞[15]。

綜上所述，YD治療MIRI是多成分-多靶點(diǎn)-多通路協(xié)同作用的結(jié)果。該研究從多個角度對其潛在作用靶點(diǎn)及分子機(jī)制進(jìn)行預(yù)測，并從細(xì)胞水平、蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供新的探索思路，也為該藥物應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。