傅詠梅，黃后楷，張文芳，高永堅，劉勇，梁鳳友

（國藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 佛山 528305）

金錢草是報春花科植物過路黃Lysimachia christinaeHance的干燥全草，味甘、咸，微寒，歸肝、膽、腎、膀胱經(jīng)，具利濕退黃、利尿通淋、解毒消腫之功，用于濕熱黃疸、膽脹脅痛、石淋、熱淋、小便澀痛等[1]。研究表明，金錢草的化學(xué)成分主要是黃酮和多糖類化合物，其中以槲皮素、山柰素的黃酮苷及苷元為主的成分[2?6]，具有利尿排石、抗氧化、降低血尿酸水平等廣泛的藥理作用[7?9]。

飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)、臨床應(yīng)用為基礎(chǔ)，參考現(xiàn)代提取方法，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備而成的單味中藥飲片水煎劑。中藥配方顆粒的各項指標(biāo)及生產(chǎn)過程必須與標(biāo)準(zhǔn)湯劑確定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相吻合。關(guān)于金錢草的基源研究，郭林林等[10]建立了金錢草藥材的HPLC指紋圖譜，以蘆丁為參照峰，確立了金錢草藥材指紋圖譜中的13個共有峰；方國花[11]建立了正品金錢草藥材HPLC?MS指紋圖譜，確定了10個共有峰，并確認(rèn)出其中3個共有峰的結(jié)構(gòu)。金錢草與廣金錢草的鑒別手段主要有基原鑒別、性狀鑒別和顯微鑒別[12?13]。林碧珊等[14]使用廣金錢草標(biāo)準(zhǔn)湯劑建立的UPLC特征圖譜，標(biāo)定并指認(rèn)夏佛塔苷、異葒草苷、異夏佛塔苷和異牡荊苷4個化合物用于鑒別金錢草與廣金錢草。本研究采用UPLC法建立金錢草標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜，標(biāo)定并指認(rèn)了山柰酚?3?（2，6?二吡喃鼠李糖基吡喃葡萄糖苷）、山柰酚?3?O?蕓香糖苷、槲皮素、山柰素4個化合物用于鑒別金錢草與廣金錢草，為全面評價金錢草的質(zhì)量及其基原鑒別提供了科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

H?class UPLC高效液相色譜儀（美國Waters公司，PDA二極管陣列檢測器）；MS105DU十萬分之一天平（瑞士梅特勒?托利多公司）；AL104萬分之一天平（瑞士梅特勒?托利多公司）；KQ?500DE超聲清洗機(jī)（昆山超聲儀器有限公司）；HH?4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）；MⅠLLⅠPORE Synergy UV超純水儀（默克公司）。

1.2 試藥

山柰酚?3?O?蕓香糖苷對照品（批號：112007?201602）、槲皮素對照品（批號：100081?201610）、山柰素對照品（批號：110861?201611）、金錢草對照藥材（批號：121187?201403）由中國食品藥品檢定研究院提供；山柰酚?3?（2，6?二吡喃鼠李糖基吡喃葡萄糖苷）（批號：M06J9S65081，上海源葉生物有限公司）；甲醇、磷酸均為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 樣品

19批金錢草藥材分別從四川、重慶等不同產(chǎn)地購得，經(jīng)國藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司質(zhì)檢部黃國滿助理工程師按照2020年版《中國藥典》金錢草藥材檢驗均符合規(guī)定。藥材及相關(guān)樣品具體信息見表1。

表1 19批金錢草藥材來源信息Table 1 Ⅰnformation of 19 batches of Lysimachiae Herba

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

取金錢草飲片150 g，置5 L電控溫煎藥壺中，加水煎煮2次，第1次煎煮加12倍量水，浸泡30 min后，先武火煮沸后再文火保持微沸煎煮30 min，用350目篩網(wǎng)趁熱過濾，濾液迅速用冷水冷卻；第2次煎煮加10倍量水，先武火煮沸后再文火保持微沸煎煮25 min，用350目篩網(wǎng)趁熱過濾，濾液迅速冷水冷卻，合并2次濾液。將合并后的濾液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮（水浴溫度：65℃，真空度：-0.1 MPa），濃縮至約150 g左右，測定含固率，按比例加入純化水至清膏含固率為15%左右，分裝至10 mL西林瓶中，每瓶分裝體積為2.5 mL，分裝完畢后轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥機(jī)中凍干，取出，軋鋁蓋，即得。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性

色譜柱為CORTECS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.6μm）；乙腈為流動相A，0.2%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫（0~15 min，12%→15%A；15~30 min，15%→35%A；30.1~35 min，12%A）；柱溫為30℃；流速為0.20 mL/min；檢測波長為364 nm；進(jìn)樣量1μL；理論塔板數(shù)按槲皮素峰計算應(yīng)不低于10 000。

2.3 參照物溶液的制備

取山柰酚?3?O?蕓香糖苷對照品、槲皮素對照品和山柰素對照品適量，精密稱定，加80%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇制成每1 mL各含50μg的溶液，即得。取金錢草對照藥材1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理20 min，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 供試品溶液的制備

取本品研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率500 W，頻率40 kHz）處理20 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5 特征圖譜分析方法驗證

2.5.1 精密度試驗 取金錢草標(biāo)準(zhǔn)湯劑（YP18040 10B2）1份，按“2.4”項方法制備供試品溶液，按“2.2”項色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以槲皮素峰為參照峰，計算各峰與參照峰的相對保留時間及相對峰面積。各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 溶液穩(wěn)定性試驗 取金錢草標(biāo)準(zhǔn)湯劑1份，按“2.4”項方法制備供試品溶液，按“2.2”項色譜條件分別在0、2、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣檢測，以槲皮素峰為參照峰，計算各峰與參照峰的相對保留時間及相對峰面積。各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%，表明供試品液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗 取同一批金錢草標(biāo)準(zhǔn)湯劑，分別精密稱取6份，按“2.4”項方法平行制備供試品溶液，按“2.2”項色譜條件進(jìn)行測定，以槲皮素為參照峰，計算各峰與參照峰的相對保留時間及相對峰面積。各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6 特征圖譜的建立與分析

2.6.1 特征峰指認(rèn) 分別吸取“2.3”項對照品溶液和“2.4”項供試品溶液，按“2.2”項色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖1。將供試品色譜峰與對照品色譜峰保留時間進(jìn)行比較，確定供試品圖譜中的3號峰為山柰酚?3?（2，6?二吡喃鼠李糖基吡喃葡萄糖苷），5號峰為山柰酚?3?O?蕓香糖苷，6號峰為槲皮素，7號峰為山柰素。

圖1 對照品與金錢草標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品的圖譜Figure 1 Chromatograms of kaempferol?3?(2,6?dirhamnopy‐ranosyl?glucopyranoside),kaempferol 3?rutinoside,quercetin,kaempferol references and the sample of standard decoction of Lysimachiae Herba

2.6.2 特征圖譜的建立 取S1?S19符合規(guī)定的金錢草、金錢草對照藥材，按“2.1”項方法制備19批金錢草標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品及金錢草對照藥材標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品，按“2.4”項方法制備供試品溶液及金錢草對照藥材溶液，上述溶液按“2.2”項的色譜條件測定，記錄19批金錢草及金錢草對照藥材色譜圖。采用國家藥典委員會推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”對19批金錢草圖譜進(jìn)行分析，選擇7個分離度較好的共有色譜峰為特征峰。通過與金錢草對照藥材色譜圖進(jìn)行對比，確定3號峰為山柰酚?3?（2，6?二吡喃鼠李糖基吡喃葡萄糖苷），5號峰為山柰酚?3?O?蕓香糖苷，6號峰為槲皮素，7號峰為山柰素，結(jié)果見圖2~圖4。

圖2 19批金錢草標(biāo)準(zhǔn)湯劑的UPLC疊加圖譜Figure 2 UPLC chromatograms of 19 batches of standard decoction of Lysimachiae Herba

圖4 19批金錢草標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC對照圖譜Figure 4 UPLC reference chromatogram of 19 batches of standard decoction of Lysimachiae Herba

2.6.3 共有峰相對保留時間和相對峰面積的測定根據(jù)《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）》[11]，以槲皮素峰6為參照峰（S峰），計算各共有峰的相對保留時間和各相對峰面積，結(jié)果見表2~表3。

表2 19批金錢草的相對保留時間Table 2 Relative retention time of 19 batches of Lysimachiae Herba（n=19）

表3 19批金錢草的相對峰面積Table 3 Relative peak area of 19 batches of Lysimachiae Herba(n=19)

2.6.4 不同產(chǎn)地標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜相似度分析 將19批樣品的UPLC特征圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”，以S1圖譜為參照圖譜，時間窗設(shè)置為0.1，進(jìn)行峰匹配，計算得到19批金錢草與對照圖譜之間的相似度，結(jié)果見表4。可見，19批金錢草的相似度均大于0.9，表明不同產(chǎn)地的金錢草藥材具有較高的相似性。

表4 19批金錢草的相似度測定結(jié)果Table 4 Thesimilarity resultsof 19 batchesof Lysimachiae Herba

圖3 金錢草對照藥材UPLC圖譜Figure 3 UPLCchromatogram of the control medicinal mate‐rial of Lysimachiae Herba

2.7 與混淆品特征圖譜的比較

2.7.1 金錢草與小葉金錢草的鑒別比較 小葉金錢草為傘形科植物天胡荽Hydrocotyle sibthorpioidesLam.的干燥全草，已有文獻(xiàn)報道天胡荽中含有槲皮素等成分[9]，臨床使用上與金錢草均有利濕退黃的功效，容易與金錢草藥材混淆。此外，小葉金錢草（批號JQC15~JQC17）依據(jù)2020年版《中國藥典》中金錢草藥材標(biāo)準(zhǔn)檢查均符合規(guī)定，但通過建立金錢草特征圖譜方法可以把二者進(jìn)行區(qū)別。

小葉金錢草的供試品溶液制備：取小葉金錢草按“2.1”項方法制備小葉金錢草標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品，按“2.4”項方法制備供試品溶液。

金錢草與小葉金錢草特征圖譜比較見圖5?？梢?，峰1、3、5、6、7號特征峰為二者共有峰，2號和4號特征峰為金錢草專屬特征峰。因此，金錢草特征圖譜中2號和4號特征峰是區(qū)別金錢草和小葉金錢草相關(guān)特征峰，表明通過本文方法可以進(jìn)行金錢草藥材劣質(zhì)品的鑒定。

圖5 小葉金錢草與金錢草對照藥材UPLC圖譜的對比圖Figure 5 Comparison of UPLC chromatograms of Hydrocotyle sibthorpioides Lam.and the control medicinal material of Lysimachiae Herba

2.7.2 金錢草藥材與廣金錢草藥材的比較 廣金錢草為廣西和廣東地區(qū)習(xí)用金錢草，為豆科山螞蝗屬廣金錢草Desmodium styracifolium（Osb.）Merr.的全草，與金錢草均有利濕退黃、利尿通淋的功效，臨床使用上容易與金錢草藥材混淆[10]。

廣金錢草的供試品溶液制備：取廣金錢草按“2.1”項方法制備廣金錢草標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品，按“2.4”項制備供試品溶液。

金錢草與廣金錢草特征圖譜比較見圖6?？梢姡疱X草中特征峰3、4、5、6（槲皮素）、7（山柰素）均沒有出現(xiàn)在廣金錢草特征圖譜中；而廣金錢草圖譜中的與峰6槲皮素相近的保留時間處的色譜峰通過二極管陣列檢測器對該色譜峰的紫外吸收圖進(jìn)行對比，與槲皮素并不是同一組分。表明采用本文方法可以將金錢草與廣金錢草進(jìn)行區(qū)分。

圖6 金錢草和廣金錢草特征圖譜比較Figure 6 Comparison of chromatograms of Lysimachiae Herba and Desmodium styracifolium（Osb.）Merr.

3 討論

本品采用二極管陣列對供試品溶液在190~400 nm下進(jìn)行檢測，通過移動波長，發(fā)現(xiàn)選取240 nm和310 nm作為檢測波長時，各特征色譜峰響應(yīng)值相差較大且基線不平穩(wěn)；當(dāng)選取364 nm作為檢測波長時，各峰信號響應(yīng)值較平均色譜峰分離度較好，基線相比其他波長平穩(wěn)，參考槲皮素、山柰素的最大吸收波長和香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)金錢草指紋圖譜方法中檢測波長為364 nm，因此選擇364 nm為金錢草特征圖譜檢測波長。

參照香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)中金錢草藥材的指紋圖譜方法和金錢草標(biāo)準(zhǔn)湯劑含量測定方法，確定了金錢草標(biāo)準(zhǔn)湯劑中參照物成分為槲皮素和山柰素。由于金錢草標(biāo)準(zhǔn)湯劑是經(jīng)水提取制備而成，大極性成分理論上應(yīng)是其質(zhì)量控制的重要內(nèi)容。通過研究不同產(chǎn)地金錢草標(biāo)準(zhǔn)湯劑的特征圖譜，甲醇-0.1%磷酸流動相體系色譜峰較密集，容易造成部分特征峰分離度不佳，影響特征峰的定位分析，進(jìn)一步篩選色譜流動相體系，選擇乙腈-0.2%磷酸體系能對金錢草標(biāo)準(zhǔn)湯劑各組分達(dá)到更優(yōu)的分離效果，具有分析時間短、系統(tǒng)壓力較低和峰分離度、純度較好等優(yōu)點。

本研究對19批金錢草標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品進(jìn)行相似度評價計算，結(jié)果表明19批金錢草的相似度均大于0.90，表明不同產(chǎn)地的金錢草藥材具有較高的相似性，產(chǎn)地差異較少。

在中藥材品種的發(fā)展變遷中，不僅存在著多基原品種現(xiàn)象，導(dǎo)致藥材品種混亂、質(zhì)量難以控制，同時也存在著劣質(zhì)品摻雜的現(xiàn)象，不同程度地影響著藥材質(zhì)量的安全性、有效性和可控性；本研究初步建立的方法可應(yīng)用于混淆品廣金錢草和小葉金錢草的鑒別，為金錢草藥材提供更全面的質(zhì)量控制方法。